Transformarea erbicidelor de către ciupercile de putregai alb

Este bine documentat faptul că o gamă largă de poluanți, inclusiv pesticide, sunt transformați și degradați de către FRM: pentaclorofenoli, izoproturon, derivat de izoxaflutole, atrazină, simazină, propazină, lindan, atrazină, diuron, terbutilazină, metalaxil, DDT, dieldrin, aldrin, heptaclor, clordan, etc. . Această listă poate fi extinsă, având în vedere dovezile solide privind potențialul de degradare al FRM față de diferite clase de poluanți. Datele privind degradarea erbicidelor de către WRF sunt rezumate parțial în tabelul 2. Trebuie menționat faptul că un număr mare de lucrări au fost realizate utilizând condiții staționare pe medii lichide și condiții de fermentare în sistem solid. Cu toate acestea, există date contradictorii cu privire la nivelul de degradare a erbicidului, la rolul enzimelor lignolitice în această procedură și, de asemenea, la mecanismul de degradare.

Diverse ciuperci, cum ar fi Agrocybe semiorbicularis, Auricularia auricula, Coriolus versicolor, Dichomitus squalens, Flammulina velupites, Hypholoma fasciculare, Pleurotus ostreatus, Phanerochaete velutina și Stereum hirsutum și-au demonstrat capacitatea de a degrada diverse erbicide, cum ar fi atrazina, diuron și terbutilazina, cu eficiențe diferite . Coriolus versicolor, Hypholoma fasciculare și Stereum hirsutum au degradat mai mult de 86% din diuron, atrazină și terbutilazină în 6 săptămâni. Acestea au fost, de asemenea, cele mai active în producția de enzime ligninolitice. Cu toate acestea, capacitatea WRF de a degrada erbicidele aromatice, diuron, atrazină și terbutilazină, nu a fost corelată cu activitatea lor ligninolitică determinată în testul de decolorare Poly R-478 (care este utilizat ca indicator al activității ligninolitice). Posibila explicație a acestor rezultate a fost diferența dintre modelele LME produse de ciuperci în culturi lichide. Este interesant faptul că, în cadrul testelor de teren, cea mai eficientă tulpină S. hirsutum a fost inactivă în degradarea erbicidului, iar celelalte tulpini C. versicolor și H. fasciculare au demonstrat o degradare a cloropirifosului de 30% în 6 săptămâni .

Fungii de putregai alb Phanerochaete chrysosporium și Trametes versicolor au transformat până la 35-40% din diketonitril (un produs de transformare în sol a erbicidului isoxaflutol) în analog de acid benzoic inactiv după 15 zile în condiții staționare pe medii lichide . Nivelul enzimelor ligninolitice, cum ar fi lactazele, produse în timpul fermentării a părut să fie corelat cu degradarea erbicidului, confirmând rolul acestor enzime în procesele de degradare. Cu toate acestea, autorii au subliniat că inducerea de șase ori a producției de lactază prin adăugarea de 2,5-xilidină nu a condus la o creștere semnificativă a scindării dicetonitrilului.

S-a demonstrat că Coriolus hirsutus, Cerrena maxima, Coriolopsis fulvocinerea și co-cultivarea Coriolus hirsutus/Cerrena maxima pot degrada atrazina în condiții de cultivare submersă; eliminarea erbicidului a fost de 77-91% după 40 de zile de cultivare. Este interesant de menționat faptul că s-a constatat că pe miceliu au fost absorbite cantități neglijabile de atrazină. Activitatea lactazei a fost destul de ridicată, ceea ce permite propunerea participării lactazei la degradarea atrazinei de către aceste ciuperci. Această ipoteză a fost susținută de studiul degradării atrazinei în prezența unor inductori de lactază (guayacol și siringaldezină) în cultură submersă . Eficiența de degradare a erbicidului a fost mai mare în culturile induse cu 78-98%, iar cel mai înalt nivel de eliminare a atrazinei a fost atins pentru Coriolopsis fulvocinerea folosind guaiacol ca inductor.

