WWOX este localizat pe brațul lung al cromozomului 16 într-un loc fragil cunoscut. Este compus din nouă exoni și are o dimensiune de >1 Mb.1 Transcriptul canonic (ENST00000566780.5, NM_016373.3) codifică o proteină ubicuă de 414 aminoacizi (aa) foarte exprimată în prostată, gonade, sân, plămâni, țesuturi endocrine și creier.21,22 Splicingul alternativ al WWOX în timpul procesării ARN mesager precursor (pre-ARNm) generează opt transcripte care au fost observate numai în cancere; nu se știe dacă fiecare ARNm WWOX aberant este tradus în proteină.23 Oxidoreductaza care conține domeniul WW este singura proteină care cuplează două domenii distincte cu omologii ridicate atât cu familia de domenii WW, cât și cu superfamilia SRD. WWOX adăpostește două domenii WW la amino-terminal, un motiv de semnal de localizare nucleară (NLS) și un domeniu C-terminal dehidrogenază-reductază cu lanț scurt (SDR) (Fig. 1b). Un motiv de secvență de direcționare mitocondrială (MTS) a fost, de asemenea, cartografiat în cadrul domeniului SDR între aa 209 și aa 273 (ref. 24). WWOX conține, de asemenea, atât un situs de legare a coenzimei, NAD(H) sau NADP(h) (GANSGIG, aa 131-137), cât și un situs potențial de legare a substratului (YNRSK, aa 293-297) (ref. 1). Domeniul C-terminal al WWOX (aa 125-414) este similar cu o regiune de interacțiune MAPT (http://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZC7).

Variante patogene germinale WWOX identificate la pacienții cu tulburări constituționale legate de WWOX (SCAR12, sindromul WOREE și DSD). a Variații ale numărului de copii (n = 12). DSD tulburare de dezvoltare sexuală, IF in frame, OOF out of frame, WOREE encefalopatie epileptică legată de WWOX. b Variații mononucleotidice (n = 23). MTS secvență de direcționare mitocondrială, NLS semnal de localizare nucleară, SRD dehidrogenază-reductază cu lanț scurt.

WWOX este tolerantă la variațiile missense cu o metrică de constrângere missense Z = -3,19 (Exome Aggregation Consortium).20 Multe CNV heterozigote care afectează total sau parțial această genă sunt observate în probele de control sănătoase (Database of Genomic Variants).25 Numărul mare de variații patogene/probabil patogene din bazele de date publice nu este surprinzător având în vedere un mod de moștenire autosomal recesiv pentru encefalopatia legată de WWOX.

WOX este exprimată în sistemul nervos în curs de dezvoltare la șoareci, inclusiv cortexul cerebral și cerebelul, din stadiile in utero până la vârsta adultă.26 Modelele animale au demonstrat epilepsie și ataxie cauzate de pierderea WWOX,3,27 sugerând un proces neurodegenerativ. Într-o analiză detaliată a literaturii de specialitate, Aldaz și colaboratorii au demonstrat în mod clar că WWOX se află la intersecția dintre cancer, sindrom metabolic și encefalopatie.28

Datele clinice și moleculare pentru toți pacienții din literatura de specialitate cu fenotipuri SCAR12 sau WOREE sunt descrise în tabelul suplimentar 3 (ref. 3,4,5,6,6,7,8,29,30). Alți doi pacienți, surori dintr-o familie arabă consangvină cu o variantă homozigotă WWOX (c.1228G>T; p.Gly410Cys), au fost, de asemenea, raportate de Alkhateeb et al. în 2016 (ref. 9), dar există îndoieli cu privire la patogenitatea variantei identificate în aceste cazuri. Ambii au prezentat întârzieri în vorbire și unul dintre ei a avut epilepsie de la vârsta de 2 ani. Prezentarea clinică în această familie este foarte ușoară în comparație cu sindromul WOREE observat la pacienții cu variante germinale bialelice patogene în WWOX. Această modificare de la glicină la cisteină în poziția 410 afectează un aminoacid aflat chiar la capătul părții terminale carboxilice a proteinei. În plus, această modificare de aminoacid este prezentă în formă homozigotă la doi indivizi din setul de date gnomAD. Deși predicțiile in silico sunt în favoarea patogenității acestei variante patogene missense (posibil dăunătoare prin PolyPhen-2), rolul său cauzal este îndoielnic în această familie. Prin urmare, am decis să excludem acești pacienți din analiza noastră de literatură.

