By Sara Ryding, B.Sc.Reviewed by Deepthi Sathyajith, M.Pharm.

Celogenomové bisulfitové sekvenování neboli WGBS je technika sekvenování nové generace pro analýzu metylace DNA.

Obrázek: Egorov Artem /

Metylace DNA je epigenetický mechanismus regulace genové exprese a zahrnuje přidání metylové skupiny k cytosinové bázi. Abnormální vzorce metylace jsou spojeny s několika stavy a onemocněními, jako je například rakovina. Od vývoje WGBS se používá ke studiu epigenetického přeprogramování, epigenetických podpisů a dalších.

Základní metodika

WGBS kombinuje použití ošetření bisulfátem sodným a vysoce výkonné sekvenování DNA. Bisulfit sodný chrání metylované cytosiny neboli metylcytosiny před přeměnou, zatímco nemetylované cytosiny jsou přeměněny na uracil.

Nemetylované cytosiny jsou pak po PCR dále převedeny na thymin, což znamená, že výsledky sekvenování ukazují převážně adeninové, guaninové a thyminové báze, přičemž jakékoli cytosinové báze označují metylovaná cytosinová místa.

Metoda byla původně zkoušena na rostlině Aradopsis thaliana, a to kvůli jejímu relativně malému genomu. Od té doby se ukázalo, že je schopna analyzovat přibližně 90 % všech cytosinů, které byly zkoušeny. Technika WGBS byla použita na genomy lidí, myší, kukuřice a sóji.

Použití v kmenových buňkách

Kmenové buňky jsou nediferencované buňky, které si zachovávají schopnost stát se jakýmkoli typem buněk, například neurony nebo svalovými buňkami. Proto jsou velmi zajímavé pro vývojové biology a případné aplikace v medicíně, aby pochopili, čím se liší od zralých buněk.

První mapy metylovaných cytosinů v celém genomu s rozlišením jedné báze u lidských embryonálních kmenových buněk a fetálních fibroblastů ukázaly velké rozdíly mezi nimi. V embryonálních buňkách se téměř čtvrtina všech identifikovaných metylací nacházela v necytosinovém guaninovém (CG) kontextu, zatímco ve fetálních buňkách bylo 99,98 % metylcytosinů v GC kontextu.

Non-CG kontext znamená, že byl v CHG nebo CHH, kde H představuje adenin, tymin nebo cytosin. Předtím se převážně věřilo, že téměř veškerá metylace savčí DNA probíhá v kontextu CG, zatímco tato studie naznačila, že se může jednat o obecnou vlastnost lidských embryonálních kmenových buněk.

Zdá se, že metylace non-CG se při diferenciaci ztrácí. Non-CG metylace byla obnovena, když byly fetální buňky manipulovány na indukované pluripotentní kmenové buňky. To také ukazuje, že metylace CHG a CHH není způsobena genetickými rozdíly, ale naopak je charakteristická pro embryonální kmenové buňky.

Předchozí studie naznačila, že kmenové buňky, ať už indukované pluripotentní kmenové buňky nebo embryonální kmenové buňky, sdílejí epigenetické vlastnosti prostřednictvím metylace. Kmenové buňky jsou nesmírně důležité pro terapeutické účely a studium nemocí. Od somatických buněk se liší spíše epigenomickými než genetickými transformacemi, a proto je studium jejich metylačního vzorce velmi zajímavé.

Následná studie se zaměřila na rozdíly mezi embryonálními kmenovými buňkami a indukovanými pluripotentními kmenovými buňkami a zjistila, že zatímco jejich metylační vzorec je na globální úrovni velmi podobný, indukované pluripotentní kmenové buňky vykazují ve srovnání s embryonálními kmenovými buňkami značné rozdíly v reprogramování. Ačkoli tedy WGBS pomohla objasnit mnohé o kmenových buňkách, určité otázky stále zůstávají.

WGBS ve vývojové biologii

Metylace DNA je důležitá během normálního vývoje savců. Zejména v pluripotentních kmenových buňkách a oocytech je rozšířená non-CG metylace.

Výzkumníci použili WGBS k dalšímu zkoumání tohoto konceptu a zjistili, že téměř dvě třetiny veškeré metylace v oocytech myších zárodečných váčků se vyskytují v non-CG kontextu. Zjistili také, že metylace non-CG míst se během růstu oocytů hromadí.

Ukázalo se, že metylace non-CG závisí zejména na několika metyltransferázách, konkrétně na komplexu DNA metyltransferáz, tj. komplexu Dnmt3s-Dnmt3L. Naproti tomu se zdálo, že Dnmt1 udržuje metylaci CG.

Dědičnost epigenetického programování je u rostlin běžnější než u savců. Studie zaměřená na metylaci zjistila, že pomocí WGBS rostlinná zárodečná linie zachovává metylaci CG a CHG. To je na rozdíl od savců, u nichž se metylace CHH ztrácí v mikrosporách a spermatických buňkách. Po oplození je však obnovena de novo metyltransferázou DNA řízenou malou RNA.

WGBS pro včasnou diagnostiku onemocnění

Studie prokázaly, že WGBS lze použít k detekci abnormální metylace pomocí screeningu specifických hypermetylovaných supresorových genů, které se vyskytují u rakoviny, jako je akutní promyelocytární leukémie, rakovina žaludku atd.

Použití WGBS ve forenzních vědách

Forenzní studie byly provedeny na vzorcích suché krevní skvrny pomocí WGBS po extrakci DNA. Použití WGBS poskytuje vysoce kvalitní vzorky, které zlepšují analýzu metylace DNA na forenzních skvrnách.

Shrnem lze říci, že WGBS se stává stále populárnější při studiu metylace DNA díky schopnosti této techniky odhadnout metylaci DNA bisulfitem konvertované genomové DNA s rozlišením jednoho nukleotidu.

Přestože je WGBS velmi účinným nástrojem pro pochopení epigenetického přeprogramování, je stejně důležité vyvinout a udržovat nákladově efektivní technologii vysokosekvenování, kterou lze použít v různých oblastech vědeckého výzkumu.

Další čtení

• Všechen obsah sekvenování DNA
• Sekvenování DNA
• Sestavování sekvencí DNA
• Mikroarray DNA
• Vysoká-throughput DNA Sequencing Techniques

Napsal

Sara Ryding

Sara je vášnivá spisovatelka v oblasti přírodních věd, která se specializuje na zoologii a ornitologii. V současné době dokončuje doktorát na Deakinově univerzitě v Austrálii, který se zaměřuje na to, jak se mění zobáky ptáků v souvislosti s globálním oteplováním.

Citace

.