Hiratsuka și colab. au raportat că Coriolus versicolor IFO 30340 a degradat 30% din cloronitrofen (CNP) și 80% din nitrofen (NIP) după 12 zile de cultivare în condiții staționare pe mediu lichid. Rata de degradare a erbicidului a depins de concentrația de azot din mediu și a fost mai mare în condiții de azot scăzut, sugerând că sistemul de degradare a ligninei a fost responsabil pentru degradarea erbicidului. Cu toate acestea, LiP, MnP și lactaza, precum și filtratul de cultură nu au oxidat erbicidele. Nici cloronitrofenul și nici nitrofenul nu au fost oxidate de sistemul lacază – mediator redox folosind HBT, care este un binecunoscut mediator redox al lacazei. Aceste rezultate duc la concluzia că enzimele ligninolitice extracelulare nu au fost implicate în etapa inițială a degradării CNP sau NIP de către Coriolus versicolor IFO 30340. Identificarea secvențială a produselor formate în timpul metabolizării CNP și a intermediarilor săi de către C. versicolor a permis autorilor să propună patru căi diferite de degradare a CNP: hidroxilarea aromatică, declorurarea oxidativă, declorurarea reductivă și reducerea grupării nitro la amină. S-a presupus că hidroxilarea aromatică pentru a forma 2,4,6-tricloro-3-hidroxi-4′-nitrodifenil eter și declorurarea oxidativă pentru a forma 2,4-dicloro-6-hidroxi-4′-nitrodifenil eter sunt catalizate de enzime de tip citocrom P450, deoarece aceste căi au fost blocate eficient prin adăugarea exogenă de butoxid de piperonil, un inhibitor P450. Transformarea CNP în NIP de către Coriolus versicolor IFO 30340 ar trebui să fie o declorinare reductivă. Reacțiile de declorinare reductivă au fost implicate în degradarea pentaclorofenolului de către P. chrysosporium . CNP a fost, de asemenea, transformat în 2,4,6-tricloro-4′-aminodifenil eter de către C. versicolor. Reacțiile de declorinare reductivă și de nitro-reducere au fost, de asemenea, găsite ca reacții inițiale în degradarea CNP, care au fost îmbunătățite prin adăugarea inhibitorului citocromului P450. Hidroxilarea aromatică și declorarea oxidativă au fost, de asemenea, observate în timpul conversiei fungice a CNP; cu toate acestea, produsele formate nu au fost identificate – s-a presupus că acestea sunt fie 2,4-dicloro-3-hidroxi-4′-nitrodifenil eter, fie 2,4-dicloro-6-hidroxi-4′-nitrodifenil eter și 2-cloro-4-hidroxi-4′-nitrodifenil eter sau 2-hidroxi-4-cloro-4′-nitrodifenil eter, respectiv 2-hidroxi-4-cloro-4′-nitrodifenil eter. Conversia fungică a NIP a fost, de asemenea, inhibată în mod eficient de butoxida de piperonil.

Pe baza rezultatului obținut, autorii au presupus că citocromul P450 a jucat un rol important în scăderea potențialului de ionizare a substanțelor aromatice persistente în mediu și în furnizarea de substraturi adecvate pentru enzimele ligninolitice oxidante cu un singur electron pentru o degradare eficientă. Atunci când difenil eterul, 4-clorodifenil eterul și 4-nitrodifenil eterul au fost adăugate la cultura fungică, 4-hidroxidifenil eterul, 4-cloro-4′-hidroxidifenil eterul și, respectiv, 4-nitro-4′-hidroxidifenil eterul au fost identificate ca produse principale. 4-clorofenolul și 4-nitrofenolul au fost detectate în cantități infime din 4-clorodifenil eter și, respectiv, 4-nitrodifenil eter, dar nu a fost observată hidrochinona omologă. Aceste date sugerează că formarea de produse fenolice fie din inelul A, fie din inelul B al CNP ar putea fi derivată printr-o cale diferită și că este posibil ca scindarea directă a eterului să nu fi avut loc. Aceste constatări au oferit dovezi că ciupercile au degradat erbicidele prin diferite căi folosind sistemele lor metabolice multiple.

