Transformace herbicidů houbami bílé hniloby

Je dobře zdokumentováno, že široká škála polutantů včetně pesticidů je transformována a degradována WRF: pentachlorfenoly, isoproturon, derivát isoxaflutolu, atrazin, simazin, propazin, lindan, atrazin, diuron, terbuthylazin, metalaxyl, DDT, dieldrin, aldrin, heptachlor, chlordan atd. . Tento seznam může být rozšířen vzhledem k přesvědčivým důkazům o degradačním potenciálu WRF vůči různým třídám znečišťujících látek. Údaje o rozkladu herbicidů pomocí WRF jsou částečně shrnuty v tabulce 2. Je třeba zmínit, že velké množství prací bylo provedeno za použití stacionárních podmínek na kapalném médiu a fermentačních podmínek pevného systému. Existují však rozporuplné údaje o úrovni degradace herbicidů, úloze ligninolytických enzymů v tomto postupu a také o mechanismu degradace.

Některé houby, jako jsou Agrocybe semiorbicularis, Auricularia auricula, Coriolus versicolor, Dichomitus squalens, Flammulina velupites, Hypholoma fasciculare, Pleurotus ostreatus, Phanerochaete velutina a Stereum hirsutum, prokázaly schopnost rozkládat různé herbicidy jako atrazin, diuron a terbuthylazin s různou účinností . Coriolus versicolor, Hypholoma fasciculare a Stereum hirsutum rozložily za 6 týdnů více než 86 % diuronu, atrazinu a terbuthylazinu. Byly také nejaktivnější v produkci ligninolytických enzymů. Schopnost WRF rozkládat aromatické herbicidy, diuron, atrazin a terbuthylazin, však nekorelovala s jejich ligninolytickou aktivitou stanovenou v testu dekolorace Poly R-478 (který se používá jako indikátor ligninolytické aktivity). Možným vysvětlením těchto výsledků byl rozdíl ve vzorcích LME produkovaných houbami v tekutých kulturách. Je zajímavé, že v rámci polních pokusů byl nejúčinnější kmen S. hirsutum při rozkladu herbicidu neaktivní a ostatní kmeny C. versicolor a H. fasciculare vykazovaly 30% rozklad chloropyrifosu za 6 týdnů .

Houby bílé hniloby Phanerochaete chrysosporium a Trametes versicolor přeměnily až 35-40 % diketonitrilu (produkt půdní přeměny herbicidu isoxaflutolu) na neaktivní analog kyseliny benzoové po 15 dnech ve stacionárních podmínkách na tekutém médiu . Zdá se, že hladina ligninolytických enzymů, jako jsou lakasa, produkovaných během fermentace, korelovala s degradací herbicidu, což potvrzuje úlohu těchto enzymů v degradačních procesech. Autoři však zdůraznili, že indukce šestinásobné produkce lakasy přídavkem 2,5-xylidinu nevedla k významnému zvýšení štěpení diketonitrilu.

Ukázalo se, že Coriolus hirsutus, Cerrena maxima, Coriolopsis fulvocinerea a společně kultivované Coriolus hirsutus/Cerrena maxima mohou rozkládat atrazin při submerzní kultivaci; odstranění herbicidu bylo 77-91 % po 40 dnech kultivace. Je zajímavé zmínit, že bylo zjištěno, že na myceliu se absorbuje zanedbatelné množství atrazinu. Aktivita lakázy byla poměrně vysoká, což umožňuje navrhnout účast lakázy na degradaci atrazinu těmito houbami. Tato hypotéza byla podpořena studiem rozkladu atrazinu v přítomnosti induktorů lakasy (guajakol a syringaldezin) při submerzní kultivaci. Účinnost degradace herbicidu byla vyšší u indukovaných kultur o 78-98 % a nejvyšší úrovně odstranění atrazinu bylo dosaženo u Coriolopsis fulvocinerea při použití guajakolu jako induktoru.

Hiratsuka et al. uvedli, že Coriolus versicolor IFO 30340 degradoval 30 % chlornitrofenu (CNP) a 80 % nitrofenu (NIP) po 12 dnech kultivace ve stacionárních podmínkách na tekutém médiu. Míra degradace herbicidů závisela na koncentraci dusíku v médiu a byla vyšší za podmínek s nízkým obsahem dusíku, což naznačuje, že za degradaci herbicidů je zodpovědný ligninový degradační systém. LiP, MnP a lakáza ani kultivační filtrát však herbicidy neoxidovaly. Chlornitrofen ani nitrofen nebyly oxidovány systémem lakáza – redox-mediátor za použití HBT, který je známým redox-mediátorem lakázy. Z těchto výsledků vyplývá závěr, že extracelulární ligninolytické enzymy se nepodílely na počátečním kroku degradace CNP nebo NIP pomocí Coriolus versicolor IFO 30340. Postupná identifikace produktů vznikajících při metabolismu CNP a jeho meziproduktů C. versicolor umožnila autorům navrhnout čtyři různé cesty degradace CNP: aromatickou hydroxylaci, oxidativní dechloraci, reduktivní dechloraci a redukci nitroskupiny na amin. Předpokládali, že aromatická hydroxylace za vzniku 2,4,6-trichlor-3-hydroxy-4′-nitrodifenyletheru a oxidativní dechlorace za vzniku 2,4-dichlor-6-hydroxy-4′-nitrodifenyletheru jsou katalyzovány enzymem (enzymy) typu cytochromu P450, protože tyto cesty byly účinně zastaveny exogenním přídavkem piperonylbutoxidu, inhibitoru P450. Přeměna CNP na NIP pomocí Coriolus versicolor IFO 30340 by měla být reduktivní dechlorací. Reduktivní dechlorační reakce se podílely na rozkladu pentachlorfenolu pomocí P. chrysosporium . CNP byl rovněž přeměněn na 2,4,6-trichlor-4′-aminodifenylether pomocí C. versicolor. Redukční dechlorace a nitroredukční reakce byly rovněž zjištěny jako počáteční reakce při rozkladu CNP, které byly posíleny po přidání inhibitoru cytochromu P450. Během houbové přeměny NIP byla rovněž pozorována aromatická hydroxylace a oxidativní dechlorace; vzniklé produkty však nebyly identifikovány – předpokládá se, že se jedná buď o 2,4-dichlor-3-hydroxy-4′-nitrodifenylether nebo 2,4-dichlor-6-hydroxy-4′-nitrodifenylether a 2-chlor-4-hydroxy-4′-nitrodifenylether nebo 2-hydroxy-4-chlor-4′-nitrodifenylether. Houbová konverze NIP byla rovněž účinně inhibována piperonylbutoxidem.

Na základě získaných výsledků autoři předpokládají, že cytochrom P450 hraje důležitou roli při snižování ionizačního potenciálu environmentálně perzistentních aromatických látek a při poskytování vhodných substrátů pro ligninolytické jednoelektronové oxidační enzymy pro účinný rozklad. Po přidání difenyletheru, 4-chlordifenyletheru a 4-nitrodifenyletheru do houbové kultury byly jako hlavní produkty identifikovány 4-hydroxydifenylether, 4-chlor-4′-hydroxydifenylether a 4-nitro-4′-hydroxydifenylether. 4-chlorfenol a 4-nitrofenol byly zjištěny ve stopovém množství z 4-chlordifenyletheru a 4-nitrodifenyletheru, ale protějšek hydrochinon nebyl pozorován. Tyto údaje naznačují, že tvorba fenolických produktů z kruhu A nebo B CNP může být odvozena jinou cestou a že k přímému štěpení éteru nemuselo dojít. Tato zjištění poskytla důkaz, že houby rozkládaly herbicidy různými cestami pomocí svých vícenásobných metabolických systémů.

