V této studii jsme k pochopení role dráhy IRE1a-XBP1 použili model diferenciace Th2 in vitro (obr. 1). 1b). Naivní pomocné T-lymfocyty byly aktivovány aktivací TCR na destičkách potažených anti-CD3e/CD28 za podmínek diferenciace Th2 po dobu 72 h, odpočívaly 42 h a byly restimulovány aktivací TCR pomocí destiček potažených anti-CD3e/CD28. K narušení dráhy IRE1a-XBP1 jsme použili osvědčené léčivo 4μ8c, které specificky blokuje tuto dráhu inhibicí endonukleázové aktivity IRE1a . Léčivo bylo přidáno do kultivačního média v koncentraci 15 μM na začátku kultivace a během přechodu z aktivační destičky na klidovou destičku. Volba koncentrace léčiva byla určena podle jeho nejvyšší účinnosti inhibice IRE1a při nejnižší toxicitě pro buňky (doplňkový soubor 1: obrázek S1). Porovnali jsme transkriptomy naivních a restimulovaných Th2 (lékem ošetřených a neošetřených) lymfocytů pomocí sekvenování RNA, identifikovali jsme vazebná místa transkripčních faktorů XBP1 v reaktivovaných Th2 pomocí ChIPmentace (ChIP-sekvenování) a integrovali jsme data z celého genomu, abychom předpověděli přímé cíle a jejich regulační roli.

T helper buňky zapínají dráhu IRE1a-XBP1 během aktivace in vitro

Aktivované a diferencované T helper buňky vylučují množství cytokinů. Proto je dobře vyvinutý sekreční mechanismus nezbytným předpokladem pro to, aby se buňky mohly přizpůsobit tomuto sekrečnímu stresu. Abychom předpověděli zapojení dráhy ER-stres/UPR během aktivace pomocných T-buněk, porovnali jsme transkriptom naivních a diferencovaných Th2 buněk (restimulovaných Th2). Diferenciálně exprimované geny získané z tohoto srovnání byly začleněny do dráhy KEGG „Zpracování proteinů v endoplazmatickém retikulu“, aby bylo možné zobrazit složky, které jsou regulovány nahoru nebo dolů. Analýza ukazuje, že při aktivaci naivních pomocných T-buněk a jejich diferenciaci na Th2 buňky dochází k upregulaci exprese genů zapojených do dráhy stresu ER (Additional file 1: Figure S2). Několik faktorů, které byly již dříve charakterizovány jako regulátory skládání a vylučování proteinů, včetně samotného XBP1, je během diferenciace pomocných T buněk upregulováno.

Pro ověření této předpovědi a konkrétní zkoumání zapojení dráhy IRE1a-XBP1 jsme měřili expresi mRNA a proteinu IRE1a v diferencovaných a reaktivovaných Th2 lymfocytech in vitro (obr. 1b). Buňky byly analyzovány pomocí qPCR a Western blotu pro porovnání mRNA, resp. proteinu. Zjistili jsme, že hladina mRNA i proteinu byla u aktivovaných pomocných T buněk zvýšená (obr. 1c, levý a prostřední panel). Je známo, že fosforylace IRE1a označuje jeho funkční stav. Pozorovali jsme, že protein je fosforylován u aktivovaných Th2 lymfocytů (obr. 1c, pravý panel). Toto zvýšení fosfo-IRE1a lze vysvětlit zvýšenou syntézou proteinu, i když nemůžeme vyloučit možnost zvýšené kinázové aktivity a autofosforylace. Denzitometrická analýza pásu Western blot naznačuje, že se na ní podílejí oba mechanismy, jak upregulace syntézy proteinu, tak zvýšená fosforylace. Upregulace proteinu se zvýšila trojnásobně, ale fosfoprotein se zvýšil 4,5násobně (obr. 1c).