Raportăm aici cea mai mare cohortă de indivizi cu un fenotip WOREE, constând în 20 de pacienți suplimentari cu variante patogene bialelice în WWOX moștenite de la părinți sănătoși (Tabelul suplimentar 1). Diagnosticele moleculare au fost obținute printr-o combinație de tehnici diferite (array-CGH, qPCR/MLPA, secvențiere Sanger direcționată, ES și WGS). Prin agregarea pacienților noștri cu toate cazurile raportate până în prezent în literatura de specialitate, sunt cunoscuți 37 de pacienți din 27 de familii cu un sindrom WOREE și variante patogene bialelice WWOX. Au fost identificate în total 29 de diferite alele patogene/probabil patogene (10 CNV-uri și 19 SNV-uri) (Fig. 1a, b). Intronii 5 și 8 ai genei WWOX sunt foarte mari, cu o dimensiune de 220 și, respectiv, 780 Kb. Aceștia acoperă 90% din secvența genomică WWOX și conțin puncte de ruptură de translocație pentru mielomul multiplu,28 în conformitate cu faptul că regiunile intronice mari sunt adesea recombinogene și predispuse la puncte de ruptură cromozomială. În consecință, duplicarea (o alelă) și deleția (cinci alele) care cuprind exonii 6-8 sunt cele mai frecvente CNV patogene observate la pacienții cu tulburări legate de WWOX (tabelele suplimentare 1 și 3). Toți pacienții din familii consangvinizate (10/27; 37%) s-au dovedit a fi homozigoți pentru aceeași alelă deleterioasă, o apariție frecventă în cazul tulburărilor autosomal recesive cu o prevalență scăzută. Proporția ridicată de familii cu un genotip care cuprinde unul sau două CNV-uri patogene (14/27; 52%) evidențiază necesitatea unei abordări cantitative pentru depistarea locusului WWOX la pacienții cu tulburări grave ale sistemului nervos central. La pacienții heterozigoți pentru o CNV care afectează mai mulți exoni, este important să se caute (1) un posibil genotip heterozigot compus pentru două CNV mici și necesitatea unei a doua analize cantitative prin MLPA sau qPCR la ambii părinți și (2) un SNV pe a doua alelă prin secvențiere Sanger țintită. În același mod, atunci când se efectuează secvențierea ES sau secvențierea selectivă a panelului de gene ca investigație de primă linie, căutarea CNV-urilor este esențială în această genă mare predispusă la deleții și duplicații, implicând toate sau o parte din secvențele sale codificatoare.

