Provedli jsme prospektivní studii diagnostické přesnosti testu Ultra na tkáni FNA i biopsie lymfatických uzlin jádrovou jehlou u pacientů s podezřením na tuberkulózní adenitidu. Studie byla provedena v Groote Schuur Hospital, terciárním referenčním akademickém centru v Kapském Městě v Jihoafrické republice. Vhodnými účastníky studie byli dospělí (≥ 18 let), hospitalizovaní i ambulantní pacienti, odeslaní se zvětšenými lymfatickými uzlinami o nejširším průměru >20 mm nacházejícími se v krční, axilární nebo tříselné oblasti. Pacienti na léčbě tuberkulózy byli zařazeni za předpokladu, že tato byla podávána po dobu <1 měsíce (dílčí analýzy byly provedeny u pacientů na léčbě tuberkulózy po dobu <24 hodin). Pacienti s kontraindikací biopsie core-needle (nízká hladina trombocytů, jiná koagulopatie a riziko krvácení, klinicky nestabilní, místo biopsie nebezpečné) byli vyloučeni. Od všech účastníků byl získán písemný informovaný souhlas. Studii schválila Etická komise pro lidský výzkum Fakulty zdravotnických věd Univerzity Kapského Města.
Pacienti pocházeli z oblasti Groote Schuur a z nemocnic sekundární úrovně a denních klinik v referenční oblasti. Byly zaznamenány výsledky předchozích vyšetření tuberkulózy (sputum Xpert nebo kultivace tuberkulózy z jakéhokoli pracoviště do 3 měsíců od odeslání nebo lipoarabinomannan (LAM) v moči). Byly zjištěny podrobnosti o stavu HIV, léčbě tuberkulózy a ART.
Sběr dat
Při zařazení do studie byly zaznamenány demografické údaje, příznaky, doba trvání příznaků, výsledek testu na HIV a další provedená vyšetření tuberkulózy. Stav výkonnosti byl hodnocen podle Východoevropské kooperativní skupiny (ECOG) . Bylo zaznamenáno místo biopsie a další místa lymfadenopatie. Přítomnost a trvání konstitučních příznaků (kašel, úbytek hmotnosti, noční pocení) byly zvlášť zjišťovány, stejně jako doba, po kterou pacient lymfadenopatii pozoroval. Byla odebrána krev na vyšetření plného krevního obrazu s diferenciálem, laktátdehydrogenázy a stavu HIV a v případě pozitivity i na stanovení počtu CD4 a virové nálože u osob užívajících ART.
Studijní postupy a odběr vzorků
FNA byla provedena pomocí jehly 22G a injekční stříkačky o objemu 5 ml; další studijní postupy byly určeny objemem získaného vzorku aspirátu, jak je znázorněno na obr. 1.
. Biopsie jádrovou jehlou byla provedena pouze v případě, že < bylo aspirací získáno 0,5 ml kaseózního materiálu, a to z důvodu rizika vzniku drenážní dutiny. Zpočátku, když byla u účastníka provedena FNA i biopsie, byla Ultra provedena pouze na tkáni, ale po 25 pacientech došlo ke změně protokolu a Ultra byla provedena jak na FNA, tak na tkáni u stejného pacienta. Pokud byla u pacienta provedena jak FNA, tak biopsie jádrovou jehlou, byla kultivace TBC provedena pouze na vzorku tkáně. Pro Ultra na FNA byla jehla a stříkačka propláchnuta do sterilní nádoby obsahující 2 ml fyziologického roztoku. Z druhé FNA byl u lůžka pacienta proveden na vzduchu vysušený stěr na AFB. Pro kultivaci z FNA byl aspirát propláchnut směrem do kultivačního média pro mykobakterie (bujónové médium Middlebrook 7H9). Biopsie core-needle byla provedena pomocí automatické bioptické pistole (BARD Magnum™, CR Bard Inc., Covington, GA, USA) s jehlou 14G. Pokud nebyla lymfatická uzlina zjevně hmatná, byla biopsie provedena pod ultrazvukovou kontrolou. Dvě nebo tři jádra byla odeslána ve formalínu na histologii (délka 10-15 mm), další jádro bylo rozříznuto sterilním nožem na dvě části a odesláno na kultivaci a Ultra, obojí ve 2 ml 0,9% fyziologického roztoku. Pokud byla všechna provedená vyšetření neprůkazná, pacient podstoupil opakovanou core-needle biopsii nebo excizní biopsii podle uvážení ošetřujícího lékaře.