Aktivovaná IRE1a štěpí nesštěpenou mRNA XBP1 (XBP1u) a vytváří štěpenou izoformu mRNA XBP1 (XBP1s). Při aktivaci pomocných buněk T jsme pozorovali nárůst sestřihané formy XBP1 (XBP1s), a to jak na úrovni mRNA, tak na úrovni proteinu (obr. 1d, e). Jako pozitivní kontrola byl použit tunikamycin. Jedná se o léčivo, které inhibuje N-vázanou glykosylaci, a tím způsobuje akumulaci nesložených proteinů (tj. stres endoplazmatického retikula (ER)) a zvyšuje XBP1s zvýšením aktivity IRE1a. Specifická inhibice endonukleázové aktivity IRE1a ošetřením buněk přípravkem 4μ8c zrušila jak mRNA, tak proteinovou izoformu XBP1s, což potvrzuje, že tvorba sestřihané formy je závislá na aktivitě IRE1a (obr. 1d, e).

Tyto výsledky potvrzují, že dráha IRE1a-XBP1 je v Th2 lymfocytech konzervovaná a regulovaná během aktivace pomocných T buněk in vitro. Dále jsme se rozhodli zjistit, zda to platí i in vivo.

In vivo aktivované pomocné T-lymfocyty regulují dráhu IRE1a-XBP1

Abychom otestovali, zda je dráha IRE1a-XBP1 funkční u CD4+ T-lymfocytů in vivo, infikovali jsme myši C57BL/6 helmintickým parazitem Nippostrongylus brasiliensis, což je dobře zavedený model imunitní odpovědi řízené Th2 . Po 7 dnech po infekci jsme analyzovali expresi proteinu XBP1s v pomocných T buňkách pomocí průtokové cytometrie. Zjistili jsme, že pomocné T buňky myší infikovaných červem exprimují významně více XBP1s ve srovnání s neinfikovanými kontrolními myšmi, což naznačuje upregulaci dráhy (obr. 2).

Pomocné T buňky in vivo během infekce upregulují dráhu IRE1a-XBP1. Splenocyty z myší infikovaných hlísticemi (Nippostrongylus brasiliensis) (7 dní po infekci) byly obarveny protilátkou anti-XBP1s konjugovanou s PE a analyzovány průtokovou cytometrií (strategie gatingu: singlet > živé buňky > CD4+CD3e+ > XBP1s+). Je zobrazen jeden reprezentativní profil FACS (levý panel) a graf obsahující všechny výsledky (n = 4) je zobrazen na „pravém panelu“

Tyto výsledky potvrzují, že dráha je aktivní in vivo. Proto jsme se rozhodli pitvat tuto dráhu pomocí celogenomových přístupů v Th2 lymfocytech.

Celogenomová transkriptomická analýza diferenciální genové exprese odhaluje geny regulované IRE1a-XBP1

Pro zachycení globální genové regulační role dráhy IRE1a-XBP1 jsme porovnávali in vitro aktivované Th2 buňky s buňkami s inhibovanou aktivitou endonukleázy IRE1a přidáním 4μ8c do kultivačního média. Poté jsme porovnali transkriptomy aktivovaných Th2 lymfocytů s inhibicí dráhy IRE1a-XBP1 nebo bez ní. Transkriptomy Th2 buněk ošetřených a neošetřených 4μ8c byly získány sekvenováním mRNA (RNA-seq). Kontrola kvality dat sekvenování RNA je uvedena v doplňkovém souboru 1: Obrázek S3. Porovnáním transkriptomů naivních a aktivovaných Th2 lymfocytů jsme zjistili, že 10995 genů bylo při aktivaci Th2 rozdílně regulováno. Inhibice dráhy IRE1a-XBP1 léčbou 4μ8c vedla k rozdílné expresi 3144 genů ve srovnání s neléčenou kontrolou Th2 (obr. 3a, Additional file 1: Figure S3 right panel). Dva tisíce šest set sedmdesát z těchto genů se podílelo na diferenciaci Th2 (obr. 3a). Hierarchické shlukování genů odhaluje skupiny genů, jejichž regulace se po léčbě 4μ8c zvýšila a snížila (Additional file 1: Figure S3, right). Podrobné zkoumání těchto genů odhalilo, že mnohé z nich jsou spojeny s reakcí na nesložené proteiny a ER-stresem, což naznačuje významný vliv dráhy IRE1a-XBP1 (obr. 3b) na tyto biologické procesy. Kompletní seznam diferenciálně exprimovaných genů naleznete v Doplňkovém souboru 2: Tabulka S1. Analýza genové ontologie (GO) těchto diferenciálně exprimovaných genů při působení 4μ8c na buňky Th2 (tj. genů regulovaných dráhou IRE1a-XBP1) ukázala, že jsou obohaceny v následujících biologických procesech: „Odpověď na stres ER“ (GO:0006950), „Regulace přenosu signálu“ (GO:0009966), „Produkce cytokinů“ (GO:0001816), „Buněčná proliferace“ (GO:0008283), „Buněčný cyklus“ (GO:0007049) a Imunitní odpověď (GO:0006955) (obr. 3c). Tyto změny ve vzorcích genové exprese po inhibici IRE1a naznačují rozsáhlé zapojení transkripčního faktoru XBP1 do aktivace a proliferace Th2 a také do diferenciace. Proto jsme se rozhodli zjistit vzorce obsazení chromatinu transkripčního faktoru XBP1 v celém genomu.

