För att förstå IRE1a-XBP1-vägens roll använde vi oss i den här studien av en modell för in vitro-differentiering av Th2 (Fig. 1b). Naiva T-hjälparceller aktiverades genom TCR-aktivering i anti-CD3e/CD28-belagda plattor under Th2-differentieringsbetingelse i 72 h, vilade i 42 h och restimulerades genom TCR-aktivering med hjälp av anti-CD3e/CD28-belagda plattor. För att störa IRE1a-XBP1-vägen använde vi ett väletablerat läkemedel 4μ8c som specifikt blockerar vägen genom att hämma IRE1a endonukleasaktivitet . Läkemedlet tillsattes till odlingsmedierna i en koncentration på 15-μM i början av odlingen och under passagen från aktiveringsplattan till viloplattan. Valet av läkemedelskoncentration bestämdes av dess högsta IRE1a-hämningseffektivitet med lägsta celltoxicitet (Additional file 1: Figur S1). Vi jämförde transkriptom av naiva och restimulerade Th2-lymfocyter (läkemedelsbehandlade och obehandlade) genom RNA-sekvensering, identifierade XBP1-transkriptionsfaktorns bindningsställen i reaktiverade Th2 genom ChIPmentering (ChIP-sekvensering) och integrerade data över hela genomet för att förutsäga direkta mål och deras reglerande roll.

T-hjälparceller sätter igång IRE1a-XBP1-vägen under in vitro-aktivering

Aktiverade och differentierade T-hjälparceller utsöndrar ett överflöd av cytokiner. Därför är ett välutvecklat sekretoriskt maskineri en förutsättning för att cellerna ska kunna anpassa sig till denna sekretoriska stress. För att förutsäga om ER-stress/UPR-vägen är involverad under aktivering av T-hjälparceller jämförde vi transkriptom av naiva och differentierade Th2-celler (restimulerade Th2). Differentiellt uttryckta gener som erhållits från denna jämförelse integrerades i KEGG-banan ”Protein Processing in the Endoplasmic Reticulum” för att visualisera de komponenter som är upp- eller nedreglerade. Analysen visar att när naiva T-hjälparceller aktiveras och differentieras till Th2-celler uppreglerar de uttrycket av gener som är involverade i ER-stressvägen (Additional file 1: Figur S2). Flera faktorer som tidigare har karakteriserats som kontrollanter av proteinveckning och sekretion, inklusive själva XBP1, uppregleras under differentiering av T-hjälparceller.

För att validera denna förutsägelse, och specifikt undersöka inblandningen av IRE1a-XBP1-vägen, mätte vi IRE1a mRNA- och proteinuttryck i Th2-lymfocyter som differentierats och reaktiverats in vitro (fig. 1b). Cellerna analyserades med qPCR och Western blot för att jämföra mRNA respektive protein. Vi fann att både mRNA- och proteinnivån var uppreglerad i aktiverade T-hjälparceller (Fig. 1c, vänster och mellersta panelen). Det är känt att fosforylering av IRE1a anger dess funktionella tillstånd. Vi observerade att proteinet fosforyleras i aktiverade Th2-lymfocyter (fig. 1c, högra panelen). Denna ökade phospho-IRE1a kan förklaras av den ökade syntesen av proteinet, även om vi inte kan utesluta möjligheten av ökad kinasaktivitet och autofosforylering. Den densitometriska analysen av Western blot-bandet tyder på att båda mekanismerna, uppreglering av proteinsyntesen och ökad fosforylering, är inblandade. Uppregleringen av proteinet ökade tre gånger, men fosforproteinet ökade 4,5 gånger (fig. 1c).

Aktiverad IRE1a skarvar det osplicade XBP1 (XBP1u) mRNA och producerar en skarvad XBP1 (XBP1s) mRNA isoform. Vi observerade ökningar av den splicade formen av XBP1 (XBP1s), både på mRNA- och proteinnivå, vid aktivering av T-hjälparceller (fig. 1d, e). Tunicamycin användes som en positiv kontroll. Det är ett läkemedel som hämmar N-länkad glykosylering och därmed orsakar ackumulering av oveckade proteiner (dvs. endoplasmatiskt retikulum (ER)-stress) och ökar XBP1s genom att öka IRE1a-aktiviteten. Specifik hämning av IRE1a endonukleasaktiviteten genom att behandla cellerna med 4μ8c avskaffade både XBP1s mRNA- och proteinisoformerna, vilket bekräftar att bildandet av den splicade formen var beroende av IRE1aaktiviteten (fig. 1d, e).