Obr. 1
Postupy studie
Laboratorní testy
Vzorky FNA a tkáně byly do 2 hodin od odběru transportovány do centralizované laboratoře a zpracovány jednotlivě podle standardizovaných protokolů vyškoleným laboratorním personálem. Stěr zhotovený u lůžka pacienta byl vyšetřen metodou Ziehl-Neelsen (ZN) na přítomnost AFB. Tkáň získaná core-needle biopsií byla rozdrcena pomocí tloučku a hmoždíře. Malá část byla rozetřena na sklíčko a vyšetřena barvením ZN na AFB. Kultivace mykobakterií byla provedena pomocí automatického systému pro kultivaci tekutých mykobakterií (BACTEC™ MGIT™ 960; Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA). Lymfatické uzliny jsou považovány za sterilní místo a před tekutou biopsií nebyla prováděna dekontaminace. Pokud byl test MGIT pozitivní, byla jedna kapka naočkována na 2% krevní agar a inkubována po dobu 24 hodin, aby se zkontroloval růst bakterií. Pokud nedošlo k růstu bakterií, byl MGIT hlášen jako pozitivní na mykobakterie, vzorek byl dekontaminován hydroxidem sodným (1 %) a N-acety-L-cysteinem a poté byl proveden opakovaný MGIT. Pozitivní izoláty z kultivačních médií byly identifikovány pomocí barvení na kyselinu pevnou s následným testováním MRTBDRplus (Hain LifeScience, Hehren, Německo) k potvrzení přítomnosti M. tuberculosis a citlivosti na rifampicin a isoniazid.
Pro Ultra bylo přidáno 1,4 ml reagencie vzorku k 0,7 ml aspirátu nebo rozdrceného vzorku tkáně. Výsledky byly hlášeny jako: neplatné (nebyla zjištěna žádná vnitřní kontrola testu); nezjištěné; nebo zjištěné (se semikvantitou: stopová, velmi nízká, nízká, střední nebo vysoká) a rezistence k rifampicinu (zjištěná, nezjištěná nebo neurčitá). Pracovníci provádějící vyšetření Ultra byli zaslepeni vůči klinickým a jiným mikrobiologickým výsledkům.
Histologické vyšetření prováděl kvalifikovaný anatomický patolog, který byl zaslepen vůči výsledkům vyšetření ULTRA a neměl přístup ke kultuře, ale mohl by vidět výsledky AFB na mikroskopu. Pokud byly zjištěny granulomy, patolog provedl samostatné barvení ZN a barvení na houby pomocí periodické kyseliny Schiffovy (PAS).
Definice případů a statistická analýza
Na základě klinických, histologických a mikrobiologických vyšetření jsme účastníky zařadili do jedné ze tří diagnostických kategorií. Definitivní tuberkulóza (kultivačně pozitivní FNA/tkáň na M. tuberculosis NEBO AFB identifikované na FNA/tkáni) Pravděpodobná tuberkulóza (žádná jiná diagnóza, která by vysvětlovala lymfadenopatii s jednou nebo více z následujících diagnóz: makroskopická kazuistika na FNA/tkáni NEBO tuberkulóza potvrzená mikrobiologicky v jiném místě než v lymfatické uzlině (např. plicní) NEBO granulomy na FNA/tkáni). Třetí kategorie nebyla tuberkulóza (nesplňovala kritéria pro ostatní dvě kategorie). Diagnostická přesnost Ultra byla rovněž uvedena samostatně s použitím pouze pozitivní kultivace jako referenčního standardu.
Odhad velikosti vzorku ve studiích diagnostické přesnosti závisí na prevalenci onemocnění . Očekávali jsme vysokou prevalenci tuberkulózy na základě námi provedené pilotní studie biopsie jádrovou jehlou u HIV pozitivních pacientů, z nichž 92 % mělo tuberkulózní lymfadenitidu , ale podíl pacientů s tuberkulózou v naší studii byl nižší, než jsme očekávali (40 %) v pilotní fázi naší studie. Na základě Cochraneovy metaanalýzy jsme odhadli, že senzitivita i specificita testu Ultra se budou pohybovat kolem 90 % . Při 40% prevalenci tuberkulózy je pro 95% šířku CI 10 % a při citlivosti a specifičnosti 90 % potřeba vzorek o velikosti 87 vzorků . Kvůli nejistotě ohledně diagnostické přesnosti Ultra jsme velikost vzorku nafoukli na 100.
Vypočítali jsme citlivost, specifičnost, negativní prediktivní hodnotu (NPV), pozitivní prediktivní hodnotu (PPV) a poměry pravděpodobnosti definováním pravdivých nebo falešně pozitivních a pravdivých nebo falešně negativních výsledků vůči složenému referenčnímu standardu pravděpodobné nebo definitivní tuberkulózy pro naši primární analýzu. V rámci sekundárních analýz jsme také stanovili přesnost metody Ultra při použití samotné mykobakteriální kultivace jako referenčního standardu. Data byla vložena do databáze REDCap® a analyzována pomocí softwarového balíku STATAv14 (StataCorp, College Station, Texas, USA). Základní klinické charakteristiky byly porovnány pomocí chí-kvadrátu nebo Fisherova přesného testu pro kategoriální proměnné a Kruskal-Wallisova testu pro spojité proměnné. Neplatné testy (tj. Ultra-error) jsme započítali jako negativní výsledky. Tato studie je uvedena v souladu se Standardy pro podávání zpráv o studiích diagnostické přesnosti (Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy Studies Guidelines) .