Diferenciální exprese genů u Th2 v důsledku inhibice IRE1a-XBP1 pomocí 4μ8c. Naivní pomocné T buňky byly aktivovány za podmínek diferenciace Th2 v přítomnosti nebo nepřítomnosti 4μ8c. Buňky byly aktivovány na destičkách potažených protilátkami anti-CD3e a anti-CD28 po dobu 3 dnů, 2 dny odpočívaly a byly reaktivovány na potažených destičkách po dobu 6 h. Data RNAseq byla analyzována na rozdílnou expresi genů. a Vennův diagram znázorňující počty rozdílně exprimovaných genů v různých experimentálních podmínkách. „Naivní → Th2“ označuje rozdílně exprimované geny mezi naivními T-pomocníky a Th2 buňkami. „Th2 → Th2+4μ8c“ označuje rozdílně exprimované geny mezi neošetřenými Th2 a Th2 ošetřenými 4μ8c. b Heatmap zobrazující rozdílně exprimované geny, o nichž je známo, že se podílejí na řešení stresu ER vyvolaného reakcí na nesložené proteiny. Tepelná mapa zobrazuje škálované hodnoty exprese označené jako řádkové Z-skóre, v červeno-modré barevné škále, přičemž červená znamená zvýšenou expresi a modrá sníženou expresi. c Analýza genové ontologie (GO) rozdílně exprimovaných genů mezi Th2 a Th2 ošetřenými 4μ8c

XBP1 ChIPmentace odhaluje přímé cílové geny XBP1 v buňkách Th2

K identifikaci obsazení chromatinu XBP1 v celém genomu, jsme provedli ChIPmentaci, nedávno vyvinutou metodu, která se ukázala být rychlejší, citlivější a robustnější než tradiční přístupy ChIP-seq , s použitím protilátky ChIP proti XBP1. Pro ChIP XBP1 byly použity in vitro diferencované a reaktivované Th2 buňky. Byly provedeny dvě nezávislé biologické replikace. Pro každou replikaci jsme získali 19,3 milionu a 22,4 milionu párových čtení. Pomocí MACS2 s hodnotou q menší než 0,01 a násobným obohacením nad 5 jsme v obou replikátech identifikovali 9031, resp. 7662 píků. Analýza překrývání pomocí nástroje bedtools naznačila, že v obou replikátech bylo přítomno 5892 píků. Proto jsme se při následné analýze zaměřili pouze na těchto 5892 píků.

