3.06.4.1.1.1 Drojdia Saccharomyces

Studiile timpurii au arătat că drojdia Saccharomyces poate fermenta xiluloza în etanol, deși nu în mod eficient. Astfel, teoretic, drojdiei Saccharomyces îi lipsește doar enzima (enzimele) care să transforme xiloza în xiluloză. După cum s-a descris mai sus, bacteriile transformă xiloza în xiluloză cu o singură enzimă care nu necesită cofactori (figura 3). În schimb, sistemul de transformare a xilozei în xiluloză al drojdiei a necesitat două enzime care nu sunt ideale din punct de vedere metabolic, așa cum s-a descris mai sus. Inițial, aproape 10 laboratoare diferite din întreaga lume au încercat să cloneze o genă de xiloză izomerază bacteriană în drojdie. Ho et al. de la Universitatea Purdue au fost primul grup care a reușit să cloneze gena izomerazei xilozei din Escherichia coli. Cu toate acestea, proteina sintetizată în drojdie de către gena bacteriană clonată nu a avut activitate de xiloză izomerază.

O a doua abordare a fost clonarea genelor XR și XD de la P. stipitis în drojdia Saccharomyces. Cu toate acestea, cinetica acestor enzime și echilibrul termodinamic al reacției favorizează producerea de xilitol în loc de etanol. La începutul anilor 1990, trei grupuri (Kotter, Ciriacy și colegii de la Universitatea din Dusseldorf, Tantirungkij și colegii de la Universitatea din Osaka și Hahn-Hägerdal și colegii de la Universitatea din Lund) au raportat clonarea cu succes a genelor XR și XD în drojdia Saccharomyces pentru a o face capabilă să fermenteze xiloza. Cu toate acestea, drojdia recombinantă dezvoltată de aceste grupuri a fermentat xiloza extrem de lent și a produs puțin etanol; principalul produs metabolic a fost xilitolul.

Grupul Ho a emis ipoteza că supraexprimarea xilulokinazei native (XK) împreună cu XR și XD din P. stipitis ar îmbunătăți fluxul de xiloză prin metabolismul de transformare în etanol prin scăderea concentrației intracelulare de xiluloză. Deoarece xilulokinaza catalizează o reacție ireversibilă de producere a etanolului (figura 3), o activitate ridicată a xilokinazei va duce la concentrații scăzute de xiluloză. Acest lucru este de dorit deoarece echilibrul reacției catalizate de XD favorizează xilitolul, iar concentrațiile scăzute de xiluloză în stare de echilibru sunt necesare pentru a direcționa fluxul metabolic în direcția producției de etanol . În plus, clonarea acestor trei gene a permis controlul expresiei lor în celulă. În cadrul sistemului de control al expresiei nativ al celulei, expresia lor este indusă de prezența xilozei și este inhibată de glucoză. Drojdia recombinantă rezultată ar putea fi capabilă să cofermenteze simultan glucoza și xiloza în etanol fără perioada lungă de întârziere între fermentarea glucozei și a xilozei, ceea ce ar fi extrem de dorit pentru producția industrială de etanol.

În 1989, grupul Ho de la Purdue a raportat pentru prima dată clonarea genei xilulokinazei din drojdia Saccharomyces. Ulterior, grupul Ho a înlocuit secvențele de ADN din amonte de genele structurale XR, XD și XK cu secvențe din amonte ale genelor glicolitice care conțin promotori constitutivi eficienți. Genele XR, XD și XK rezultate au fost clonate pe o plasmidă cu număr mare de copii 2μ, iar plasmidă rezultată, pLNH32, a fost utilizată pentru a transforma o tulpină de drojdie Saccharomyces industrială de tip sălbatic, cunoscută ca fiind superioară pentru producția de etanol folosind amidonul (glucoza) ca materie primă. În 1993, același grup a raportat dezvoltarea cu succes a drojdiei recombinate Saccharomyces 1400 (pLNH32) care poate fermenta concentrații mari de xiloză aproape complet în etanol, cu foarte puțin xilitol ca produs secundar. În plus, drojdia rezultată ar putea cofermenta glucoza și xiloza în etanol fără o perioadă de decalaj prea mare între fermentarea acestor două zaharuri, deși rata de fermentare a xilozei este mai lentă decât cea a glucozei (figura 4). Ulterior, au fost raportate detaliile privind construcția și dezvoltarea modelului 1400 (pLNH 32). De atunci, grupul Ho a continuat să îmbunătățească drojdia cu diverse abordări noi, așa cum este descris mai jos.