În acest studiu, raportăm opt noi variante patogene missense (tabelul suplimentar 2). Printre rezultatele secvențierii de mare randament a exomului și a panelului de gene vizate, variantele missense WWOX sunt numeroase. Patogenitatea lor este dificil de stabilit, deoarece WWOX are numeroase funcții și parteneri proteici. Am urmat liniile directoare ale Colegiului American de Genetică și Genomică Medicală (ACMG)31 pentru interpretarea și comentarea variațiilor missense în datele WWOX pentru a le clasifica ca fiind patogene, probabil patogene, variante de semnificație necunoscută (VUS), probabil benigne sau benigne. Pentru a ne ajuta în procesul de interpretare a variantelor, am utilizat un instrument online disponibil în mod deschis (http://www.medschool.umaryland.edu/Genetic_Variant_Interpretation_Tool1.html/) pentru a clasifica în mod eficient variantele pe baza categoriilor de dovezi descrise de orientările ACMG.31 Patru modificări aa (p., p., p., p., p.) sunt asociate în trans cu variantele nule într-o genă în care pierderea funcției este un mecanism cunoscut al bolii. Toate variantele missense identificate la indivizii cu encefalopatie legată de WWOX (11 modificări aa în 12 familii, Tabelul suplimentar 2) sunt prezise a fi cauzatoare de boală de către o combinație de softuri bazate pe web. Mai important, niciuna nu este prezentă în stare homozigotă în gnomAD.20 Toate variantele missense sunt clasificate ca fiind patogene sau probabil patogene în conformitate cu recomandările ACMG. Un pacient (P19) este purtător a trei variante patogene missense diferite: p.; (Tabelul suplimentar 1). Variantele p.(Lys200Glu) și p.(Thr358Ile) sunt localizate în cis; se preconizează că ambele modificări de aminoacizi sunt probabil patogene, deși treonina de la poziția 358 nu este localizată într-un domeniu funcțional cunoscut. Nu este posibil să se determine dacă una sau ambele variante sunt varianta cu sens greșit care cauzează boala în P19. În majoritatea cazurilor raportate aici și publicate în literatura medicală, variațiile de secvență WWOX sunt descrise la nivelul ADN-ului de bază. Toate variantele patogene missense, cu excepția uneia (P3; p.), sunt interpretate pe baza unor studii in silico fără dovezi experimentale (nicio secvență de ARN sau proteină analizată). În cazul P3, analiza ARN-ului total prin secvențierea Sanger a produselor PCR de transcriere inversă (RT-PCR) nu a reușit să detecteze nicio anomalie de splicing în leucocite. Studiile ARN nu au fost efectuate pentru ceilalți pacienți deoarece nu au fost disponibile probe de sânge adecvate la momentul diagnosticului molecular. SNV-urile exonice ar putea afecta situsurile fiziologice de splicing acceptor/donator, dar și potențiatorul de splicing exonic (exonic splicing enhancer) (ESE) și silențatorul de splicing exonic (exonic splicing silencer) (ESS). Mai mult, activarea situsurilor de splicing criptice de către SNV-uri este un mecanism patologic bine înțeles în multe afecțiuni genetice; un bun exemplu în acest sens este sindromul Hutchinson-Gilford progeria.32 Variantele missense ar putea avea, de asemenea, un impact asupra stabilității ARNm.33 Până la 10 % din variantele missense cunoscute asociate bolilor, dar numai 3 % din SNP-urile comune, modifică splicingul pre-ARNm.33 Este probabil ca o fracțiune din variantele missense prezise identificate la pacienții cu encefalopatie legată de WWOX să ducă la pierderea expresiei din cauza splicingului anormal. Acest lucru este cu atât mai probabil pentru o genă cu alele patogene de pierdere a funcției. În cazul variantelor patogene missense din domeniul SRD, absența substraturilor identificate face dificilă evaluarea impactului acestora asupra activității catalitice a WWOX. Caracterizarea modelelor animale knock-in, cum ar fi peștele zebră, ar oferi indicii cu privire la patogenitatea variantelor missense WWOX.

La un pacient care nu a fost inclus în acest studiu, s-a suspectat inițial un diagnostic molecular de encefalopatie legată de WWOX în fața unui genotip bialelic format din două SNV-uri în trans: o variantă fără sens (ENST00000566780.5:p.Gln72*) și o variantă missense (ENST00000402655:c.600T>A, p.Ser200Arg). Modificarea aa la poziția 200 afectează doar o proteină WWOX non-RefSeq de 311 reziduuri. Până în prezent, toate modificările aa patogene au fost descrise în funcție de proteina WWOX canonică (414 aa), care rezultă din traducerea unui transcript de 9 exoni (ENST00000566780.5, izoforma 1). Nu se știe dacă izoforma proteinei WWOX compusă din 311 reziduuri este relevantă pentru tulburările legate de WWOX. În plus, fenotipul la acest pacient a fost ușor în comparație cu sindromul WOREE. Din aceste motive, am decis să nu considerăm acest genotip ca fiind cauzal pentru encefalopatia acestui pacient.

WWOX, cancerul și bolile pulmonare?