Podle očekávání byly vazebné píky identifikovány kolem promotorových oblastí známých cílových genů XBP1, například Hspa5, který kóduje ER-chaperonový protein BiP známý také jako Grp78; vazebná událost byla pozorována také kolem promotoru samotného XBP1 (obr. 4a), což naznačuje potenciální autoregulaci XBP1. Abychom zjistili genomické vlastnosti spojené s vazebnými místy XBP1, porovnali jsme umístění jeho vrcholů s geny RefSeq pomocí programu HOMER . Většina vazebných vrcholů XBP1 se nacházela v promotoru (definovaném jako 1000 bp před a 500 bp po proudu vzhledem k anotovaným místům začátku transkripce) (36 %) a v intronické (35 %) oblasti a často byla pozorována také distální intergenická vazba (25 %) (obr. 4b). Genomové rozložení vrcholů XBP1 naznačuje, že se váže jak na promotory, tak na potenciální enhancery.

Celogenomové obsazení chromatinu transkripčního faktoru XBP1 v Th2 lymfocytu. ChIPmentace XBP1 byla provedena v in vitro diferencovaných Th2 buňkách za účelem získání celogenomové obsazenosti chromatinu XBP1. a Snímek vazebných píků XBP1 kolem vyznačených reprezentativních genů z prohlížeče genomu UCSC. b Genomová distribuce vazebných píků XBP1. Sektor odpovídající promotoru zahrnuje sekvence do 1 kb proti proudu a 100 bp po proudu od TSS. c Porovnání motivů XBP1 z databáze JASPAR (nahoře), ChIP-seq lidských buněčných linií karcinomu prsu (uprostřed) a myších Th2 lymfocytů (dole). d Frekvence motivů XPB1 a NF-Y kolem vazebných vrcholů XBP1. e Termíny GO biologických procesů obohacené v rámci vazebných vrcholů XBP1 analyzované pomocí GREAT

Pro další charakterizaci regulomu XBP1 jsme provedli de novo objevování motivů pomocí programu HOMER k identifikaci obohacených motivů DNA v rámci vazebných oblastí XBP1. Nejlepším identifikovaným motivem je konsenzuální sekvence GCCACGT, která je téměř identická s vazebným motivem lidského XBP1 definovaným v buněčných liniích karcinomu prsu (obr. 4c) . To naznačuje vysoce konzervované vazebné specifity XBP1 mezi člověkem a myší a napříč buněčnými typy. Hlavní motiv obohacený v našich myších datech se také podobá motivu XBP1 z databáze JASPAR , což opět podporuje vysokou kvalitu našich dat ChIPmentace. Druhým nejvíce obohaceným motivem je vazebný motiv NF-Y (Additional file 1: Figure S4C). Je zajímavé, že motiv NF-Y byl často nalezen v okolí promotorových oblastí genů buněčného cyklu, zejména genů zapojených do regulace G2/M buněčného cyklu . Jak motiv XBP1, tak motiv NF-Y se vyskytují společně kolem podmnožiny 258 vazebných vrcholů XBP1 (obr. 4d), což naznačuje možnou spolupráci mezi transkripčními faktory XBP1 a NF-Y při regulaci podmnožiny cílových genů. Seznam cílových genů, které jsou potenciálně společně regulovány XBP1 a NF-Y, je zobrazen v Doplňkovém souboru 3: Tabulka S2 a kompletní seznam cílových genů XBP1 je rovněž uveden v Doplňkovém souboru 3: Tabulka S2. Pět nejlépe obohacených motivů je zobrazeno v Doplňkovém souboru 1: Obrázek S4C. Pro zkoumání funkcí genů vázaných na XBP1 jsme použili GREAT k charakterizaci vazebných vrcholů XBP1. Většina významných termínů GO souvisí se skládáním proteinů a ER-stresem (obr. 4e), což je v souladu se známou biologickou úlohou XBP1.

Souhrnně experimenty s ChIPmentací předpovídají úlohu XBP1 při zvyšování skládání a vylučování proteinů a aktivaci Th2 lymfocytů.

