Úvod

Každá mikroskopická technika, při níž je celý vzorek vystaven světlu, se nazývá „širokoúhlé“ zobrazování. Protějškem širokoúhlého pole je konfokální metoda, při níž se k zablokování většiny světla přicházejícího ke vzorku a vycházejícího ze vzorku používají dírky. Tento článek pojednává o zobrazování v širokém poli a o nejpoužívanějších technikách zobrazování v širokém poli v mikroskopii.

Mikroskopy v širokém poli

V širokém poli je celý vzorek osvětlen zdrojem světla lampy buď zespodu (vzpřímený mikroskop), nebo shora (obrácený mikroskop). Svislé mikroskopy se často používají s fixovanými vzorky, jako jsou buňky nebo tkáně, které byly ošetřeny a upevněny na mikroskopická sklíčka, zatímco obrácené mikroskopy jsou často vhodnější pro zobrazování vzorku ponořeného v kapalině, protože by obvykle klesl ke dnu a byl by s nimi lépe viditelný zespodu pomocí mikroskopických objektivů. To umožňuje zobrazovat suspenzní buňky, protože buňky studované v přírodních vědách jsou obvykle buď adherentní (rostou přichycené k povrchu), nebo rostou v suspenzi (buňky zavěšené v tekutině). Příklady vzpřímeného a obráceného mikroskopu můžete vidět na obr. 1.

Mikroskopy se širokým polem obvykle používají zdroj bílého světla (například lampu), pro fluorescenční práci postačí některé filtry. Díky tomu je také zobrazování jednodušší a velikost obrazových souborů menší, což usnadňuje práci se širokým polem pro aplikace, jako je dokumentace buněk.

Techniky širokého pole

Příklady technik mikroskopie v širokém poli jsou jasné pole, diferenciální interferenční kontrast (DIC), fázový kontrast a fluorescence v širokém poli.

Mikroskopie v jasném poli je dostupná forma mikroskopie, kdy je celý vzorek osvětlen jasným světlem. Tento přístup vyžaduje jen malou přípravu vzorku a lze jej použít k rychlé a snadné kontrole živých buněk nebo k získání doplňujících údajů. Důrazně se však doporučuje použít kontrastní látku, protože většina buněčných vzorků je průhledná a jejich rozlišení bez barviva nebo barviva bude náročné. Buňky jsou většinou tvořeny vodou a při zobrazování na čirém skle nebo plastu může být obtížné vybrat menší struktury bez dodatečného kontrastu.

Při diferenciálním interferenčním kontrastu (DIC) je vzorek osvětlen světlem rozděleným na dva polarizované světelné paprsky, když se tyto paprsky rekombinují, rozdíly ve fázovém posunu se na výsledném snímku projeví jako kontrast. Podobně jako fázový kontrast není tato technika vhodná pro silnější vzorky a vyžaduje více technického vybavení než jiné techniky.

Mikroskopie s fázovým kontrastem poskytuje lepší kontrast než mikroskopie v jasném poli, protože využívá rozptýlené světlo ze vzorku. Osvětlením vzorku světelným prstencem a dalším prstencem před hledáčkem mikroskopu se části vzorku, které rozptylují světlo jinak, zobrazí na snímku jako tmavší nebo světlejší, čímž je dosaženo většího kontrastu než při standardní mikroskopii v jasovém poli. Tento lepší kontrast není vidět u silnějších vzorků, protože vytváří artefakty, ale dobře funguje u buněčných kultur. Příklad těchto kroužků je vidět na obr. 2.

Fluorescenční mikroskopie v širokém poli je podobná mikroskopii v jasném poli, ale používají se specifické vlnové délky světla za účelem excitace fluorescenčních molekul, kterými byl vzorek předem ošetřen (i když některé vzorky jsou přirozeně autofluorescenční). Vzorky mohou být obarveny fluorescenčními markery pro specifické proteiny nebo buněčné složky a fluorescenční záření těchto markerů pak vytvoří obraz. Fluorescenční signál znamená lepší kontrast ve srovnání s jinými technikami, protože při použití specifických vlnových délek světla vyzařují světlo pouze fluorescenční molekuly, na rozdíl od osvětlení celého obrazu. Protože je však tímto světlem osvětlen celý vzorek, mohou fluorescenční signály z oblasti mimo pozorovací prostor způsobit fluorescenci pozadí a rozmazání obrazu.

Nezaostřené světlo

Hlavní nevýhodou je, že při osvětlení celého vzorku, zatímco ohnisková rovina přijímá světlo a může vytvářet obraz, roviny nad a pod ohniskovou rovinou přijímají také světlo, což vede k rozostřenému světlu, které způsobuje degradaci obrazu. Zejména v případě fluorescenční excitace je rozlišení systému se širokým polem omezeno v důsledku fluorescence v pozadí, která je rovněž zachycena kamerou a snižuje poměr signálu k šumu.

Některé techniky širokého pole se tomuto problému vyhýbají, například mikroskopie se strukturovaným osvětlením (SIM), která využívá světelné obrazce za účelem vytvoření komplexního obrazce, přičemž zobrazování založené na interferenci obrazců umožňuje dosáhnout superrozlišení na úrovni detailů a rozlišit objekty o velikosti až 200 nm. Více informací o SIM si můžete přečíst v poznámce k aplikaci SIM na našich webových stránkách.

Shrnutí

Zobrazování v širokém poli je základem většiny buněčných studií a umožňuje výzkumníkům rychle a snadno zobrazovat vzorky s nízkou úrovní přípravy vzorků nebo potřebných technických znalostí. Zobrazování v širokém poli je výkonná a rozmanitá technika, kterou zná mnoho výzkumných pracovníků, od jasného pole až po fluorescenční zobrazování. I když tato technika může postrádat rozlišení ve srovnání s konfokálními nebo jinými pokročilými mikroskopickými aplikacemi, má zobrazování v širokém poli pevné místo ve výzkumu a bude se v průběhu času dále rozvíjet.