Figura 4. (Stânga) Tulpina 1400 de drojdie Saccharomyces transformată cu plasmidul părinte pLNH32 care nu conține genele XR, XD sau XK sau care conține doar XR și XD, dar nu și XK, utilizată pentru a fermenta un amestec de glucoză și xiloză. (Dreapta) 1400 de drojdii transformate cu plasmidul pLNH32, care conține genele XR, XD și XK clonate. Drojdia a fost utilizată pentru a fermenta glucoza și xiloza în condiții identice cu rezultatele descrise în figura din stânga. Genele clonate în aceste plasmide au fost modificate și construite în mod identic cu cele descrise în referința 9.

Plasmidă 2 μ, pLNH32, care conține gena clonată XR-XD-XK este o plasmidă gazdă largă, concepută pentru a putea transforma orice tulpini de drojdie Saccharomyces, inclusiv drojdia Saccharomyces industrială de tip sălbatic. O astfel de plasmidă poate fi utilizată pentru a selecta gazde mai bune pentru producția de etanol celulozic. Grupul Ho a dezvoltat, de asemenea, o nouă tehnică unică de integrare a genelor care facilitează integrarea eficientă a mai multor gene în cromozomul drojdiei în mai multe copii. Această tehnică este ușor de realizat și aproape garantează că genele clonate pe plasmidul de integrare și transformate în celulele de drojdie gazdă pot fi integrate în genomul gazdei în atâtea exemplare câte se dorește pentru a asigura cele mai bune activități (figura 5). Această tehnică de integrare a fost utilizată pentru a dezvolta tulpina 1400 (LNH-ST), 1400 (LNH-ST), care fermentează xiloza în mod stabil, integrând mai întâi genele XR-XD-XK împreună sub formă de casetă în cromozomul de drojdie în suficiente copii până când drojdia rezultată a fermentat xiloza cu cea mai mare eficiență (figura 6). Cea mai bună tulpină actuală dezvoltată de grupul Ho, 424A (LNH-ST), a fost selectată din 10 tulpini diferite de drojdii Saccharomyces, transformând mai întâi fiecare tulpină cu plasmidul 2 μ pLNH32 pentru a ne asigura că aceste tulpini sunt capabile să fermenteze xiloza, precum și să cofermenteze eficient glucoza/xiloza în prezența pLNH32, urmată de integrarea genelor în cromozomii tulpinilor de drojdie selectate pentru a dezvolta „drojdia stabilă” prin această nouă tehnică de integrare. Cofermentarea glucozei/xilose de către 424A (LNH-ST) este prezentată în figura 7.

Figura 5. Demonstrarea integrării etapizate a mai multor copii ale genelor XR-XD-XK în cromozomii tulpinii 259 de drojdie Saccharomyces prin metoda descrisă în Ho și colab. . Drojdii aflate în diferite stadii de integrare au fost utilizate pentru a fermenta glucoza și xiloza în condiții identice pentru a demonstra progresul integrării acestor gene: a) în stadiul inițial de integrare, b) 25% din integrare, c) 50-75% din integrare, d) după finalizarea integrării. Finalizarea integrării este reflectată de celulele din procesul de integrare care produc aceleași rezultate de fermentare pentru o perioadă suficient de lungă de timp.

Figura 6. Cofermentarea glucozei și xilozei cu 1400 (LNH-ST) care conține mai multe copii ale genelor XR-XD-XK integrate în cromozomii de drojdie prin metoda lui Ho et al. .

Figura 7. Cofermentarea glucozei și a xilozei cu tulpina recombinantă Saccharomyces 424A (LNH-ST) care conține mai multe copii ale genelor XR-XD-XK integrate în cromozomii de drojdie ai tulpinii Saccharomyces 424A prin metoda lui Ho et al. . Aceasta este cea mai bună drojdie Ho-Purdue dezvoltată la Universitatea Purdue înainte de 2007 și furnizată în prezent industriei pentru producția de etanol celulozic.

