Principii de secvențiere a bisulfitului întregului genom

Studiile epigenetice au confirmat faptul că modificarea ADN-metilării unor regiuni genetice specifice joacă un rol important în conformația cromozomului și în reglarea expresiei genice. Metilarea reziduurilor de citosină din ADN la C5 (5meC) este un marcaj epigenetic comun la multe eucariote și se găsește pe scară largă în CpG sau CpHpG (H=A, T, C). Există în principal trei abordări, inclusiv digestia cu endonucleaza, îmbogățirea prin afinitate și conversia cu bisulfit (tabelul 1). Aproape toate abordările de analiză a metilației ADN specifice secvenței necesită un tratament dependent de metilare înainte de amplificare sau hibridizare pentru a menține fidelitatea. Diverse tehnici de biologie moleculară, cum ar fi secvențierea de generație următoare (NGS), sunt efectuate ulterior pentru a detecta reziduurile 5meC.

Tabel 1. Principiile principale ale analizei de metilare bazate pe NGS.

*MCA: amplificare a insulelor CpG metilate; *HELP: HpaII tiny fragment enrichment by ligation-mediated PCR; *MSCC: methylation-sensitive cut counting; *MeDIP-seq: methylated DNA immunoprecipitation; *MIRA: methylated CpG island recovery assay; *RRBS: reduced representation bisulfite sequencing; *WGBS: whole genome bisulfite sequencing; *BSPP: bisulfite padlock probes.

Conversia bisulfitului a stimulat o revoluție în analiza metilării genomului în anii 1990. Deoarece bisulfitul poate converti citozinele nemetilate din genom în uracili și apoi înlocuite cu timine în timpul amplificării PCR, care pot fi distinse de citozina modificată inițial prin metilare prin numărarea citozinilor și timinelor pentru fiecare poziție după secvențiere (figura 1). Secvențierea cu bisulfit a întregului genom (WGBS), ca metodă de cercetare de mare importanță în acest domeniu, aplică o combinație de tratament cu bisulfit și tehnologii de secvențiere de generație următoare/ a treia (în principal, secvențiere shotgun) pentru a studia metilarea ADN la nivel genomic.

Figura 1. Conversia bisulfitului și amplificarea PCR înainte de secvențierea ADN.

Avantajele secvențierii bisulfitului întregului genom

• Face posibilă realizarea profilului de metilare la nivelul întregului genom la nivelul unei singure baze.
• Evaluarea stării de metilare a aproape fiecărui locus CpG, inclusiv a „deșerturilor genetice” intergenice, a domeniilor de metilare parțială și a elementelor de reglementare la distanță.
• Dezvăluirea nivelurilor absolute de metilare a ADN-ului și a fondului secvenței de metilare.

Fluxul de lucru al secvențierii cu bisulfit a întregului genom

Pe scurt, etapele de bază ale secvențierii cu bisulfit a întregului genom (WGBS) includ extracția ADN-ului, conversia cu bisulfit, pregătirea bibliotecii, secvențierea și analiza bioinformatică. Aici folosim Illumina HiSeq ca exemplu pentru a ilustra fluxul de lucru al WGBS.

Figura 2. Fluxul de lucru al secvențierii bisulfite a întregului genom (Khanna et al. 2013).

• Extracția ADN-ului

În primul rând, aproximativ 1-5 mg de probe de țesut colectate de la oameni, animale, plante sau microorganisme sunt pregătite pentru ADN. În general, eșantioanele pentru secvențierea bisulfitului întregului genom trebuie să îndeplinească următoarele patru caracteristici.

i. Eucariote;

ii. Hipometilare (așa cum se arată în figura 3, studiile au arătat că, odată ce numărul de situri CpG dintr-o regiune crește, datele de secvențiere ale WGBS încep să scadă);

iii. Genomul său de referință a fost asamblat cel puțin până la nivelul scheletului;

iv. Adnotări relativ complete ale genomului. Și apoi, se aplică un kit adecvat pentru a extrage ADN de înaltă puritate și de mare greutate moleculară. ADN-ul extras ar trebui să aibă o masă nu mai mică de 5 μg, o concentrație nu mai mică de 50 ng/ul și o OD260/280 de 1,8 până la 2,0.

Figură 3. Tehnologia WGBS convențională are o acoperire scăzută a situsurilor de metilare (Raine et al. 2016)

• Conversia cu bisulfit

Conversia cu bisulfit este considerată a fi „standardul de aur” pentru analiza metilației ADN, principiile au fost prezentate în figura 4. Pentru această metodă, degradarea ADN-ului indusă de BS poate duce la epuizarea regiunilor genomice îmbogățite în citosine nemetilate. Prin urmare, este important să se evalueze cantitatea de degradare a ADN-ului în condițiile de reacție și trebuie, de asemenea, să se ia în considerare modul în care aceasta afectează ampliconul dorit. Olova et al. (2018) au constatat că degradarea ADN-ului este puternică în protocoalele de conversie cu bisulfit care utilizează o denaturare ridicată sau o molaritate ridicată a bisulfitului. Există mai multe kituri disponibile pe piață (Tabelul 2)

Figura 4. Deaminare mediată de bisulfit a citosinei (Hayatsu et al. 2004).

Tabel 2. Protocoale și parametri de conversie cu bisulfit.

• Prepararea bibliotecii

Să luăm ca exemplu kitul EpiGnomeTM Methyl-Seq (Epicentre) (așa cum se arată în figura 5), ADN-ul monocatenar tratat cu bisulfit este amorsat aleatoriu cu ajutorul unei polimeraze capabile să citească nucleotide uracil, pentru a sintetiza ADN care conține o etichetă de secvență specifică. Capătul 3′ al șirului de ADN nou sintetizat este apoi marcat selectiv cu o a doua secvență specifică, astfel încât se poate obține o moleculă de ADN cu doi markeri cu o secvență cunoscută la capetele 5′ și 3′. Adaptorii Illumina P7 și P5 sunt adăugați ulterior prin PCR la capetele 5 și 3 înainte de secvențierea ADN.

Figura 5. Fluxul de lucru pentru kitul EpiGnomeTM Methyl-Seq.

• Secvențiere

Tehnologia de secvențiere Heiseq, o nouă metodă de secvențiere bazată pe secvențiere prin sinteză (SBS), este aplicată pe scară largă pentru WGBS. Amplificarea în punte pe o celulă de flux se realizează prin utilizarea unei matrice cu o singură moleculă. Deoarece noua tehnică de blocare reversibilă poate sintetiza o singură bază la un moment dat și poate marca fluoroforul, laserul corespunzător este utilizat pentru a excita fluoroforul, iar lumina de excitație poate fi captată pentru a citi informațiile despre bază. Strategia Paired-end 150 bp este utilizată de obicei în WGBS pentru a secvenția biblioteci de ADN tratate cu bisulfit de inserție de 250-300 bp. În plus față de Illumina HiSeq, platformele PacBio SMRT, Nanopore, Roche 454 și alte platforme Illumina sunt, de asemenea, utilizate în mod obișnuit în acest scop.

• Analiza datelor

Se pot efectua o serie de analize pentru rezultatele secvențierii. Cinci tipuri principale de analiză a informațiilor sunt enumerate în tabelul 3. În plus, se pot efectua, de asemenea, analiza densității de metilare, analiza regiunilor diferențiate metilate (DMR), analiza de adnotare și îmbogățire a DMR (GO/KEGG) și analiza de clusterizare. Resursele bioinformatice comune ale WGBS includ BDPC, CpGcluster, CpGFinder, Epinexus, MethTools, mPod, QUMA și TCGA Data Portal.

Tabel 3. Principalele tipuri de analiză a datelor WGBS.

Servicii recomandate:

Secvențiere bisulfită a întregului genom

Secvențiere bisulfită țintită

ChIP-seq

Secvențiere bisulfită cu reprezentare redusă

1. Fraga, M. F., Esteller, M. (2002). Dna methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques, 33(3), 636-49.
2. Green, R. E., Krause, J., Briggs, A. W., Maricic, T., Stenzel, U., et al. (2010). A Draft Sequence of the Neandertal Genome. Science, 328(5979), 710-722.
3. Hayatsu, H., Negishi, K., & Shiraishi, M. (2004). Analiza metilației ADN: accelerarea deaminării citosinei mediată de bisulfit în procedura de secvențiere genomică. Proceedings of the Japan Academy,80(4), 189-194.
4. Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., & Baylin, S. B. (1996). Methylation-specific pcr: un nou test pcr pentru starea de metilare a insulelor cpg. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(18), 9821-9826.
5. Ji, L., Sasaki, T., Sun, X., Ma, P., Lewis, Z. A., & Schmitz, R. J. (2014). ADN metilat este suprareprezentat în datele de secvențiere bisulfită a întregului genom. Front Genet, 5(5), 341.
6. Khanna, A., