ORIGINAL PAPER

Biokemisk och farmakologisk undersökning av gift från vargspindeln Lycosa singoriensis

Liu ZHI; Qian WII; Li JI; Zhang YI; Liang SI

ICollege of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha, China
IIAdministrative Center for Basic Research, Ministry of Science ant Technology, China

Correspondence to

ABSTRACT

Vargspindeln Lycosa singoriensis är en stor och giftig spindel som är spridd i hela nordvästra Kina. Liksom andra spindelgifter är vargspindelns gift en kemisk cocktail. Dess proteinhalt är 0,659 mg protein/mg rått gift enligt Lowry-metoden. MALDI-TOF-analys visade att giftpeptiderna är mycket varierande och kan delas in i tre grupper som kännetecknas av tre oberoende molekylära intervall: 2 000-2 500 Da, 4 800-5 500 Da respektive 7 000-8 000 Da. Denna molekylära fördelning skiljer sig avsevärt från de molekylära fördelningarna i de flesta spindelgifter som hittills har studerats. Detta vargspindelgift har låg neurotoxisk verkan på möss, men kan framkalla hemolys av mänskliga erytrocyter. Dessutom visar giftet antimikrobiell aktivitet mot prokaryota och eukaryota celler.

Nyckelord: spindel, Lycosa singoriensis, rått gift, MALDI-TOF, antimikrobiell aktivitet.

INTRODUKTION

Det finns cirka 39 000 beskrivna spindelarter, med ett ännu större antal som väntar på karakterisering. Nästan alla spindlar är rovdjur och har giftkörtlar. Det främsta syftet med spindelns gifter är att döda eller paralysera bytet. Spindelns gifter är komplexa kemiska cocktails där peptider är de viktigaste beståndsdelarna i de flesta spindelns gifter, med undantag för spindelns svarta änka som innehåller en stor andel, mer än 100 kD proteiner (1-3). Spindelgiftens peptider framställs på ett kombinatoriskt sätt, vilket leder till att det uppskattningsvis finns totalt cirka 1,5 miljoner spindelgiftens peptider. Spindelgifter är följaktligen en rik källa till farmakologiskt och agrokemiskt intressanta nya föreningar som har fått ökad uppmärksamhet av farmakologer och biokemister under de senaste åren. Under de senaste decennierna har dock endast ett fåtal spindelns giftämnen studerats tillräckligt ingående, och därför har mindre än 0,01 % av spindelns giftpeptider hittills identifierats (4-7).

Vargspindeln Lycosa singoriensis är en stor spindel som är spridd i hela nordvästra Kina. Den vuxna honspindeln har en kroppslängd från 28 till 40 mm (35±6 mm) och en kroppsvikt från 2,6 till 7 g (figur 1). Denna håriga spindel lever i hålor under jord. Dess hålor, som är fodrade med ett silkesrör, har en diameter på 2-4 cm och en längd på 30-60 cm, och ingången till hålan är ofta täckt med ett silkesnät. Spindeln tillbringar dagen hopkrupen på botten av hålet, medan den klättrar upp i silkesröret och gömmer sig nära ingången till hålan i väntan på ett byte på natten. När spindeln har lyckats fånga offer tar den in dem i hålet. I många fall finns rester av små insekter på botten av hålan. Vargspindeln Lycosa singoriensis är också en giftig och aggressiv spindel. År 2000 rapporterades det om vargspindelbett på människor och andra djur i det norra området i Xinjiangprovinsen. Enligt kliniska journaler orsakade majoriteten av spindelbetena uppenbara effekter, bland annat röda märken och smärta runt bettställena (8, 9).

I den här studien rapporterar vi de biokemiska och farmakologiska egenskaperna hos giftet från vargspindeln Lycosa singoriensis. Jämfört med många andra spindelgifter som hittills studerats har denna spindelgift vissa distinkta egenskaper, vilket gör den till en användbar källa för screening av läkemedelsspår och för att studera den biologiska mångfalden av spindelgiftspeptider.

MATERIAL OCH METODER

Spindlar och giftinsamling

Vuxna honspindlar av Lycosa singoriensis samlades in i Xinjiang-provinsen i Kina, hölls i plasthinkar som täcktes med plastnät och gavs vatten dagligen. Hackad grislever och maskar användes som foder till djuren. Liksom många andra stora spindlar (10, 7) blir Lycosa singoriensis lätt aggressiva när de provoceras av en bit plastslang. De griper hårt tag i slangen och sedan genomborrar dess gifttänder slangen och injicerar gift inuti. På detta sätt undviker man behovet av elektrisk stimulering, som kan förorena giftet med enzymer från både saliv och matsmältningsvätska. Genom att använda denna metod kan man få fram cirka 50 mg gift från cirka 300 Lycosa singoriensis-spindlar, vilket gör det möjligt att utforska de biokemiska och farmakologiska egenskaperna hos detta spindelns gift. Det råa giftet är en klar och färglös vätska som är lättlöslig i vatten och samlades in varannan vecka. Frystorkat rått gift förvarades vid -20 °C före analys.

SDS-PAGE-analys av rått gift

Natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) på det insamlade giftet utfördes under denaturerade förhållanden i en 10-procentig polyakrylamidplattagel. Hundra mikrogram av lyofiliserat gift användes för elektrofores och de separerade proteinerna i gelen visualiserades med G250-färgning.

MALDI-TOF-analys av rått gift

Det råa giftfingeravtrycket bestämdes med hjälp av MALDI-TOF-masspektrometri (Matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight) (Voyager-DE STR Biospectometry®-arbetsstation, Applied Biosystems, USA). Jonisering uppnåddes genom bestrålning med en kvävelaser (337 nm) vid en accelerationsspänning på 20 kV; α-cyano-4-hydroxikinnamsyra (CCA) användes som matris.

Den effekt som rått gift har på isolerade nerv-synapsepreparat

Tre typer av isolerade nerv-synapsepreparat – musens freniska nerv-diaphragma, råttans vas deferens och paddans hjärta – användes för att undersöka den farmakologiska aktiviteten hos det råa giftet. Försöken med preparatet av musens freniska nerv-diaphragma utfördes enligt Bülbring (11). Vas deferens-försök och paddhjärtförsök utfördes enligt Liang et al. (12).

Hemolytisk test

Hemolytisk aktivitet hos det råa giftet testades med hepariniserade mänskliga röda blodkroppar som sköljdes tre gånger i 5 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS – 50 mM NaH2PO4 och 150 mM NaCl, pH 7,2) och centrifugerades i 5 minuter vid 3 000 rpm. Röda blodkroppar inkuberades sedan i rumstemperatur i 1 timme i avjoniserat vatten (positiv kontroll), i PBS (blank) eller med gifter i olika koncentrationer (3,1 till 20 mg/mL) i PBS. Proverna centrifugerades vid 12 000 rpm i 5 minuter. Supernatanten separerades från pelletsen och dess absorbans mättes vid 570 nm.

Antimikrobiell aktivitet hos rått gift

Sex bakterier (Bacillus cereus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus albus och E. coli DH5) och två svampar (Saccaromyces cerevisae och Candida albicans) odlades i odlingsmediet tills de nådde exponentiell fas med en absorbans vid 600 nm på 0,3-0,8. Femtio mikroliter av mediet spreds jämnt på tre stycken fasta agarplattor. Plattorna kompletterades med 1,5 % agaros/medium som hälldes i 100 × 20 mm sterila petriskålar. Ett filterpapper med en diameter på 6 mm täckte plattorna. Fem mikroliter giftlösning i normal koksaltlösning i olika koncentrationer placerades på filterpappret. Efter inkubation vid 37 °C över natten registrerades effekterna av det råa giftet som tydliga cirklar i bakteriegräset på filterpappret.

I denna bioassay droppades därför råa giftlösningar i olika koncentrationer (3 mg/ml, 6 mg/ml och 12 mg/ml) på filterpappret, och en tydlig cirkel kunde upptäckas på pappret om giftet i den koncentrationen hade inhiberat den mikrobiella tillväxten.

RESULTAT OCH DISKUSSION

Biokemisk karakterisering av rått gift

Det konstaterades att varje milligram rått gift innehåller cirka 0,659 mg protein/peptider. Som visas i figur 2 är proteinerna med hög molekylmassa i det råa giftet huvudsakligen fördelade på molekylmassor som sträcker sig från 14 till 31 000 Da, med ett tjockt proteinband nära 20 000 Da och ett annat band tydligt nära 14 000 Da. Ett tjockt band syns också överst på panelen i SDS-PAGE-gelen som består av peptider med en molekylmassa på mindre än 10 000 Da. De proteiner/peptider som distribueras i de två tjocka banden är de vanligaste komponenterna i det råa giftet, vilka motsvarar 80 % av proteinkomponenten i det råa giftet.

Nyligen tillämpades MALDI-TOF masspektrometri för att belysa komplexiteten hos giftpeptiderna. I och med den snabba utvecklingen av masspektrometri har denna teknik dessutom använts i stor utsträckning inom giftforskningen (5, 13). Pierre Escoubas et al. (5) målade till exempel upp en giftbild för att konceptualisera komplexiteten hos gifter från australiska trattformsspindlar genom att använda en kombinerad cDNA- och masspektrometrisk metod. Deras studier visar att gifter från dessa spindlar innehåller många hundra peptider som följer en bimodal fördelning, med majoriteten av peptiderna i massområdet 3 000-5 000 Da och en andra mindre uttalad grupp i området 6 500-8 500 Da. Denna fördelning av molekylära massor är analog med den som tidigare observerats för ett stort antal tarantulagifter (4). Liknande resultat hittades också i våra tidigare studier av gifter från de kinesiska tarantelspindlarna Ornithoctonus huwena, Ornithoctonus hainana och Chilobrachys jingzhao (14-16).

Som presenteras i figur 3 visar MALDI-TOF-spektrometrianalysen av det råa giftet från Lycosa singoriensis att fördelningen av molekylmassan observeras på ett analogt sätt i intervallet från 1 000 till 10 000 Da. Till skillnad från de tidigare nämnda arterna kan dock Lycosa singoriensis giftpeptider delas in i tre grupper utifrån deras massa. Den första gruppen består av peptider med en molekylmassa på mellan 2 000 och 2 500 Da, vilket innebär att de har cirka 20 aminosyrarester. Detta molekylmassaområde har sällan observerats i de flesta spindelns gifter som studerats hittills. Den andra gruppen omfattar huvudsakligen peptider med molekylmassor i intervallet 4 800-5 500 Da, vilket tyder på att de består av cirka 50 aminosyrarester. Den tredje gruppen består av peptider med en massa mellan 7 000 och 8 000 Da, vilket motsvarar mer än 60 aminosyrarester. Det uppskattas att peptider som fördelas i de två sistnämnda grupperna utgör majoriteten av giftpeptiderna.

Interessant nog är det ganska få peptider som har molekylmassor mellan 3 000 och 5 000 Da. Paradoxalt nog är peptider i detta massintervall den vanligaste komponenten i många andra spindelgifter. Ytterligare studier skulle behövas för att belysa dessa diskrepanser, vilket kan bidra till att förstå den evolutionära mekanismen för peptiderna i spindelns gift. Den aktuella studien bidrar till att bevisa att Lycosa singoriensis peptider är mycket diversifierade.

Analysen av cDNA-bibliotek med giftkörtlar gav mer än 200 toxinliknande peptidsekvenser. Massfördelningen av dessa peptider som härrör från cDNA-sekvenser överensstämmer med den som observerats med MALDI-TOF-spektrometri. Dessutom visade analysen av sekvenserna att peptiderna i den första gruppen inte har några cysteinrester och att peptiderna i den andra gruppen innehåller 4 eller 5 disulfidbindningar, medan peptiderna i den sista gruppen har mer än 5 disulfidbindningar (opublicerade uppgifter). De flesta spindelpeptidtoxiner som hittills har identifierats har vanligtvis 3 eller 4 disulfidbindningar och deras 3D-strukturer antar det klassiska inhibitoriska cystin-knutmotivet. Följaktligen finns det anledning att tro att vissa peptider från Lycosa singoriensis gift skulle ha ett nytt strukturellt tema.

Farmakologisk karakterisering av rått gift

Det råa giftet, vid en hög dos på 200 µg/mL, kunde inte blockera den elektriskt stimulerade sammandragningen av preparatet av frenikusnervens diafragma hos mus (n = 5). Det uppvisade också en låg effekt på ryckresponsen hos vas deferens hos råttor. Koncentrationen av 200 µg/mL rå gift kunde endast delvis hämma ryckreaktionen i 20 minuter (n = 5) (figur 4 – A). Däremot kunde det råa giftet från spindeln O. huwena i samma koncentration snabbt blockera ryckreaktionen hos samma preparat av nerv och diafragma eller hos vas deferens hos råttor (data visas inte). Lycosa singoriensis rått gift hade dock en signifikant effekt på paddahjärtkontraktion. I närvaro av 100 µg/mL rå gift ökade hjärtats hastighet och styrka kraftigt (n = 5) (figur 4 – B). Detta tyder på att det råa giftet innehåller vissa föreningar som är kardiotoniska.

För närvarande klassificeras kardiotoniska medel i tre klasser baserat på deras subcellulära verkningsmekanismer, nämligen medel som verkar genom mekanismer i uppströmsledet (Ca2+-mobilisatorer) samt centrala och nedströmsledda mekanismer (Ca2+-sensibiliserare). Dessa medel inducerar en positiv inotropisk effekt genom att höja den intracellulära Ca2+-jonkoncentrationen (17). Hittills finns det ingen rapport om en kardiotonisk effekt av gifter från vargspindlar samtidigt som inga kardiotoniska föreningar ännu har renats och karakteriserats från dessa gifter. Därför är det viktigt att undersöka de kardiotoniska föreningarna från Lycosa singoriensis gift.

Den hemolytiska aktiviteten hos det råa giftet bestämdes genom att använda färska mänskliga erytrocyter. Som framgår av figur 5 (A) splittrade det råa giftet mänskliga erytrocyter på ett dosberoende sätt. Dess effektiva koncentration för 50 % hämning (EC50) är 1,25 mg/mL.

Som rapporterats av Budnik et al. (18) innehåller det råa giftet från Lycosa singoriensis antimikrobiella peptider (benämnda lycocitiner 1, 2 och 3) som kan hämma tillväxten av gram-positiva och gramnegativa bakterier och svampar vid mikromolära koncentrationer. Vi testade därför den antimikrobiella aktiviteten hos det råa giftet mot både prokaryotiska och eukaryotiska celler med hjälp av en test för att hämma platttillväxt. Under våra bioassayförhållanden var de cellstammar som var mest känsliga för det råa giftet särskilt Bacillus subtilis och Staphylococcus sp, där tillväxten hämmades kraftigt vid 3 mg/ml. Giftet verkade också starkt mot Corynebacterium glutamicum och Micrococcus luteus men svagt mot en av svampstammarna (Candida albicans). Det råa giftet hade dock ingen påvisbar effekt på E. coli och Saccaromyces cerevisae även vid den höga koncentrationen 12 mg/mL (figur 5 – B).

Under de senaste tio åren har många antimikrobiella peptider identifierats från spindelns gift. Lycotoxiner I och II identifierades i giftet från vargspindeln Lycosa carolinensis. Båda är linjära antimikrobiella peptider som uppvisar den amfipatiska α-helix-karaktär som är typisk för porbildande peptider. Deras porbildande mekanism verifierades ytterligare genom att de främjade utflödet av kalciumjoner från synaptosomer (19). Efter lykotoxinerna har även cupienniner (20-22) och oxyopininer (23, 24), från giftet från vargspindlarna Cupiennus salei respektive Oxyopes kitabensis, visat sig ha antimikrobiell verkan. Nyligen renades sju nya korta linjära antimikrobiella och cytolytiska peptider som kallas latarciner från giftet från spindeln Lachesana tarabaevi. Dessutom förutsades fem nya peptider som har betydande strukturella likheter med de renade latarcinerna från expressed sequence tag-databasen för spindelns giftkörtlar (25).

Dessa peptider från spindelns gifter tillhör linjära katjoniska α-helikala antimikrobiella peptider. Denna klass av antimikrobiella peptider har vissa gemensamma egenskaper, t.ex. att de hämmar mikrobiell tillväxt vid låga mikromolära koncentrationer och bildar amfipatiska och kationiska helikala bildningar i hydrofoba miljöer. Under de senaste decennierna har ett stort antal antimikrobiella peptider, inklusive linjära katjoniska α-helikala antimikrobiella peptider, upptäckts hos såväl djur som växter. Dessa peptider består vanligtvis av 12-45 aminosyror och spelar viktiga roller i de flesta levande organismers medfödda immunsystem (26-28). De flesta av dem kan döda mikroorganismer med följande fyra egenskaper: selektiv toxicitet, snabb avdödning, brett antimikrobiellt spektrum och ingen resistensutveckling (29-31).

Sammanfattningsvis rapporterar vi nya biokemiska och farmakologiska fynd om giftet från vargspindeln Lycosa singoriensis. De distinkta egenskaperna hos peptiderna i detta gift gör det till en idealisk modell för att studera de evolutionära mekanismerna hos spindelns giftpeptider. Den farmakologiska studien av detta gift är till hjälp för att rena och karakterisera bioaktiva peptider i fortsatta studier.

ÅTERKÄNSNINGAR

Detta arbete stöddes av National Science Foundation Projects (30430170 och 30700127).

1. Corzo G, Escoubas P. Farmakologiskt aktiva peptidtoxiner från spindlar. Cell Mol Life Sci. 2003;60(11):2409-26.

2. Escoubas P. Molekylär diversifiering i spindelgift: ett nät av kombinatoriska peptidbibliotek. Mol Divers. 2006;10(4):545-54.

3. King GF. Spindlarnas underbara värld: Förord till det särskilda Toxicon-numret om spindelgifter. Toxicon. 2004;43(5):471-5.

4. Escoubas P, Rash L. Tarantlar: åttabenta farmaceuter och kombinatoriska kemister. Toxicon. 2004;43(5):555-74.

5. Escoubas P, Sollod B, King GF. Venom landscapes: utvinning av komplexiteten hos spindelns gifter genom en kombinerad cDNA- och masspektrometrisk metod. Toxicon. 2006;47(6):650-63.

6. Sollod BL, Wilson D, Zhaxybayeva O, Gogarten JP, Drinkwater R, King GF. Var spindeldjur de första som använde kombinatoriska peptidbibliotek? Peptider. 2005;26(1):131-9.

7. Tedford HW, Sollod BL, Maggio F, King GF. Australiensiska spindlar: mästerliga insektskemister. Toxicon. 2004;43(5):601-18.

8. Lu DL, Zhang DF. Två typer av giftiga spindlar i Xinjiang samt förebyggande och behandling av spindelbett. Chin J Zool. 2001;36(5):40-2.

8. Första observation av levnadsvanor hos Lycosa singorensis. Chin J Zool. 2004;39:63-7.

10. Liu Z, Dai J, Dai L, Deng M, Hu Z, Hu W, Liang S. Funktion och lösningsstruktur för huwentoxin-X, en specifik blockerare av kalciumkanaler av N-typ, från den kinesiska fågelspindeln Ornithoctonus huwena. J Biol Chem. 2006;281(13):8628-35.

11. Bulbring E. Observationer om det isolerade diafragmapreparatet från den freniska nervens diafragma hos råttan. Br J Pharmacol Chemother. 1946;1(1):38-61.

12. Liang SP, Chen XD, Shu Q, Zhang Y, Peng K. Den presynaptiska aktiviteten hos huwentoxin-I, ett neurotoxin från giftet från den kinesiska fågelspindeln Selenocosmia huwena. Toxicon. 2000;38(9):1237-46.

13. Guette C, Legros C, Tournois G, Goyffon M, Célérier ML. Peptidprofilering med hjälp av matrixassisterad laserdesorption/jonisering med time-of-flight-masspektrometri av Lasiodora parahybana tarantulas giftkörtlar. Toxicon. 2006;47(6):640-9.

14. Liang S. An overview of peptide toxins from the venom of the Chinese bird spider Selenocosmia huwena Wang . Toxicon. 2004;43(5):575-85.

15. Liao Z, Cao J, Li S, Yan X, Hu W, He Q, Chen J, Tang J, Xie J, Liang S. Proteomisk och peptidomisk analys av giftet från den kinesiska fågelspindeln Chilobrachys jingzhao. Proteomics. 2007;7(11):1892-907.

16. Yuan C, Jin Q, Tang X, Hu W, Cao R, Yang S, Xiong J, Xie C, Xie J, Liang S. Proteomisk och peptidomisk karakterisering av giftet från den kinesiska fågelspindeln Ornithoctonus huwena Wang. J Proteome Res. 2007;6(7):2792-801.

17. Endoh M. A Na+ channel agonist: a potential cardiotonic agent with a novel mechanism? Br J Pharmacol. 2004;143(6):663-5.

18. Budnik BA, Olsen JV, Egorov TA, Anisimova VE, Galkina TG, Musolyamov AK, Grishin EV, Zubarev RA. De novo-sekvensering av antimikrobiella peptider isolerade från giftkörtlarna hos vargspindeln Lycosa singoriensis. J Mass Spectrom. 2004;39(2):193-201.

19. Yan L, Adams ME. Lykotoxiner, antimikrobiella peptider från gift från vargspindeln Lycosa carolinensis. J Biol Chem. 1998;273(4):2059-66.

20. Kuhn-Nentwig L, Dathe M, Walz A, Schaller J, Nentwig W. Cupiennin 1d: den cytolytiska aktiviteten beror på den hydrofoba N-terminen och moduleras av den polära C-terminen. FEBS Lett. 2002;527(1-3):193-8.

21. Kuhn-Nentwig L, Muller J, Schaller J, Walz A, Dathe M, Nentwig W. Cupiennin 1, en ny familj av högbasiska antimikrobiella peptider i giftet från spindeln Cupiennius salei (Ctenidae). J Biol Chem. 2002;277(13):11208-16.

22. Pukala TL, Doyle JR, Llewellyn LE, Kuhn-Nentwig L, Apponyi MA, Separovic F, Bowie JH. Cupiennin 1a, en antimikrobiell peptid från giftet från den neotropiska vandringsspindeln Cupiennius salei, hämmar också bildandet av kväveoxid genom neuronalt kväveoxidsyntas. FEBS J. 2007;274(7):1778-84.

23. Corzo G, Villegas E, Gomez-Lagunas F, Possani LD, Belokoneva OS, Nakajima T. Oxyopininer, stora amfipatiska peptider isolerade från giftet från vargspindeln Oxyopes kitabensis med cytolytiska egenskaper och positivt insekticidalt samarbete med spindelns neurotoxiner. J Biol Chem. 2002;277(26):23627-37.

24. Nomura K, Corzo G. Effekten av bindningen av antimikrobiella peptider från spindlar, oxyopininer, på lipidmembran. Biochim Biophys Acta. 2006;1758(9):1475-82.

25. Kozlov SA, Vassilevski AA, Feofanov AV, Surovoy AY, Karpunin DV, Grishin EV. Latarciner, antimikrobiella och cytolytiska peptider från giftet från spindeln Lachesana tarabaevi (Zodariidae) som exemplifierar biomolekylär mångfald. J Biol Chem. 2006;281(30):20983-92.

26. Brogden KA. Antimikrobiella peptider: porbildare eller metaboliska hämmare i bakterier? Nat Rev Microbiol. 2005;3(3):238-50.

27. Brown KL, Hancock RE. Kationiska värdförsvarspeptider (antimikrobiella peptider). Curr Opin Immunol. 2006;18(1):24-30.

28. Zasloff M. Antimikrobiella peptider från flercelliga organismer. Nature. 2002;415(6870):389-95.

29. Matsuzaki K. Varför och hur utnyttjas peptid-lipidinteraktioner för självförsvar? Magaininer och tachyplesiner som arketyper. Biochim Biophys Acta. 1999;1462(1-2):1-10.

30. Mcphee JB, Hancock RE. Funktion och terapeutisk potential hos värdförsvarspeptider. J Pept Sci. 2005;11(11):677-87.

31. Mookherjee N, Hancock RE. Kationiska värdförsvarspeptider: medfödda immunreglerande peptider som en ny metod för behandling av infektioner. Cell Mol Life Sci. 2007;64(7-8):922-33.

Korrespondens till: Korrespondens:
Songpiing Liang
College of Life Sciences, Hunan Normal University
Changsha, Hunan, 410081, Kina.
Telefon: +86 731 8872556. Fax: +86 731 8861304.
Email: [email protected].