Dacă un microorganism recombinant este utilizat pentru producția industrială pe scară largă, cum ar fi pentru producția de etanol, este necesar să se integreze genele care urmează să fie clonate în cromozomii gazdei din două motive esențiale. Primul este că, dacă genele clonate sunt integrate în cromozomii gazdă printr-o metodă fiabilă, genele clonate pot fi menținute pe cromozomul gazdă fără a fi nevoie de utilizarea de substanțe chimice, medii, antibiotice și aditivi speciali. Necesitatea substanțelor chimice sau a antibioticelor pentru a menține trăsăturile nu numai că adaugă costul substanțelor chimice, ci și costurile și dificultățile legate de procesul de aprobare de reglementare și de curățare a oricăror efluenți. Chiar și în prezența unui agent selectiv, plasmidele cu număr mare de copii, cum ar fi pLNH32, utilizate pentru clonarea genelor în celulele gazdă, ar putea să nu fie capabile să susțină funcționarea industrială pe scară largă . Grupul Ho a arătat că drojdia stabilă dezvoltată cu ajutorul noului sistem de integrare, 1400 (LNH-ST), a fost capabilă să susțină fermentarea continuă a hidrolizatului de păstăi de porumb în etanol într-o instalație pilot, în timp ce aceeași tulpină de drojdie care conținea plasmidul 1400 (pLNH32) nu a reușit să facă acest lucru.

Steaua 424A (LNH-ST) și alte tulpini stabile, 1400 (LNH-ST) și 259 (LNH-ST), dezvoltate prin noua tehnică de integrare, au fost toate validate de alte persoane și s-au dovedit a fi durabile și eficiente pentru producția de etanol celulozic cu hidrolizati din diferite materii prime lignocelulozice. Tulpina 424A (LNH-ST) a fost, de asemenea, utilizată la nivel industrial pentru producția de etanol celulozic din reziduuri agricole într-o instalație demonstrativă încă din 2004.

Legumina recombinantă dezvoltată de Hahn-Hägerdal a fost îmbunătățită pe scară largă prin clonarea diferitelor gene suplimentare, inclusiv clonarea genei xilulokinazei după ce grupul Ho de la Universitatea Purdue a demonstrat că o expresie crescută a acestei gene native îmbunătățește randamentul etanolului din xiloză.

Legumina dezvoltată de grupul Ho de la Purdue este disponibilă pentru producția industrială de etanol celulozic. Ea va avea probabil o șansă bună de reușită, deoarece este o drojdie producătoare de etanol industrial și a fost testată pe scară largă. Recent, grupul Purdue a continuat să îmbunătățească tulpina, făcând-o să cofermenteze arabinoza cu celelalte patru zaharuri (glucoză, xiloză, mannoză și galactoză) și făcând-o mai rezistentă la etanol și la acidul acetic.

Chiar dacă încercarea timpurie de a dezvolta o drojdie Saccharomyces care fermentează xiloza pe bază de izomerază de xiloză nu a avut succes și a fost dezvoltată o drojdie artificială eficientă de fermentare a xilozei pe bază de XR/XD, interesul pentru dezvoltarea unei drojdii de fermentare a xilozei pe bază de izomerază de xiloză a continuat de-a lungul anilor, în parte, deoarece această cale nu prezintă un dezechilibru redox. În 2009, Brat et al. au construit S. cerevisiae care fermentează xiloză folosind izomeraza de xiloză din Closteidium phytofermentans. Tot în 2009, Cargill a raportat dezvoltarea unei tulpini de drojdie non-Saccharomyces care exprimă izomeraza xilozei și care este capabilă să fermenteze eficient un amestec de glucoză și xiloză la un pH scăzut și în prezența a 1% acid acetic.

Chiar dacă arabinoza este prezentă doar în cantități mici în biomasa provenită din ierburi ca parte a hemicelulozei GAX, câteva surse speciale de biomasă, cum ar fi fibra de porumb, conțin cantități relativ mari de arabinoză. Cu toate acestea, este ideal ca microbii producători de etanol celulozic să fie capabili să fermenteze toate cele cinci molecule diferite de zahăr prezente în biomasa celulozică, deoarece reciclarea fluxurilor de proces în cadrul unui proces industrial poate crește concentrația de componente minore .

Mecanismul metabolismului arabinozei în microorganisme este la fel de complicat ca și metabolismul xilozei. Din nou, mecanismul metabolismului arabinozei la drojdii este diferit de cel al bacteriilor . Similar cu metabolismul xilozei, mecanismul metabolic al drojdiei nu favorizează metabolismul anaerob. Recent, Hahn-Hägerdal și colaboratorii au modificat în continuare drojdia Saccharomyces, care fermentează xiloza, pentru a cofermenta arabinoza cu xiloza și alte zaharuri prin calea fungică a l-arabinozei . Cu toate acestea, drojdia modificată rezultată a fost în continuare incapabilă să fermenteze arabinoza într-o cantitate semnificativă de etanol, dar a fost capabilă să transforme o cantitate mică de arabinoză în arabitol.

.