WWOX este o genă supresoare de tumori implicată în modularea căilor legate de cancer prin intermediul interacțiunilor proteice-proteice dintre domeniile WW și diverse proteine oncogene. Pierderea proteinei WWOX a fost găsită în multiple neoplazii.23 Osteosarcoame și carcinoame pulmonare sunt observate la șoarecii Wwox-/-22, iar tumorigeneza este una dintre consecințele unui genotip hipomorf Wwox.34 O pierdere funcțională de copie CNV (67048) în WWOX a fost asociată în mod semnificativ cu un risc crescut de cancer la populațiile chineze.35,36,37 Mai recent, s-a demonstrat că pierderea expresiei WWOX în plămânul șoarecilor provoacă inflamație neutrofilică.38 În mod surprinzător, nu a fost niciodată raportată o creștere a numărului de cazuri de cancer, nici la pacienții cu variante germinale bialelice patogene WWOX, nici la părinții lor heterozigoți. Severitatea sindromului WOREE, cu o frecvență ridicată a decesului prematur în primii ani de viață, ar putea explica absența oricăror cazuri de cancer. Aceasta nu este o explicație convingătoare în cazul pacienților heterozigoți pentru o alelă nulă WWOX. Ablația Wwox nu este tumorigenă în toate modelele de animale knock-out; este mai probabil ca această genă supresoare tumorală putativă să aibă relevanță mai degrabă în progresia tumorală decât în inițierea în timpul oncogenezei. Acest studiu confirmă faptul că alterările WWOX din linia germinală nu sunt variante patogene conducătoare importante pentru inițierea și/sau progresia cancerului.

WWOX și DSD

WOX este foarte bine exprimată în țesuturile reglementate hormonal, cum ar fi hipofiza, testiculul și ovarul, și se presupune că joacă un rol în biosinteza gonadotropinelor sau a steroizilor sexuali.1,39 Se crede că domeniul enzimatic SRD din WWOX are un rol în metabolismul steroizilor cu substraturi încă neidentificate. Aceste observații și descrierea a două modele diferite de șoareci knockout WWOX cu anomalii gonadale34,39 susțin în mod clar un rol pentru WWOX în dezvoltarea gonadelor.

Prima rearanjare germinală a WWOX la om a fost asociată cu o DSD 46, XY.2 Pacientul avea țesut gonadal nediferențiat bilateral și testicule imature. El era heterozigot pentru o deleție a exonilor 6-8 moștenită de la mama sa, care avea un istoric personal de menarhă târzie. Se preconizează că această CNV are ca rezultat o deleție in-frame, cauzând un produs scurtat cu domeniul SRD în mare parte absent. Mai recent, trei VUS heterozigoți în gena WWOX au fost identificați prin ES la pacienți cu DSD (Fig. 1) (ref. 40). Din cunoștințele noastre, DSD nu a fost raportat la părinții heterozigoți ai pacienților cu sindromul WOREE și considerăm că implicarea SNV-urilor/CNV-urilor heterozigote în etiologia moleculară a DSD este discutabilă. Atrofia testiculară, fertilitatea redusă, anomaliile gonadale, disfuncția celulelor Leydig și dezvoltarea mamară deficitară fac parte din fenotipurile observate în mai multe modele animale de ablație WWOX.28 Din cunoștințele noastre, DSD nu este raportată în modele animale heterozigote knock-out. Cu toate acestea, rămâne posibilitatea ca un fenotip mai blând să poată fi identificat după o evaluare atentă a dezvoltării sexuale și a funcției gonadale la pacienții heterozigoți pentru o variantă patogenă WWOX.

Fenotipul SCAR12

În 2014, variante patogene homozigote missense în WWOX au fost identificate prin ES la șase pacienți din două familii consangvinizate cu ataxie spinocerebeloasă autosomal recesivă (SCAR12). Până în prezent, această asociere nu a fost confirmată în familii suplimentare. Pacienții afectați au prezentat ataxie cerebeloasă cu debut în copilărie, epilepsie tonico-clonică generalizată, dizabilitate intelectuală și spasticitate proeminentă.3 În comparație cu pacienții cu sindromul WOREE, pacienții cu fenotip SCAR12 au o întârziere de dezvoltare mai puțin severă: toți au fost capabili să meargă (4/4; 100%), 3 din 4 au fost capabili să vorbească și nu a fost raportat niciun deces prematur. Atunci când a fost efectuat, RMN-ul cerebral a arătat o ușoară hipoplazie cerebeloasă (2/2; 100%) la pacienții afectați, o caracteristică care nu a fost observată în cohorta noastră. Deși epilepsia a fost o trăsătură constantă la pacienții SCAR12, convulsiile au răspuns mai des la medicamente antiepileptice (2/4; 50%). Implicarea ochilor a fost, de asemenea, prezentă, cu nistagmus raportat la patru pacienți. Această formă de ataxie cerebeloasă autozomal recesivă legată de WWOX pare a fi o afecțiune genetică rară. Severitatea fenotipului WOREE și decesul prematur la o parte dintre pacienți ar putea ascunde probleme de echilibru legate de disfuncția cerebeloasă. Sunt necesare cazuri suplimentare de ataxie cerebeloasă legată de WWOX pentru a confirma implicarea sa în această tulburare neurologică.