Integrace transkriptomických dat a dat ChIP-seq k odhalení regulační sítě genů řízených XBP1

Pro odhalení přímých cílových genů regulovaných XBP1 a jeho transkripční regulační sítě jsme integrovali transkriptomická data celého genomu a data ChIPmentace. Přímý cílový gen je definován jeho rozdílnou expresí při inhibici IRE1a (tj. při léčbě 4μ8c) a obsazením transkripčního faktoru XBP1 v genovém lokusu. Nalezli jsme 1143 přímých cílových genů v Th2, z nichž 122 cílů bylo dříve popsáno jako přímý cíl XBP1 v jiných typech buněk (tj. ve svalu, β-buňkách pankreatu a plazmatických buňkách) (obr. 5a). V tomto kontextu lze 1021 genů považovat za specifické pro Th2. Působení XBP1 nad jeho přímými cíli nemá definovaný směr, obsahuje geny regulované nahoru i dolů. Nejvíce 38 genů sledujících jeden z těchto vzorců je uvedeno na obr. 5b a jejich úplný seznam lze nalézt v doplňkovém souboru 4: tabulka S3. Nejvýznamnější identifikované biologické procesy a dráhy souvisejí se skládáním proteinů a ER-stresem (Doplňkový soubor 1: Obrázek S5), které jsou v souladu s jeho známými biologickými rolemi, a zahrnují také nové cíle specifické pro Th2

Integrace dat ChIPmentace a RNA-seq odhaluje přímé cílové geny XBP1 a jeho regulační síť. a Vennův diagram srovnávající dříve popsané cílové geny XBP1 jiných typů sekrečních buněk s přímými cílovými geny Th2 této studie. Přímé cílové geny XBP1 této studie jsou ty, které jsou společné v obou kategoriích „geny obsazené XBP1 v Th2“ a „diferenciálně exprimované geny (Th2 → Th2+4μ8c)“. Přímé cílové geny XBP1 v B buňkách/plazmatických buňkách, buňkách kosterního svalstva a β buňkách pankreatu byly pozorovány Acosta-Alvear et al. a byly zde použity pro srovnání. b Heatmap zobrazující vzorec exprese přímých cílových genů XBP1. Bylo zobrazeno 38 nejvýznamnějších genů, které vykazují zřetelný vzorec. c Transkripční regulační síť: transkripční faktory, které jsou přímým cílem XBP1. Geny v síti jsou rozdílně exprimovány (zvýšená regulace – červená; snížená regulace – modrá) až při léčbě 4μ8c. Transkripční faktory, které nejsou diferenciálně exprimovány, ale mají pík XBP1 ChIPseq, jsou uvedeny v seznamu na pravé straně

Přes převažující roli XBP1 v řízení této dráhy se zjistilo, že se na ní podílejí i jiné transkripční faktory. Abychom prozkoumali regulační kaskádu, která následuje po regulaci XBP1, sestavili jsme transkripční regulační síť extrakcí anotovaných transkripčních faktorů s promotorovými nebo exonickými/intronickými píky ChIP-seq (obr. 5c). Kompletní seznam transkripčních faktorů naleznete v Doplňkovém souboru 5: Tabulka S4. Tato síť byla dále doplněna přidáním diferenciálně exprimovaných genů, které mají anotované interakce s cílovými transkripčními faktory v databázi STRING (Additional file 6: Table S5).

Transkripční faktory, které jsou přímo regulovány XBP1, lze rozdělit do tří širokých funkčních kategorií podílejících se na: řešení proteinového sekrečního stresu ER, regulaci buněčného cyklu a proliferace a řízení efektorové funkce imunitních buněk. Transkripční faktory zapojené do stresu ER pravděpodobně usnadňují sekreci cytokinů v lymfocytech Th2. Tato předpověď vychází z předchozích zpráv ze sekrečních buněk, jako jsou pankreatické acinární buňky a plazmatické buňky. Bylo prokázáno, že tyto transkripční faktory, konkrétně Bhlha15, Atf3, Atf6, Atf6b, Atf4 a Creb3l2, se podílejí na adaptaci sekrečního stresu ER .

Účelem buněčné proliferace a transkripčních faktorů souvisejících s buněčným cyklem by mohlo být usnadnění řízené rychlé expanze aktivovaných Th2 buněk. Faktory související s imunitní odpovědí se pravděpodobně podílejí na diferenciaci Th2 a produkci cytokinů. Proto jsme chtěli otestovat vliv downregulace XBP1s na sekreci cytokinů, buněčnou proliferaci a produkci cytokinů.