Ganoderma lucidum s-a dovedit a fi rezistentă la erbicidele diuron și bentazon : limitele superioare au fost de 80 µM și, respectiv, 20 mM. Această constatare poate fi explicată prin toxicitatea mai mare a metaboliților formați în timpul transformării diuronului. S-a raportat anterior că unii dintre metaboliții rezultați în urma transformării fungice a diuronului pot fi chiar mai toxici decât compusul mamă. G. lucidum a fost capabil să elimine eficient 55% din diuron și 88% din bentazon după 10 zile de cultivare în culturi lichide. Atât bentazonul, cât și diuronul au îmbunătățit puternic producția de lactază de către ciupercă, inducând una dintre cele două izoforme de lactază. Analiza PAGE nativă a enzimelor extracelulare a arătat că îmbunătățirea activității lacazei ca răspuns la erbicide nu s-a datorat exprimării unei noi lacaze, ci s-a datorat supraproducției unei izoforme deja existente în culturile neinduse. Rezultate similare au fost obținute cu Trametes versicolor și Abortiporus biennis , unde lactazele lor constitutive au fost supraproduse în prezența paraquatului, un erbicid cu azot cuaternar. Analiza electroforetică a enzimelor extracelulare de la G. lucidum a arătat că lactaza1 a fost enzima dominantă în condiții neinduse. Este interesant faptul că erbicidele au indus doar izoforma lacaza2, în timp ce lacaza1 a fost suprimată în aceste culturi. Aceste rezultate sugerează că lacaza2 este, probabil, izoforma mai intens implicată în sistemul de apărare al ciupercii, având în vedere că ambele erbicide au inhibat puternic creșterea ciupercii. Aceste observații arată că aceste tipuri de enzime au, cel puțin în parte, un rol important în degradarea poluanților în condiții in vivo.

S-a realizat studiul comparativ al degradării erbicidului bentazon de către Ganoderma lucidum în culturi lichide și în stare solidă, folosind ca substrat știuleții de porumb . Ciuperca a fost mai rezistentă la erbicid și mai eficientă în degradarea acestuia în culturile în stare solidă în comparație cu culturile lichide: 50 mM față de 20 mM și 90% față de 55%, respectiv. Autorii au propus două posibile explicații, care nu se exclud reciproc: o disponibilitate mai mică a erbicidului datorită adsorbției acestuia pe substratul insolubil știulete de porumb pentru această observație și activitățile mai mari atât a lacazei, cât și a peroxidazei Mn în culturile în stare solidă în comparație cu culturile lichide, unde a fost detectată o activitate ridicată a lacazei. Cu toate acestea, nu au fost găsiți produși metaboliți în extractele apoase și metanolice combinate. În cazul G. lucidum care conțin lactază și peroxidază Mn s-au dovedit a degrada bentazon in vitro. Experimentele cu adăugarea de Mn2+, ABTS, Tween 80 și H2O2 la filtratele brute au demonstrat sinergii în degradarea bentazonului, sugerând că atât lactaza, cât și peroxidaza Mn sunt implicate în degradarea acestuia. Este bine cunoscut faptul că ABTS mediază oxidarea compușilor nefenolici ai ligninei, iar prezența acizilor grași nesaturați (Tween 80) îmbunătățește procesul de oxidare catalizat de Mn peroxidaze și lacaze datorită producerii de radicali peroxil sau alcoxil lipidici . Mecanismul ipotetic de degradare a bentazonului ar putea fi următorul: Mn peroxidaza și lactaza au generat radicali lipidici peroxil sau alcoxil; în prezența acestor radicali, Mn peroxidaza oxidează Mn2+ în Mn3+, care, la rândul său, oxidează bentazonul, în timp ce lactaza utilizează ABTS ca mediator redox pentru oxidarea bentazonului. Cu toate acestea, în culturile lichide nu s-a observat nicio degradare a picloramului G. lucidum și Trametes sp. în culturile lichide, poate din cauza substituției sale ridicate a inelului aromatic . Acest erbicid a sporit producția de lactază de către Trametes sp., în timp ce producția de enzime de către G. lucidum a fost suprimată. Autorii au presupus că inhibarea producției de enzime ar putea avea loc la nivelul ARNm după ce picloramul a intrat în celulă sau prin modificarea enzimei înainte sau după secreție . Expunerea lui G. lucidum și Trametes sp. la picloram a evidențiat un mecanism particular de bioacumulare tranzitorie a erbicidului de către ambele ciuperci.

Cel mai studiat FRM este P. chrysosporium, care s-a dovedit a degrada o gamă largă de erbicide în condiții diferite. MCPA și bentazon au fost degradate de P. chrysosporium în proporție de 65% și, respectiv, 75%, în 20 de zile . P. chrysosporium a degradat isoproturon aparținând grupurilor de feniluree , atrazină , precum și diuron . Cu toate acestea, conform , nu s-a observat nicio degradare a atrazinei de către această ciupercă în culturile lichide. Eficiența de degradare a P. chrysosporium a fost mai mare în culturile în stare solidă în comparație cu cele lichide . Au fost propuse două mecanisme de degradare a erbicidelor: acțiunea enzimelor ligninolitice și acțiunea enzimelor intracelulare, în special a citocromului P450. În , a fost studiată degradarea diuronului de către P. chrysosporium, inclusiv identificarea produselor formate și evaluarea rolului citocromului P450. Două constatări au fost de mare importanță: cantitățile considerabile de diuron, DCPMU , și DCPU găsite în miceliile proaspete și inhibarea degradării diuronului de către ABT (1-aminobenzotriazol), un inhibitor al citocromului P450. Aceste rezultate au confirmat mecanismul intracelular de degradare a acestui erbicid care are ca rezultat N-demetilarea. Cu toate acestea, după 5 zile, concentrațiile de DCPMU și DCPU au fost mai mari în filtratele de cultură decât în extractele de miceliu, sugerând o posibilă implicare a enzimelor lignolitice în degradarea acestor metaboliți. Conform da Silva Coelho-Moreira și colab. , extractele brute enzimatice furnizate cu combinații de alcool veratrilic H2O2 și Mn2+ nu au degradat erbicidul, este posibil ca DCPMU și DCPU să poată fi transformate în continuare de MnP.

P. chrysosporium este, de asemenea, capabil să transforme atrazina, produsul său de transformare și alte erbicide s-triazinice . Prima și principala etapă în calea de degradare a s-triazinei clorurate de către ciupercă a fost mono-N-dealchilarea. Hidroxiatrazina a fost principalul produs de degradare găsit în solurile tratate cu atrazină și în culturile lichide. P. chrysosporium a transformat în mod activ hidroxiatrazina într-un compus necunoscut care s-a acumulat în mediul de cultură. S-a stabilit că prezența atât a grupărilor alchil, cât și a clorului în poziția 2 sunt necesare pentru mono N-dealchilarea atrazinei de către P. chrysosporium. În consecință, formarea de desethylhydroxyatrazine în culturile lichide ar trebui să rezulte din hidroliza deethylatrazinei. Experimentele cu terbutilazină, atrazină și simazină arată, de asemenea, că eliminarea lanțului lateral etilic este reacția preferențială și ar putea depinde de masa celei de-a doua grupări alchil. Cu alte cuvinte, se așteaptă ca compușii cu un grup de masă mare legat de un substituent amino să sufere o N-dealchilare mai mare care afectează celălalt lanț. Compușii simetrici propazină și simazină au fost, de asemenea, degradați într-un ritm mai lent decât atrazina. Nici LiPs și nici MnPs nu au transformat atrazina și metaboliții săi N-dealchilați. S-a demonstrat că N-dealchilarea atrazinei a scăzut în prezența unui inhibitor al citocromului P450. În plus, degradarea erbicidului a fost susținută de miceliu. Prin urmare, s-a presupus implicarea citocromului P450 în degradarea atrazinei. Aceste date sunt în concordanță cu studiul publicat anterior privind degradarea atrazinei de către Pleurotus pulmonarius, care a implicat enzime precum lipoxigenaza, peroxidaza și citocromul P-450 . Mn2+, care activează aceste enzime, a stimulat transformarea atrazinei în metaboliți N-dealchilați și propilhidroxilați, în timp ce antioxidanții și inhibitorii lipoxigenazei și peroxidazei (acid nordihidroguaiaretic), precum și ai citocromului P-450 (butoxid de piperonil) au suprimat degradarea acesteia.