Fenotipul WOREE

La scurt timp după descrierea fenotipului SCAR12, WWOX a fost implicat într-o formă recesivă de encefalopatie epileptică infantilă la 17 pacienți din 9 familii.4,5,6,7,8,9,30 Noi mai mult decât dublăm numărul de cazuri cu 20 de pacienți afectați din 18 familii suplimentare. Fenotipul pacienților noștri este în concordanță cu cel din rapoartele anterioare. Am observat o rată mai mică de consangvinitate în cohorta noastră, în concordanță cu proporția mai mare de genotipuri heterozigote compuse descrise în acest studiu. Aceste genotipuri ar fi putut fi ratate anterior atunci când array-CGH sau secvențierea de mare capacitate au fost efectuate independent. Implementarea predicției CNV din datele de secvență exomică facilitează identificarea pacienților cu genotipuri WWOX compuse atât din SNV, cât și din CNV.

Un făt cu anomalii cerebrale și posibile convulsii intrauterine a fost raportat în 2015 (ref. 7). Mișcările fetale diminuate au fost raportate ocazional în seria noastră (3/20), în timp ce transluciditatea nucală crescută a fost cel mai frecvent semn în timpul sarcinii în rapoartele anterioare (4/17). Contracturile mâinilor și picioarelor au fost raportate la 5 pacienți din cohorta noastră și la 3 pacienți din literatura de specialitate4,5,6 în perioada prenatală sau neonatală. Diminuarea mișcărilor fetale, transluciditatea nucală crescută și anomaliile mâinilor sau picioarelor ar putea fi semne prenatale ale bolii, dar nu sunt nici specifice, nici caracteristici clinice frecvente.

În contrast cu literatura de specialitate, întârzierea creșterii (6%) și microcefalia (20%) nu au fost caracteristici proeminente la pacienții noștri care au prezentat o înălțime medie scăzută normală (-1,1 DS) și un OFC mediu (-1,4 DS). Dismorfismul a fost raportat la mai mult de jumătate dintre pacienți. Cele mai izbitoare caracteristici au fost o față rotundă cu obraji plini, un gât scurt și un aspect facial hipotonic (Fig. 2). La pacienții P15 și P16, la vârste mai înaintate, hipotonia facială era încă prezentă, dar fața a devenit mai triunghiulară. Probleme medicale suplimentare au fost scolioza sau cifoza cu debut precoce (65%), care ar putea orienta diagnosticul, precum și probleme de alimentație care au necesitat sondă de hrănire la 70% dintre pacienți și probleme respiratorii (40%), așa cum se observă în alte encefalopatii infantile.

Toți pacienții au avut întârzieri severe de dezvoltare. Niciunul dintre ei nu a fost capabil să stea, să vorbească sau să meargă. Examenul neurologic a arătat hipotonie axială și hipertonie distală la majoritatea pacienților. Ocazional au fost observate mișcări distonice. Așa cum s-a raportat în literatura de specialitate, toți pacienții au avut epilepsie cu debut precoce (100%), cu crize zilnice și rezistență la medicamente observată în majoritatea cazurilor (95%). Nu a existat o susceptibilitate majoră la crize febrile. Sindromul West caracterizat prin spasme și hipsaritmii înregistrate pe EEG a fost raportat la 26% dintre pacienți. Au fost observate convulsii focale, generalizate și combinate. Au fost descrise crize tonice, clonice, tonico-clonice și mioclonice, precum și spasme și absențe infantile. Astfel, epilepsia a fost foarte severă, cu debut precoce și cu o manifestare variabilă a crizelor principale. Așa cum a fost descris anterior, afectarea vizuală pare să facă parte din spectrul clinic al sindromului WOREE. Cei mai mulți dintre pacienții afectați nu aveau contact vizual (75%). Aproximativ jumătate dintre ei au prezentat o alterare a fundului de ochi (47%) și/sau teste electrodiagnostice (45%) care sugerează atrofie optică și/sau distrofie retiniană. Prin urmare, examinarea oftalmologică timpurie poate oferi indicii de diagnosticare la pacienții cu convulsii cu debut precoce și întârziere în dezvoltare. Rezonanța magnetică cerebrală (Fig. 3) a fost anormală la 80% dintre pacienți, evidențiind în principal hipoplazia corpului calos (75%) și atrofia cerebrală (55%). Am confirmat în cohorta noastră că decesul prematur este o caracteristică a sindromului WOREE, care a apărut la opt pacienți (40%) cu o vârstă medie la deces de 40 de luni. Severitatea epilepsiei și afectarea neurologică pot fi legate de decesul precoce la pacienții afectați.