Dráha IRE1a-XBP1 řídí sekreci cytokinů v T helper buňkách

Celogenomové srovnání genů regulovaných XBP1s předpovídá, že se tento faktor podílí na sekreci cytokinů. Abychom tuto předpověď ověřili, zablokovali jsme endonukleázovou aktivitu IRE1a v Th2 buňkách a analyzovali supernatant buněčné kultury za účelem kvantifikace hladiny IL4 metodou ELISA. IL4 jsme vybrali jako testovatelný kandidátský cytokin, protože jeho mRNA a protein se při downregulaci XBP1 nemění (Additional file 1: Obrázek S6A levý panel, Obrázek 6 levý a prostřední panel horního řádku). Zjistili jsme, že sekrece IL4 je u buněk ošetřených 4μ8c významně inhibována (obr. 6, pravý panel horního řádku). Podle očekávání tento výsledek podporuje zapojení dráhy IRE1a-XBP1 do usnadnění sekrece cytokinů v Th2 buňkách, jak se předpokládalo. Inhibice této dráhy během restimulační fáze nemá žádný významný inhibiční účinek na sekreci IL4 (Additional file 1: Figure S6B). Tento výsledek naznačuje, že dráha XBP1s je nutná během diferenciace Th2, pravděpodobně pro vývoj účinného sekrečního aparátu.

DráhaIRE1a-XBP1 je nutná pro expresi a sekreci cytokinů v Th2 lymfocytech. Naivní pomocné T-lymfocyty byly kultivovány po podmínce aktivace Th2 v přítomnosti inhibitoru IRE1a 4μ8c po dobu 3 dnů, 2 dny odpočívaly, byly reaktivovány pomocí potažené destičky a analyzovány průtokovou cytometrií za účelem detekce exprese nitrobuněčných cytokinů IL4, IL5 a IL13. Reprezentativní profily FACS jsou zobrazeny v prvních dvou sloupcích. Exprese nitrobuněčných cytokinů je porovnána ve sloupci 3, přičemž se jedná o tři až sedm nezávislých biologických opakování. Čtvrtý sloupec: supernatanty z buněčných kultur Th2 ošetřených 4μ8c nebo DMSO byly analyzovány metodou ELISA pro měření koncentrace cytokinů. Gating FACS: lymfocyty > singlety > živé buňky > cytokiny

Dráha IRE1a-XBP1 kontroluje expresi cytokinů IL13 a IL5

IL5 a IL13 jsou dva významné cytokiny typu 2, které se podílejí na eozinofilii, alergiích a infekci helminty. Zjistili jsme, že inhibice dráhy IRE1a-XBP1 významně potlačuje expresi a sekreci proteinů IL5 a IL13 do kultivačního média (obr. 6 pravé panely prostředního a spodního řádku). Bioinformatická analýza transkriptomu Th2 předpovídá, že dráha IRE1a-XBP1 pozitivně řídí expresi genů IL5 a IL13, protože oba geny byly identifikovány jako diferenciálně exprimované geny při inhibici IRE1a (Additional file 2: Table S1). Tuto předpověď jsme ověřili analýzou genové exprese pomocí RT-qPCR (doplňkový soubor 1: obrázek S6A, prostřední a pravý panel) a průtokovou cytometrií (obr. 6). Tyto výsledky naznačují transkripční zapojení dráhy regulující IL5 a IL13. Pozoruhodné je, že hladiny mRNA a proteinu IL4 nejsou ovlivněny, což naznačuje specifickou regulaci IL5 a IL13.