Pentru a analiza datele prezentate în tabelul 2, rata de dispariție a erbicidului a fost calculată ca raport între dispariție (%) și durata degradării (zile), urmată de un calcul al valorii medii pentru fiecare erbicid (Fig. 1). Luând în considerare efectul condițiilor de cultivare asupra degradării erbicidelor de către ciuperci, au fost tratate în acest mod numai datele privind condițiile staționare pe medii lichide.

Rezultatele obținute corespund bine studiului , în care s-a stabilit că prezența grupărilor alchil este necesară pentru degradarea erbicidelor s-triazinice de către P. chrysosporium prin mono N-dealchilare. Mai mult, capacitatea ciupercilor WRF de a degrada s-triazinele pare să crească odată cu creșterea cantității de grupări alchilice exact ramificate. Cu toate acestea, ar trebui efectuate studii cantitative detaliate privind structura și activitatea de degradare pentru a dovedi sau infirma această observație preliminară. O altă concluzie importantă este o influență negativă marcată a clorului din molecula erbicidului asupra vitezei de degradare, care poate fi observată prin compararea vitezei de degradare a nitrofenului (un atom de clor) și a clornitrofenului (trei atomi de clor) și a celei mai mari viteze de degradare a bentazonului, care este singurul erbicid fără clor din gama prezentată (Fig. 1). Prin urmare, datele prezentate în Fig. 1 demonstrează în mod clar necesitatea absolută a unor studii QSAR suplimentare. Împreună cu cunoașterea principalelor căi enzimatice de degradare a erbicidelor, acestea din urmă vor îmbunătăți semnificativ evaluarea preliminară a capacității de degradare a FRM în raport cu erbicidul cu structură cunoscută.

Datele contradictorii privind participarea enzimelor ligninolitice la degradarea și transformarea erbicidelor nu au permis stabilirea rolului lor precis în aceste procese . Am sintetizat în tabelul 3 datele privind eficiența enzimelor ligninolitice individuale, a amestecurilor acestora și a sistemelor enzime – redox-mediator în degradarea erbicidelor. După cum se poate observa, nu s-a observat nicio degradare a dicetonitrilului, diuronului, atrazinei, cloronitrofenului, nitrofenului, glifosatului pentru extractele brute MnP și LiP și enzimele purificate din P. chrysosporium, Trametes versicolor și Coriolus versicolor, chiar și în prezența mediatorilor redox . Cu toate acestea, MnP din P. chrysosporium a degradat Irgarol 1081 până la 37% după 24 de ore, iar LiP din P. chrysosporium a degradat bentazon până la 100% după 4 ore . Mai mult, bentazon a fost transformat în mod eficient de lactază cu catecol, lactază și extracte brute de MnP cu mediator redox ABTS, MnP recombinant . Analiza datelor rezumate în tabelul 3 trage concluzia că sistemele MnP, lacaza și lacaza – redox-mediator sunt cele mai eficiente instrumente de degradare a unei game largi de erbicide – diketonitril, glifosat, Pesticide Mix 34, cloroxuron, atrazină și dymron , cu câteva excepții, însă, și anume, coronitrofen și nitrofen . Trebuie subliniat faptul că eficiența sistemelor lacază – mediator redox față de diferite erbicide depinde în mare măsură de mediatorul redox utilizat, care, la rândul său, depinde de mecanismele de oxidare a mediatorilor de către enzimă și de reactivitatea intermediarilor mediatorilor.