Imaginea prin rezonanță magnetică cerebrală (RMN) a indivizilor cu sindromul de encefalopatie epileptică legată de WWOX (WOREE). a-j Corp calos hipoplastic pe planuri sagitale. k-q Atrofie cerebrală și spații subarahnoidiene mărite pe planuri axiale (P4, P6, P14) și coronale (P3, P7, P17). r-t Hipersemnal simetric al substanței albe pe T2 axial. u-v Plagiocefalie și ventricul lateral asimetric pe planuri T2 axiale. w P19 leziuni circulare T1 sagitale (hiposemnal) ale părții mediale a corpului calos. m lună, P pacient, y an.

Semnele clinice principale la pacienții cu WOREE publicate anterior sunt rezumate în tabelul suplimentar 4. Din această trecere în revistă putem concluziona că WOREE este o encefalopatie epileptică foarte severă caracterizată prin mobilitate spontană slabă, absența dezvoltării limbajului și a achiziției mersului, crize rezistente la medicamente cu debut precoce, afectare oftalmologică și o probabilitate mare de deces prematur. Trăsăturile dismorfice (față rotundă hipotonă, obraji plini și gât scurt) și deformarea coloanei vertebrale pot fi semne asociate precoce care pot susține diagnosticul.

Corelații fenotip/genotip

Corelațiile fenotip/genotip au fost sugerate recent pentru tulburările de neurodezvoltare legate de WWOX5,7 cu o clasificare a genotipurilor WWOX în trei grupe. În conformitate cu clasificarea provizorie, pacienții purtători a două alele nulă prezise au fost mai susceptibili de a prezenta cel mai sever fenotip WOREE, în timp ce genotipurile hipomorfe cu două variante missense ar duce în schimb la ataxie spinocerebeloasă (SCAR12). Fenotipul pacienților purtători de o alelă nulă și de o variație patogenă missense ar fi intermediar.5 Studiul nostru amplu oferă o reevaluare a acestor corelații preliminare.

Cea mai severă prezentare clinică pare să fie asociată cu genotipurile care constau în codoni de oprire prematură timpurie care corespund unui knockdown complet WWOX. Aceste genotipuri sunt observate la șapte pacienți: deleție homozigotă a exonului 1 până la 4 în P10, codoni de oprire homozigoți p.(Arg54*) și p.(Trp44*),4,30 deleție homozigotă a primilor șase exoni.7 Decesul prematur înainte de 2 ani a survenit în 5/7 cazuri, iar într-o familie au fost detectate anomalii cerebrale în perioada prenatală. În plus, moartea prematură nu a fost niciodată descrisă la pacienții cu genotipul variantă patogenă missense-only (tabelele suplimentare 1 și 3). Caracterizarea precisă a variantelor missense și a CNV-urilor la nivel proteic cu studii funcționale ar putea oferi indicii despre modul în care genotipurile ar putea explica diferite prezentări clinice, în special în ceea ce privește fenotipurile SCAR12/WOREE.

În concluzie, variantele patogene germinale în WWOX sunt clar asociate cu o encefalopatie epileptică severă cu debut precoce numită sindrom WOREE și raportăm aici cea mai mare cohortă de indivizi cu această tulburare neurologică. Implicarea variantelor constituționale WWOX în DSD și SCA necesită încă studii de replicare.

.