DráhaIRE1a-XBP1 usnadňuje proliferaci T helper buněk závislou na aktivaci

Míra proliferace buněk je výsledným efektem interakce pozitivních a negativních regulátorů. Pozorovali jsme, že geny kódující geny pozitivních i negativních regulátorů buněčné proliferace jsou rozdílně exprimovány, když byla dráha IRE1a-XBP1 blokována pomocí 4μ8c (obr. 7a, levý panel, Additional file 7: Table S6), z nichž mnoho genů bylo shledáno jako přímé cíle XBP1 (obr. 7a, pravý panel, Additional file 8: Table S7). Toto pozorování předpovídá změnu rychlosti proliferace při inhibici IRE1a. Proto nás zajímalo ověření vlivu inhibice IRE1a-XBP1 na proliferaci buněk. Provedli jsme test buněčné proliferace s použitím buněk Th2. Naivní slezinné CD4+ T buňky byly označeny violetí CellTrace a aktivovány za podmínek diferenciace Th2 v přítomnosti nebo nepřítomnosti 4μ8c. Rozpad fluorescenčního barviva byl sledován průtokovou cytometrií. Zjistili jsme, že downregulace XBP1s významně inhibuje buněčnou proliferaci (obr. 7b), ale neindukuje buněčnou smrt (Additional file 1: Figure S7).

DráhaIRE1a-XBP1 podporuje proliferaci a cyklování buněk Th2 závislé na aktivaci. a Levý panel: hierarchické shlukování diferenciálně exprimovaných genů souvisejících s proliferací buněk v transkriptomu Th2 ošetřených a neošetřených 4μ8c. Pravý panel: hierarchické shlukování přímých cílových genů XBP1, o nichž je známo, že se podílejí na buněčné proliferaci. Tepelná mapa zobrazuje škálované hodnoty exprese označené jako řádkové Z-skóre, v červeno-modré barevné škále, přičemž červená znamená zvýšenou expresi a modrá sníženou expresi. b Splenické naivní pomocné T-buňky byly obarveny barvivem CellTrace Violet a aktivovány po dobu 72 h v podmínkách Th2 diferenciace a analyzovány průtokovou cytometrií. Generace Th2 buněk jsou na histogramu buněčné proliferace označeny „červeně“ a buňky ošetřené 4μ8c „modře“ (levý panel, jeden reprezentativní experiment). Grafické znázornění indexu dělení získaného z pěti nezávislých biologických replikátů (pravý panel)

Proliferace pomocných buněk T je spojena s diferenciací a produkcí cytokinů. Snížená exprese IL5 a IL13 (obr. 6) by mohla být potenciálně vysvětlena tím, že proliferace buněk je zpomalena. Pokud by však byla snížená proliferace hlavním důvodem nedostatečné sekrece, byla by inhibována i produkce IL4. Přesto jsme nepozorovali žádnou významnou změnu v expresi IL4 po inhibici IRE1a (obr. 6, Additional file 1: Figure S6A). Abychom tento rozpor dále prozkoumali, provedli jsme testy buněčné proliferace pomocí myších reportérových linií IL13-GFP a IL4-GFP. U buněk Th2 exprimujících IL4-GFP jsme po léčbě 4μ8c pozorovali inhibici produkce IL4 v prvních několika generacích buněčného dělení až do 72 h (Additional file 1: Figure S8). Po 96 h se však rozdíl v expresi IL4 stává nevýznamným bez ohledu na to, ve které generaci buněčného dělení se buňky nacházejí. Toto pozorování naznačuje, že zpomalení proliferace v důsledku inhibice IRE1a nestačí k inhibici exprese IL4. Naproti tomu u IL13-GFP jsme pozorovali pokles exprese IL13 již od první generace, který pokračuje i v dalších generacích (Additional file 1: Figure S9).