In the study of atrazine degradation with purified laccase from Coriolopsis fulvocinerea, nu s-a observat nicio degradare a erbicidului (Koroleva & Gorbatova, date nepublicate). Screeningul mediatorilor redox (siringaldezină, PF6, , HBT) a arătat că numai HBT a determinat scăderea concentrației de atrazină în sistemul lactază-atrazină-redox-mediator. Un studiu mai detaliat al componentelor sistemului model „atrazină/lactază/HBT” a arătat că HBT însuși a reacționat cu atrazina și cu alți derivați de atrazină cu conținut de clor direct, fără implicarea lactazei, și nu a interacționat cu derivații hidroxi ai atrazinei. Se știe că HBT în soluție apoasă poate trece în formă ionică. Prin urmare, s-a sugerat că se pot forma doi produși, ambii constând din HBT și atrazină, prin formarea de legături (-N-O-C-) în poziția (2) a atrazinei. Adăugarea de lactază la o soluție de HBT/Atr a dus la formarea mai multor produși, unul dintre ei având un timp de retenție corespunzător cu cel al compusului HBT-Atr. În reacțiile enzimatice, s-au format alți doi produși cu timpi de retenție de 15,3 min și 19,4 min, care au fost identificați ca fiind de-etilatrazina (DEA) și compusul format prin interacțiunea dintre DEA și HBT. Astfel, adăugarea de enzimă a dus la formarea de noi produse diferite de cele formate în reacția HBT cu atrazina. Sistemul model „atrazină/lactază/HBT” a fost studiat la diferite rapoarte molare de atrazină/mediator (de la 9:1 la 1:9) și la două concentrații diferite de enzimă (0,02 μm și 1,0 μm). Cea mai profundă conversie a atrazinei – până la 70% în 10 zile – a fost observată la un raport HBT/Atr de 9/1 și o concentrație a enzimei de 0,02 μm. Rezonanța magnetică nucleară cu protoni (1H-NMR) și HPLC-MS/MS au permis confirmarea identificării produsului în sistemele model „Atr/HBT” și „Atr/HBT/lacază”: formarea de Atr-HBT în sistemul „Atr/HBT” și DEA și DEA-HBT în sistemul „Atr/HBT/lacază”. Atr-HBT a existat în două forme: protonat (greutate medie 315 g/mol) și diprotonat (greutate medie 316 g/mol). În reacția „Atr/HBT/lacază” se formează DEA, precum și formele protonate (greutate medie 287 g/mol) și diprotonate (greutate medie 288 g/mol) ale produsului DEA-HBT. Pe baza datelor obținute pentru cele cinci structuri stabilite ale produșilor, am propus schema de oxidare a atrazinei prin sistemul „lactază/HBT” (Fig. 2), care include etape neenzimatice și enzimatice (Fig. 3).

În timpul etapei neenzimatice, se formează un produs format din atrazină și HBT. Deoarece substraturile și produsele din sistemul „Atr/HBT” se află în echilibru, adăugarea de lactază la reacție determină oxidarea HBT și formarea radicalului HBT. Radicalul HBT reacționează cu compusul Atr-HBT și declanșează disocierea legăturilor (-NH-CH-), ducând la formarea de DEA-HBT și alcool etilic. La rândul său, DEA-HBT se descompune pentru a forma doi produși: DEA și HBT. Capacitatea HBT de a forma forme tautomere și de a reacționa direct cu atrazina a sugerat că HBT se va degrada în amestecul de reacție. Cu toate acestea, conform schemei propuse, în timpul hidrolizei DEA-HBT, s-au format DEA și HBT. Acesta poate fi unul dintre motivele eficacității HBT ca redox-mediator în sistemul lactază – redox-mediator.

Potențialul ridicat al FRM, precum și al enzimelor lignolitice ale acestora în transformarea erbicidelor este bine documentat. Cu toate acestea, mecanismele de degradare și căile de degradare pentru multe erbicide sunt încă neexplorate. Sunt necesare studii suplimentare pentru a elucida mecanismul de degradare a erbicidelor de către WRF și enzimele ligninolitice și pentru a identifica metaboliții formați.

.