Ukázalo se, že Ganoderma lucidum je rezistentní vůči herbicidům diuron a bentazon : horní hranice byla 80 µM a 20 mM. Toto zjištění lze vysvětlit vyšší toxicitou metabolitů vznikajících při transformaci diuronu. Již dříve bylo uvedeno, že některé metabolity vznikající při houbové transformaci diuronu mohou být dokonce toxičtější než mateřská sloučenina . G. lucidum byla schopna účinně odstranit 55 % diuronu a 88 % bentazonu po 10 dnech kultivace v tekutých kulturách. Jak bentazon, tak diuron silně zlepšily produkci lakasy houbou indukující jednu ze dvou izoforem lakasy. Analýza nativní PAGE extracelulárních enzymů ukázala, že zlepšení aktivity lakasy v reakci na herbicidy nebylo způsobeno expresí nové lakasy, ale že bylo způsobeno nadprodukcí již existující izoformy v neindukovaných kulturách. Podobné výsledky byly získány u Trametes versicolor a Abortiporus biennis , kde byly jejich konstitutivní lakasazy nadprodukovány v přítomnosti paraquatu, herbicidu obsahujícího kvartérní dusík. Elektroforetická analýza extracelulárních enzymů z G. lucidum ukázala, že za neindukovaných podmínek je dominantním enzymem lakáza1. Zajímavé je, že herbicidy indukovaly pouze izoformu lakasy2, zatímco lakasa1 byla v těchto kulturách potlačena. Tyto výsledky naznačují, že lakáza2 je pravděpodobně izoforma intenzivněji zapojená do obranného systému houby, vzhledem k tomu, že oba herbicidy silně inhibovaly růst houby. Tato pozorování ukazují, že tyto typy enzymů mají, alespoň částečně, důležitou úlohu při degradaci polutantů v podmínkách in vivo.

Bylo provedeno srovnávací studium degradace herbicidu bentazon Ganoderma lucidum v kapalných a pevných kulturách s použitím kukuřičného klasu jako substrátu . Houba byla odolnější vůči herbicidu a účinnější v jeho degradaci v kulturách v pevném stavu ve srovnání s kulturami v kapalném stavu: 50 mM oproti 20 mM a 90 % oproti 55 %. Autoři navrhli dvě, vzájemně se nevylučující, možná vysvětlení: nižší dostupnost herbicidu v důsledku jeho adsorpce na nerozpustný substrát kukuřičného klasu pro toto pozorování a vyšší aktivity lakázy i Mn peroxidázy v kulturách v pevném stavu ve srovnání s tekutými kulturami, kde byla zjištěna vysoká aktivita lakázy. V kombinovaném vodném a methanolovém extraktu však nebyly nalezeny žádné produkty metabolismu. Na základě těchto výsledků bylo zjištěno, že G. lucidum, které obsahují lakázu a Mn peroxidázu, rozkládají bentazon in vitro. Pokusy s přídavkem Mn2+, ABTS, Tween 80 a H2O2 k surovým filtrátům prokázaly synergismus při degradaci bentazonu, což naznačuje, že se na jeho degradaci podílí jak lakáza, tak Mn peroxidasa. Je známo, že ABTS zprostředkovává oxidaci nefenolických sloučenin ligninu a přítomnost nenasycených mastných kyselin (Tween 80) zlepšuje oxidační proces katalyzovaný Mn peroxidázami a lakasami díky produkci lipidových peroxylových nebo alkoxylových radikálů . Hypotetický mechanismus degradace bentazonu může být následující: Mn peroxidasa a lakasa generují lipidové peroxylové nebo alkoxylové radikály; v přítomnosti těchto radikálů Mn peroxidasa oxiduje Mn2+ na Mn3+, který následně oxiduje bentazon, zatímco lakasa využívá ABTS jako redox-mediátor pro oxidaci bentazonu. V kapalných kulturách však nebyla pozorována žádná degradace pikloramu G. lucidum a Trametes sp., možná v důsledku jeho vysoké substituce aromatického kruhu . Tento herbicid zvýšil produkci lakasy u Trametes sp., zatímco produkce enzymu u G. lucidum byla potlačena. Autoři předpokládali, že k inhibici produkce enzymu mohlo dojít na úrovni mRNA po vstupu pikloramu do buňky nebo modifikací enzymu před nebo po sekreci . Expozice G. lucidum a Trametes sp. pikloramu odhalila zvláštní mechanismus přechodné bioakumulace herbicidu oběma houbami.

Nejvíce studovanou WRF je P. chrysosporium, u které bylo prokázáno, že rozkládá širokou škálu herbicidů za různých podmínek. MCPA a bentazon byly degradovány P. chrysosporium z 65 % a 75 % za 20 dní . P. chysosporium degradovalo isoproturon patřící do skupiny fenylurey , atrazin a také diuron . Podle , však nebyla u této houby v kapalných kulturách pozorována žádná degradace atrazinu. Účinnost rozkladu P. chrysosporium byla vyšší v pevných kulturách ve srovnání s kapalnými . Byly navrženy dva mechanismy degradace herbicidů: působení ligninolytických enzymů a působení intracelulárních enzymů, zejména cytochromu P450. V , byl studován rozklad diuronu pomocí P. chrysosporium včetně identifikace vznikajících produktů a hodnocení úlohy cytochromu P450. Velký význam měly dva poznatky: značné množství diuronu, DCPMU a DCPU zjištěné v čerstvém myceliu a inhibice rozkladu diuronu pomocí ABT (1-aminobenzotriazolu), inhibitoru cytochromu P450. Tyto výsledky potvrdily intracelulární mechanismus degradace tohoto herbicidu vedoucí k N-demetylaci. Po 5 dnech však byly koncentrace DCPMU a DCPU vyšší ve filtrátech kultur než v extraktech mycelia, což naznačuje možné zapojení lignolytických enzymů do degradace těchto metabolitů. Podle da Silva Coelho-Moreira a kol. enzymové surové extrakty dodané kombinací veratrylalkoholu H2O2 a Mn2+ herbicid nedegradovaly, je možné, že DCPMU a DCPU mohou být dále transformovány MnP.

P. chrysosporium je také schopno transformovat atrazin, jeho transformační produkt a další s-triazinové herbicidy. Prvním a hlavním krokem v cestě degradace chlorovaných s-triazinů touto houbou byla mono-N-dealkylace. Hydroxyatrazin byl hlavním degradačním produktem zjištěným v půdě ošetřené atrazinem a v kapalných kulturách. P. chrysosporium aktivně transformovalo hydroxyatrazin na neznámou sloučeninu, která se hromadila v kultivačním médiu. Bylo zjištěno, že pro mono N-dealkylaci atrazinu bakterií P. chrysosporium je nezbytná přítomnost alkylových skupin i chloru v poloze 2-. V důsledku toho by tvorba desethylhydroxyatrazinu v tekutých kulturách měla být výsledkem hydrolýzy deethylatrazinu. Pokusy s terbuthylazinem, atrazinem a simazinem rovněž ukazují, že odstranění ethylového postranního řetězce je přednostní reakcí a může záviset na hmotnosti druhé alkylové skupiny. Jinými slovy, u sloučenin s vysokohmotnostní skupinou navázanou na jeden aminosubstituent se očekává vyšší míra N-dealkylace ovlivňující druhý řetězec. Symetrické sloučeniny propazin a simazin byly rovněž degradovány pomaleji než atrazin. LiP ani MnP netransformovaly atrazin a jeho N-dealkylované metabolity. Ukázalo se, že N-dealkylace atrazinu se snižuje v přítomnosti inhibitoru cytochromu P450. Degradace herbicidu byla navíc podporována myceliem. Proto se předpokládalo zapojení cytochromu P450 do rozkladu atrazinu. Tyto údaje jsou v souladu s dříve publikovanou studií degradace atrazinu Pleurotus pulmonarius, na které se podílely takové enzymy jako lipoxygenáza, peroxidáza a cytochrom P-450 . Mn2+, který tyto enzymy aktivuje, stimuloval přeměnu atrazinu na N-dealkylované a propylhydroxylované metabolity, zatímco antioxidanty a inhibitory lipoxygenázy a peroxidázy (kyselina nordihydroguaiaretická) i cytochromu P-450 (piperonylbutoxid) jeho rozklad potlačovaly.