InhibiceIRE1a zpožďuje progresi buněčného cyklu přes S a G2/M fázi

Bioinformatická analýza diferenciálně exprimovaných genů (Th2 vs. Th2 léčené 4μ8c) a přímých cílových genů XBP1 odhaluje několik genů, které se podílejí na kontrole progrese buněčného cyklu přes různé fáze (tj, G1, S, G2/M), byly shlukovány do dvou skupin s vyšší nebo nižší regulací (obr. 8a). Vzali jsme geny rozdílně exprimované u Th2 ošetřených 4μ8c ve srovnání s neošetřenými Th2 (upravená hodnota p < 0,05) (obr. 8a, vlevo, doplňkový soubor 9: tabulka S8) a geny rozdílně exprimované přímými cílovými geny XBP1 (obr. 8a, vpravo, doplňkový soubor 10: tabulka S9) a zkontrolovali jsme známé role v různých fázích buněčného cyklu buď pomocí ručně sestaveného seznamu na základě dat RNA-seq, nebo publikované databáze . Zjistili jsme, že bylo ovlivněno mnoho genů ze všech fází buněčného cyklu (tj. G1, S a G2/M). K identifikaci stadií buněčného cyklu regulovaných dráhou IRE1a-XBP1 jsme vytvořili a použili transgenní myší kmen FUCCI (fluorescenční ubikvitinový indikátor buněčného cyklu), který exprimuje mCherry značený Cdt1 a mVenus značený protein Geminin. Tento kmen je podobný kmeni použitému v . Buňky G1 jsou mCherry+ mVenus- (Q3; obr. 8b), buňky G1-S jsou mCherry+ mVenus+ (Q2; obr. 8b) a SG2M jsou mCherry- mVenus+ (Q1; obr. 8b), zatímco buňky v mitóze a vstupující do G1 jsou mCherry- mVenus- (Q4; obr. 8b). Porovnali jsme profily buněčného cyklu Th2 buněk ošetřených vehikulem a 4μ8c během aktivace T buněk. Zjistili jsme, že při zablokování dráhy IRE1a-XBP1 se buňky hromadí ve fázi S a/nebo G2/M (obr. 8b). Podobných výsledků jsme dosáhli i při jiném přístupu pomocí testu inkorporace BrdU s barvením DAPI (Additional file 1: Figure S10).

InhibiceIRE1a zpožďuje progresi buněčného cyklu přes fázi S a G2/M. a Levý panel: heatmapa diferenciálně exprimovaných genů souvisejících s fází buněčného cyklu v transkriptomu Th2 léčených a neléčených 4μ8c. Pravý panel: heatmapa přímých cílových genů XBP1, o nichž je známo, že se podílejí na buněčném cyklu. Heatmapa zobrazuje škálované hodnoty exprese označené jako řádkové Z-skóre, v červeno-modré barevné škále, přičemž červená znamená zvýšenou expresi a modrá sníženou expresi. b Analýza buněčného cyklu Th2 lymfocytů po 72 hodinách aktivace s použitím myší linie FUCCI, která exprimuje CDT1 značený mCherry a GEMININ značený Venus. Vlevo nahoře: schematické znázornění fází buněčného cyklu u použité myši FUCCI. Vpravo nahoře: srovnání buněk (% z celkového počtu) získaných z různých fází buněčného cyklu u Th2 a Th2 léčených 4μ8c (n = 6). Spodní panely: jeden reprezentativní profil FACS Th2 a Th2 léčených 4μ8c zobrazující buňky exprimující CDT1 a GEMININ

Transgenní exprese XBP1s doplňuje 4μ8c zprostředkovanou inhibici aktivity endonukleázy IRE1a

Pro ověření, zda pozorované fenotypy léčené 4μ8c byly způsobeny ztrátou XBP1s, jsme provedli komplementační testy transdukcí expresního vektoru XBP1s do Th2 buněk in vitro. Vektor kódoval sestřihovou formu XBP1 (XBP1s), jejíž funkce je nezávislá na funkci IRE1a. Zjistili jsme, že stabilní ektopická exprese XBP1s neguje účinek léčby 4μ8c a při nadměrné expresi XBP1s buňkami Th2 nedochází k žádné významné změně transkriptomu po léčbě 4μ8c (Additional file 1: Figure S11A). Th2 buňky s nadměrnou expresí XBP1s se v přítomnosti 4μ8c normálně množí a diferencují (Additional file 1: Figure S11B a S11C). Tyto výsledky silně naznačují, že fenotypy pozorované při léčbě 4μ8c jsou způsobeny ztrátou XBP1s.

.