Dessa resultat bekräftar att IRE1a-XBP1-vägen är konserverad i Th2-lymfocyter och uppreglerad under aktivering av T-hjälparceller in vitro. Därefter undersökte vi om detta även gäller in vivo.

In vivo aktiverade T-hjälparceller uppregulerar IRE1a-XBP1-vägen

För att testa om IRE1a-XBP1-vägen är operativ i CD4+ T-celler in vivo infekterade vi C57BL/6-möss med helminthparasiten Nippostrongylus brasiliensis, en väletablerad modell för Th2-drivna immunsvar . Efter 7 dagar efter infektionen analyserade vi XBP1s proteinuttryck i T-hjälparceller med flödescytometri. Vi fann att T-hjälparceller från maskinfekterade möss uttrycker signifikant mer XBP1s jämfört med oinfekterade kontrollmöss, vilket tyder på en uppreglering av vägen (fig. 2).

T-hjälparceller uppreglerar IRE1a-XBP1s-banan in vivo under infektion. Splenocyter från nematod (Nippostrongylus brasiliensis)-infekterad mus (7 dagar efter infektion) färgades med en PE-konjugerad anti-XBP1s-antikropp och analyserades med flödescytometri (gatingstrategi: singlet > levande celler > CD4+CD3e+ > XBP1s+). En representativ FACS-profil visas (vänster panel) och grafen med alla resultat (n = 4) visas i den ”högra panelen”

Dessa resultat bekräftar att vägen är aktiv in vivo. Därför satte vi igång med att dissekera vägen med hjälp av genomomfattande metoder i Th2-lymfocyter.

Genomövergripande transkriptomisk analys av differentiellt genuttryck avslöjar IRE1a-XBP1-regulerade gener

För att fånga upp en global genregulatorisk roll för IRE1a-XBP1-vägen jämförde vi in vitro-aktiverade Th2-celler med celler med inhiberad IRE1a endonukleasaktivitet genom att tillsätta 4μ8c i cellodlingsmedierna. Vi jämförde sedan transkriptomerna av aktiverade Th2-lymfocyter med eller utan hämning av IRE1a-XBP1-vägen. Transkriptomerna av 4μ8c-behandlade och obehandlade Th2-celler erhölls genom mRNA-sekvensering (RNA-seq). Kvalitetskontrollen av RNA-sekvenseringsdata visas i tilläggsfil 1: Figur S3. Genom att jämföra transkriptomerna från naiva och aktiverade Th2-lymfocyter fann vi att 10995 gener var differentiellt reglerade vid Th2-aktivering. Hämning av IRE1a-XBP1-vägen genom 4μ8c-behandling resulterade i differentiellt uttryck av 3144 gener jämfört med den obehandlade Th2-kontrollen (fig. 3a, Additional file 1: Figur S3 högra panelen). Två tusen sexhundra sjuttio av dessa gener var involverade i Th2-differentiering (fig. 3a). Hierarkisk klustring av generna avslöjar grupperna av gener som upp- och nedregleras vid 4μ8c-behandling (Additional file 1: Figur S3, höger). En detaljerad undersökning av dessa gener visade att många av dem är associerade med det oveckade proteinsvaret och ER-stress, vilket tyder på att IRE1a-XBP1-vägen (fig. 3b) har en stor inverkan på dessa biologiska processer. Den fullständiga listan över differentiellt uttryckta gener finns i Additional file 2: Table S1. Gene Ontology (GO)-analys av dessa differentiellt uttryckta gener vid 4μ8c-behandling av Th2-celler (dvs. IRE1a-XBP1-vägsreglerade gener) visade att de är berikade i följande biologiska processer: ”Reaktion på ER-stress” (GO:0006950), ”Reglering av signaltransduktion” (GO:0009966), ”Cytokinproduktion” (GO:0001816), ”Cellproliferation” (GO:0008283), ”Cellcykel” (GO:0007049) och Immunförsvar (GO:0006955) (fig. 3c). Dessa förändringar i genuttrycksmönstren vid inhibering av IRE1a tyder på en omfattande inblandning av transkriptionsfaktorn XBP1 i Th2-aktivering och proliferation samt differentiering. Därför satte vi oss för att hitta kromatinbeläggningsmönster för XBP1-transkriptionsfaktorn över hela genomet.

Differentiellt genuttryck i Th2 på grund av hämning av IRE1a-XBP1 med 4μ8c. Naiva T-hjälparceller aktiverades under Th2-differentieringsförhållanden i närvaro eller frånvaro av 4μ8c. Cellerna aktiverades i anti-CD3e- och anti-CD28-antikroppsbelagda plattor i 3 dagar, vilade i 2 dagar och reaktiverades i belagda plattor i 6 h. RNAseq-data analyserades för differentiellt genuttryck. a Venn-diagram som visar antalet differentiellt uttryckta gener i olika experimentella förhållanden. ”Naïve → Th2” anger de differentiellt uttryckta generna mellan naiva T-hjälpare och Th2-celler. ”Th2 → Th2+4μ8c” anger de differentiellt uttryckta generna mellan obehandlade och 4μ8c-behandlade Th2. b Värmekarta som visar differentiellt uttryckta gener som är välkända för att vara involverade i upplösningen av ER-stress som orsakas av oveckad proteinrespons. Värmekartan visar skalade uttrycksvärden betecknade som rad Z-score, i röd-blå färgskala där rött indikerar ökat uttryck och blått indikerar minskat uttryck. c Gene ontology (GO)-analys av de differentiellt uttryckta generna mellan Th2 och 4μ8c-behandlade Th2

XBP1 ChIPmentation avslöjar XBP1 direkta målgener i Th2-celler

För att identifiera XBP1:s kromatinbeläggning över hela genomet, utförde vi ChIPmentation, en nyligen utvecklad metod som har visat sig vara snabbare, känsligare och robustare än traditionella ChIP-seq-metoder, med hjälp av en ChIP-klassad antikropp mot XBP1. In vitro differentierade och reaktiverade Th2-celler användes för XBP1 ChIP. Två oberoende biologiska replikat utfördes. Vi fick 19,3 miljoner och 22,4 miljoner parvisa läsningar för varje replikat respektive. Med hjälp av MACS2 med ett q-värde mindre än 0,01 och en viktad anrikning över 5 identifierade vi 9031 respektive 7662 toppar i de två replikaten. Överlappningsanalys med hjälp av bedtools visade att 5892 toppar fanns i båda replikaten. Därför fokuserade vi endast på dessa 5892 toppar för nedströmsanalysen.

Som väntat identifierades bindningstoppar runt promotorregioner i kända XBP1-målgener, t.ex. Hspa5 som kodar för ER-chaperonproteinet BiP, även känt som Grp78; en bindningshändelse observerades också runt själva XBP1:s promotor (Fig. 4a), vilket tyder på potentiell självreglering av XBP1. För att ta reda på de genomiska egenskaperna som är förknippade med XBP1-bindningsställena jämförde vi dess topplacering med RefSeq-generna med hjälp av HOMER . Majoriteten av XBP1-bindningstopparna var belägna inom promotorn (definierad som uppströms 1000 bp och nedströms 500 bp i förhållande till annoterade transkriptionsstartplatser) (36 %) och introniska (35 %) regioner, och distala intergeniska bindningshändelser (25 %) observerades också ofta (fig. 4b). Den genomiska fördelningen av XBP1-topparna tyder på att den binder både promotorer och potentiella förstärkare.

Kromatinbeläggning över hela genomet av transkriptionsfaktorn XBP1 i Th2-lymfocyter. XBP1 ChIPmentation utfördes i in vitro differentierade Th2-celler för att erhålla kromatinbeläggning av XBP1 över hela genomet. a Snapshot av XBP1-bindningstoppar runt angivna representativa gener från UCSC:s genombrowser. b Genomisk fördelning av XBP1-bindningstoppar. Den sektor som motsvarar promotorn omfattar sekvenser upp till 1 kb uppströms och 100 bp nedströms från TSS. c Jämförelse av XBP1-motiven från JASPAR-databasen (överst), ChIP-seq av humana bröstcancercellinjer (i mitten) och Th2-lymfocyter från musen (nederst). d Motivfrekvenser av XPB1 och NF-Y runt XBP1:s bindande toppar. e Biologiska processers GO-termer som är berikade inom XBP1-bindningstoppar analyserade med GREAT

För att ytterligare karakterisera XBP1-regulomet utförde vi de novo-motivupptäckt med hjälp av HOMER för att identifiera berikade DNA-motiv inom XBP1-bindningsregioner. Det främsta motivet som identifierades är konsensussekvensen GCCACGT, som är nästan identisk med det mänskliga XBP1-bindningsmotivet som definierats i bröstcancercellinjer (fig. 4c) . Detta tyder på att XBP1:s bindningsspecificiteter är mycket bevarade mellan människa och mus och mellan olika celltyper. Det främsta motivet som berikas i våra musdata liknar också XBP1-motivet från JASPAR-databasen , vilket återigen stöder den höga kvaliteten på våra ChIPmenteringsdata. Det näst mest berikade motivet är NF-Y-bindningsmotivet (Additional file 1: Figur S4C). Intressant nog har NF-Y-motivet ofta hittats runt promotorregioner för cellcykelgener, särskilt gener som är involverade i regleringen av G2/M-cellcykeln . Både XBP1-motivet och NF-Y-motivet förekommer tillsammans runt en delmängd av 258 XBP1-bindningstoppar (fig. 4d), vilket tyder på ett potentiellt samarbete mellan XBP1- och NF-Y-transkriptionsfaktorer för att reglera en delmängd av målgener. Listan över målgener som potentiellt samregleras av XBP1 och NF-Y visas i Additional file 3: Table S2, och en fullständig lista över XBP1-målgener finns också i Additional file 3: Table S2. De fem mest berikade motiven visas i tilläggsfil 1: Figur S4C. För att undersöka funktionerna hos XBP1-bundna gener använde vi GREAT för att karaktärisera XBP1-bindningstoppar. De flesta av de signifikanta GO-termerna är relaterade till proteinveckning och ER-stress (fig. 4e), vilket stämmer överens med XBP1:s kända biologiska roll.

Tillsammans förutsäger ChIPmentationsexperimenten en roll för XBP1 i att förbättra proteinveckning och sekretion, samt aktivering av Th2-lymfocyter.

Integration av transkriptomiska data och ChIP-seq-data för att avslöja det XBP1-kontrollerade genregulatoriska nätverket

För att avslöja de XBP1-regulerade direkta målgenerna och dess transkriptionella regulatoriska nätverk integrerade vi de genomomfattande transkriptomiska data och ChIPmenteringsdata. En direkt målgen definieras av dess differentiella uttryck vid IRE1a-hämning (dvs. 4μ8c-behandling) och XBP1-transkriptionsfaktorns ockupation vid genens lokus. Vi hittade 1143 direkta målgener i Th2, varav 122 målgener tidigare rapporterats som XBP1-direkt målgener i andra celltyper (dvs. muskler, β-celler i bukspottkörteln och plasmaceller) (fig. 5a). I detta sammanhang kan 1021 gener betraktas som Th2-specifika. XBP1:s verkan över sina direkta mål har ingen definierad riktning och innehåller gener som upp- och nedregleras. De 38 främsta generna som följer något av dessa mönster visas i fig. 5b, och den fullständiga listan finns i Additional file 4: Table S3. De viktigaste identifierade biologiska processerna och vägarna är relaterade till proteinveckning och ER-stress (Additional file 1: Figur S5), vilket stämmer överens med dess kända biologiska roller och inkluderar även nya Th2-specifika mål.

Trots den övervägande betydelsen av XBP1:s roll i kontrollen av denna väg har andra transkriptionsfaktorer också visat sig vara involverade. För att undersöka den regulatoriska kaskad som följer på XBP1-regleringen byggde vi ett transkriptionellt regleringsnätverk genom att extrahera annoterade transkriptionsfaktorer med promotor- eller exoniska/introniska ChIP-seq-toppar (fig. 5c). Den fullständiga listan över transkriptionsfaktorerna finns i Additional file 5: Table S4. Detta nätverk kompletterades ytterligare genom att lägga till differentiellt uttryckta gener som har annoterade interaktioner med måltranskriptionsfaktorerna i STRING-databasen (Additional file 6: Table S5).

De transkriptionsfaktorer som regleras direkt av XBP1 kan kategoriseras i tre breda funktionella kategorier som är involverade i följande: upplösning av proteinsekretorisk ER-stress, reglering av cellcykel och proliferation och kontroll av effektiviserande immuncellsfunktion. De transkriptionsfaktorer som är involverade i ER-stress underlättar sannolikt cytokinutsöndringen i Th2-lymfocyter. Denna förutsägelse grundar sig på tidigare rapporter från sekretoriska celler, t.ex. acinarceller i bukspottkörteln och plasmaceller. Dessa transkriptionsfaktorer, nämligen Bhlha15, Atf3, Atf6, Atf6b, Atf4 och Creb3l2, har visat sig vara involverade i sekretorisk stressanpassning av ER .

Syftet med cellproliferation och cellcykelrelaterade transkriptionsfaktorer kan vara att underlätta den kontrollerade snabba expansionen av aktiverade Th2-celler. De immunresponsrelaterade faktorerna är sannolikt involverade i Th2-differentiering och cytokinproduktion. Därför ville vi testa effekten av XBP1s nedreglering i cytokinsekretion, cellproliferation och cytokinproduktion.

IRE1a-XBP1-vägen kontrollerar cytokinsekretion i T-hjälparceller

Den genomomfattande jämförelsen av XBP1-reglerade gener förutspår att faktorn är involverad i sekretion av cytokiner. För att validera denna förutsägelse blockerade vi IRE1a endonukleasaktivitet i Th2-celler och analyserade cellkulturens supernatant för att kvantifiera IL4-nivån med ELISA. Vi valde IL4 som en testbar kandidatcytokin eftersom dess mRNA och protein är oförändrade vid nedreglering av XBP1 (Additional file 1: Figur S6A vänster panel, figur 6 vänster och mittenpanelen i den översta raden). Vi fann att sekretionen av IL4 är signifikant hämmad i 4μ8c-behandlade celler (fig. 6, högra panelen i övre raden). Som förväntat stöder detta resultat inblandningen av IRE1a-XBP1-vägen för att underlätta cytokinutsöndringen i Th2-celler enligt förutsägelsen. Hämning av vägen under restimuleringsfasen har ingen signifikant hämmande effekt på IL4-sekretionen (Additional file 1: Figur S6B). Detta resultat tyder på att XBP1s krävs under Th2-differentiering, möjligen för utvecklingen av ett effektivt sekretoriskt maskineri.

IRE1a-XBP1-vägen krävs för cytokinuttryck och -sekretion i Th2-lymfocyter. Naiva T-hjälparceller odlades efter Th2-aktiveringstillstånd i närvaro av IRE1a-hämmaren 4μ8c i 3 dagar, vilade i 2 dagar, reaktiverades genom belagd platta och analyserades med flödescytometri för att detektera intracellulära cytokiner IL4, IL5 och IL13-uttryck. Representativa FACS-profiler visas i de två första kolumnerna. Det intracellulära cytokinuttrycket jämförs i kolumn 3, med tre till sju oberoende biologiska replikat. Fjärde kolumnen: cellodlingssupernatanter från 4μ8c-behandlade eller DMSO-behandlade Th2 analyserades med ELISA för att mäta cytokinkoncentrationen. FACS gating: lymfocyter > singelceller > levande celler > cytokiner

IRE1a-XBP1-vägen kontrollerar cytokinuttrycket av IL13 och IL5

IL5 och IL13 är två prominenta cytokiner av typ 2 som är involverade i eosinofili, allergier och helminthinfektioner. Vi fann att inhibering av IRE1a-XBP1-vägen signifikant undertrycker IL5- och IL13-proteinuttrycket och sekretionen i kulturmediet (fig. 6 högra paneler i den mellersta och nedre raden). Bioinformatisk analys av Th2-transkriptomet förutsäger att IRE1a-XBP1-vägen positivt kontrollerar IL5- och IL13-genuttrycket, eftersom båda generna identifierades som differentiellt uttryckta gener vid inhibering av IRE1a (Additional file 2: Table S1). Vi validerade denna förutsägelse genom RT-qPCR-medierad genuttrycksanalys (Additional file 1: Figur S6A, mellersta och högra panelen) och flödescytometri (Fig. 6). Dessa resultat tyder på en transkriptionell inblandning av den väg som reglerar IL5 och IL13. Noterbart är att IL4 mRNA- och proteinnivåerna inte påverkas, vilket tyder på specifik reglering av IL5 och IL13.

IRE1a-XBP1-vägen underlättar aktiveringsberoende proliferation av T-hjälparceller

Cellproliferationshastigheten är ett resultat av positiva och negativa regulatorers interaktion. Vi observerade att gener som kodar för både positiva och negativa regulatorer av cellproliferationsgener uttrycks differentiellt när IRE1a-XBP1-vägen blockerades av 4μ8c (Fig. 7a, vänster panel, Additional file 7: Table S6), av vilka många gener visade sig vara direkta måltavlor för XBP1 (Fig. 7a, höger panel, Additional file 8: Table S7). Denna observation förutsäger en förändring av proliferationshastigheten vid inhibering av IRE1a. Därför var vi intresserade av att kontrollera effekten av IRE1a-XBP1-hämning på cellproliferation. Vi utförde cellproliferationsanalyser med hjälp av Th2-celler. Naiva CD4+ T-celler från mjälte märktes med CellTrace violett och aktiverades under Th2-differentieringsförhållanden i närvaro eller frånvaro av 4μ8c. Det fluorescerande färgämnets avtagande övervakades med flödescytometri. Vi fann att nedreglering av XBP1s hämmar cellproliferationen signifikant (Fig. 7b), men inducerar inte celldöd (Additional file 1: Figure S7).

IRE1a-XBP1-vägen främjar aktiveringsberoende Th2-cellproliferation och cellcykling. a Vänster panel: hierarkisk klustring av differentiellt uttryckta cellproliferationsassocierade gener i det 4μ8c-behandlade och obehandlade Th2-transkriptomet. Högra panelen: hierarkisk klustring av XBP1:s direkta målgener som är kända för att vara involverade i cellproliferation. Värmekartan visar skalade uttrycksvärden betecknade som rad Z-score, i röd-blå färgskala där rött indikerar ökat uttryck och blått indikerar minskat uttryck. b Spleniska naiva T-hjälparceller färgades med CellTrace Violet-färgämne och aktiverades i 72 h under Th2-differentieringsförhållanden och analyserades med flödescytometri. Generationer av Th2-celler är i ”rött” och 4μ8c-behandlade celler är i ”blått” i histogrammet över cellproliferation (vänster panel, ett representativt experiment). Grafisk representation av delningsindex som erhållits från fem oberoende biologiska replikat (högra panelen)

T-hjälparcellproliferation är förknippad med differentiering och cytokinproduktion. Det minskade IL5- och IL13-uttrycket (fig. 6) kan eventuellt förklaras av att cellproliferationen fördröjs. Om minskad proliferation var den primära orsaken till bristande sekretion skulle dock även IL4-produktionen hämmas. Ändå observerade vi ingen signifikant förändring av IL4-uttrycket vid inhibering av IRE1a (fig. 6, Additional file 1: Figure S6A). För att undersöka denna diskrepans ytterligare utförde vi cellproliferationsanalyser med hjälp av IL13-GFP- och IL4-GFP-reportermuslinjer. I IL4-GFP-expressiva Th2-celler observerade vi en hämning av IL4-produktionen i de första generationerna av celldelning upp till 72 timmar efter 4μ8c-behandling (Additional file 1: Figur S8). Men vid 96 h blir skillnaden i IL4-uttryck obetydlig oavsett vilken generation av celldelning cellerna befinner sig i. Denna observation tyder på att fördröjningen av proliferationen på grund av IRE1a-hämningen inte är tillräcklig för att hämma IL4-uttrycket. I IL13-GFP observerade vi däremot en minskning av IL13-uttrycket från den allra första generationen och detta fortsätter i de senare generationerna (Additional file 1: Figur S9).

IRE1a-hämning fördröjer cellcykelprogressionen genom S- och G2/M-fasen

Bioinformatisk analys av differentiellt uttryckta gener (Th2 jämfört med 4μ8c-behandlade Th2) och XBP1-direkta målgener avslöjar flera gener som är involverade i kontrollen av cellcykelprogressionen genom olika stadier (t.ex, G1, S, G2/M) klustrades i två grupper upp- eller nedreglerade (fig. 8a). Vi tog gener som uttrycktes differentiellt i 4μ8c-behandlade Th2 jämfört med obehandlade Th2 (justerat p-värde < 0,05) (Fig. 8a, vänster, Additional file 9: Table S8) och de gener som uttrycktes differentiellt XBP1 direkta målgener (Fig. 8a, höger, Additional file 10: Table S9) och kontrollerade kända roller över olika cellcykelstadier med hjälp av antingen en manuellt kuraterad lista baserad på RNA-seq-data eller en publicerad databas . Vi fann att många gener från alla cellcykelstadier (dvs. G1, S och G2/M) påverkades. För att identifiera de cellcykelstadier som regleras av IRE1a-XBP1-vägen skapade och använde vi en transgen FUCCI-musstam (fluorescerande ubiquitincellcykelindikator) som uttrycker mCherry-märkt Cdt1 och mVenus-märkt Geminin-protein. Stammen liknar den som användes i . G1-cellerna är mCherry+ mVenus- (Q3; fig. 8b), G1-S-cellerna är mCherry+ mVenus+ (Q2; fig. 8b) och SG2M-cellerna är mCherry- mVenus+ (Q1; fig. 8b), medan celler som befinner sig i mitos och går in i G1 är mCherry- mVenus- (Q4; fig. 8b). Vi jämförde cellcykelprofiler för fordon och 4μ8c-behandlade Th2-celler under T-cellsaktivering. Vi fann att cellerna ackumuleras i S- och/eller G2/M-fasen när IRE1a-XBP1-vägen blockeras (fig. 8b). Liknande resultat erhölls i en annan metod med hjälp av BrdU-inkorporeringsanalys med DAPI-färgning (Additional file 1: Figure S10).

IRE1a-hämning fördröjer cellcykelprogressionen genom S- och G2/M-fasen. a Vänster panel: värmekarta över differentiellt uttryckta cellcykelstadieassocierade gener i det 4μ8c-behandlade och obehandlade Th2-transkriptomet. Högra panelen: värmekarta över XBP1:s direkta målgener som är kända för att vara involverade i cellcykeln. Värmekartan visar skalade uttrycksvärden betecknade som rad Z-score, i röd-blå färgskala där rött indikerar ökat uttryck och blått indikerar minskat uttryck. b Cellcykelanalys av Th2-lymfocyter efter 72 timmars aktivering, med hjälp av FUCCI-muslinje som uttrycker mCherry-märkt CDT1 och Venus-märkt GEMININ. Överst till vänster: Schematisk representation av cellcykelstadier i den använda FUCCI-musen. Överst till höger: Jämförelse av celler (% av totalt antal) som erhållits från olika stadier av cellcykeln i Th2 och 4μ8c-behandlade Th2 (n = 6). Nedre paneler: En representativ FACS-profil av Th2 och 4μ8c-behandlad Th2 som visar CDT1- och GEMININ-uttryckande celler

Transgent uttryck av XBP1s kompletterar den 4μ8c-medierade hämmningen av IRE1a endonukleasaktivitet

För att testa om de observerade 4μ8c-behandlade fenotyperna berodde på förlust av XBP1s, utförde vi komplementationsanalyser genom att transducera en XBP1s-uttrycksvektor i Th2-cellerna in vitro. Vektorn kodade för den splicade formen av XBP1 (XBP1s), vars funktion är oberoende av IRE1as funktion. Vi fann att stabilt ektopiskt uttryck av XBP1s upphäver effekten av 4μ8c-behandling och att det inte finns någon signifikant förändring i transkriptomet vid 4μ8c-behandling när Th2-celler överuttrycker XBP1s (Additional file 1: Figur S11A). XBP1s överuttryckande Th2-celler prolifererar och differentierar normalt i närvaro av 4μ8c (Additional file 1: Figur S11B respektive S11C). Dessa resultat tyder starkt på att de fenotyper som observeras vid 4μ8c-behandling beror på förlusten av XBP1s.