Pro analýzu údajů uvedených v tabulce 2 byla vypočtena rychlost vymizení herbicidu jako poměr vymizení (%) a doby trvání degradace (dny), následoval výpočet průměrné hodnoty pro každý herbicid (obr. 1). S ohledem na vliv kultivačních podmínek na degradaci herbicidů houbami byly takto zpracovány pouze údaje o stacionárních podmínkách na tekutých médiích.

Získané výsledky dobře korespondují se studií , kde bylo zjištěno, že přítomnost alkylových skupin je nezbytná pro rozklad s-triazinových herbicidů P. chrysosporium prostřednictvím mono N-dealkylace. Navíc se zdá, že schopnost WRF hub rozkládat s-triaziny se zvyšuje spolu se zvyšováním množství přesně rozvětvených alkylových skupin. K potvrzení nebo vyvrácení tohoto předběžného pozorování by však měly být provedeny podrobné kvantitativní studie struktury a degradační aktivity. Dalším důležitým závěrem je výrazný negativní vliv chloru v molekule herbicidu na rychlost degradace, což je patrné ze srovnání rychlosti degradace nitrofenu (jeden atom chloru) a klornitrofenu (tři atomy chloru) a nejvyšší rychlosti degradace bentazonu, který je jediným herbicidem bez chloru v prezentovaném rozsahu (obr. 1). Údaje uvedené na obr. 1 tedy jasně ukazují na nejnutnější další studie QSAR. Ty spolu s poznatky o hlavních enzymatických cestách degradace herbicidů výrazně zlepší předběžné posouzení degradační schopnosti WRF ve vztahu k herbicidům známé struktury.

Rozporuplné údaje o účasti ligninolytických enzymů na degradaci a transformaci herbicidů neumožnily stanovit jejich přesnou úlohu v těchto procesech . V tabulce 3 jsme shrnuli údaje o účinnosti jednotlivých ligninolytických enzymů, jejich směsí a systémů enzym – redox-mediátor při degradaci herbicidů. Jak je vidět, u surových extraktů MnP a LiP a purifikovaných enzymů z P. chrysosporium, Trametes versicolor a Coriolus versicolor nebyla pozorována degradace diketonitrilu, diuronu, atrazinu, chloronitrofenu, nitrofenu a glyfosátu ani v přítomnosti redox-mediátorů . MnP z P. chrysosporium však rozložil Irgarol 1081 až na 37 % po 24 h a LiP z P. chrysosporium rozložil bentazon až na 100 % po 4 h . Kromě toho byl bentazon účinně transformován lakasou s katecholem, lakasou a surovými extrakty MnP s redox-mediátorem ABTS, rekombinantním MnP . Analýza údajů shrnutých v tabulce 3 vede k závěru, že MnP, lakasy a systémy lakasy – redox-mediátor jsou nejúčinnějšími nástroji pro rozklad široké škály herbicidů – diketonitrilu, glyfosátu, Pesticide Mix 34, chloroxuronu, atrazinu a dymronu , avšak s několika výjimkami, a to choronitrofenu a nitrofenu . Je třeba zdůraznit, že účinnost systémů lakáza – redox-mediátor vůči různým herbicidům silně závisí na použitém redox-mediátoru, což zase závisí na mechanismech oxidace mediátorů enzymem a reaktivitě meziproduktů mediátorů.

Při studiu degradace atrazinu pomocí purifikované lakázy z Coriolopsis fulvocinerea, nebyla pozorována žádná degradace herbicidu (Koroleva & Gorbatova, nepublikované údaje). Screening redoxních mediátorů (syringaldezin, PF6, , HBT) ukázal, že pouze HBT způsobil pokles koncentrace atrazinu v systému lakáza-atrazin-redoxní mediátor. Podrobnější studium složek modelového systému „atrazin/lakáza/HBT“ ukázalo, že HBT sám reagoval s atrazinem a dalšími deriváty atrazinu obsahujícími chlor přímo, bez účasti lakázy, a neinteragoval s hydroxyderiváty atrazinu. Je známo, že HBT může ve vodném roztoku přecházet do iontové formy. Proto se předpokládá, že za vzniku (-N-O-C-) vazeb v poloze (2) atrazinu mohou vznikat dva produkty, oba sestávající z HBT a atrazinu. Přidání lakasy k roztoku HBT/Atr vedlo ke vzniku několika produktů, z nichž jeden měl retenční čas shodný s retenčním časem sloučeniny HBT-Atr. Při enzymatických reakcích vznikly další dva produkty s retenčními časy 15,3 min a 19,4 min, které byly identifikovány jako deethylatrazin (DEA) a sloučenina vzniklá interakcí DEA a HBT. Přídavek enzymu tedy vedl ke vzniku nových produktů odlišných od produktů vznikajících při reakci HBT s atrazinem. Modelový systém „atrazin/lakasa/HBT“ byl studován při různých molárních poměrech atrazin/mediátor (9:1 až 1:9) a při dvou různých koncentracích enzymu (0,02 μm a 1,0 μm). Nejhlubší konverze atrazinu – až 70 % za 10 dní – byla pozorována při poměru HBT/Atr 9/1 a koncentraci enzymu 0,02 μm. Protonová nukleární magnetická rezonance (1H-NMR) a HPLC-MS/MS umožnily potvrdit identifikaci produktu v modelových systémech „Atr/HBT“ a „Atr/HBT/laccase“: vznik Atr-HBT v systému „Atr/HBT“ a DEA a DEA-HBT v systému „Atr/HBT/laccase“. Atr-HBT existoval ve dvou formách: protonovaný (M.W. 315 g/mol) a diprotonovaný (M.W. 316 g/mol). V reakci „Atr/HBT/laccase“ vzniká DEA, jakož i protonovaná (M.W. 287 g/mol) a diprotonovaná (M.W. 288 g/mol) forma produktu DEA-HBT. Na základě údajů získaných pro pět zjištěných struktur produktů jsme navrhli schéma oxidace atrazinu systémem „lakasa/HBT“ (obr. 2), které zahrnuje neenzymatickou a enzymatickou fázi (obr. 3).

V průběhu neenzymatické fáze vzniká produkt sestávající z atrazinu a HBT. Protože substráty a produkty v systému „Atr/HBT“ jsou v rovnováze, přídavek lakázy do reakce způsobí oxidaci HBT a tvorbu radikálu HBT. Radikál HBT reaguje se sloučeninou Atr-HBT a spouští disociaci vazeb (-NH-CH-), což vede ke vzniku DEA-HBT a ethylalkoholu. DEA-HBT se následně rozkládá za vzniku dvou produktů: DEA a HBT. Schopnost HBT tvořit tautomerní formy a přímo reagovat s atrazinem naznačuje, že HBT se v reakční směsi rozkládá. Podle navrženého schématu však během hydrolýzy DEA-HBT vznikly DEA a HBT. To může být jedním z důvodů účinnosti HBT jako redox-mediátoru v systému lakáza – redox-mediátor.

Vysoký potenciál WRF i jejich ligninolytických enzymů při transformaci herbicidů je dobře zdokumentován. Nicméně mechanismy rozkladu a cesty rozkladu mnoha herbicidů nejsou dosud prozkoumány. K objasnění mechanismu rozkladu herbicidů pomocí WRF a ligninolytických enzymů a identifikaci vznikajících metabolitů jsou zapotřebí další studie

.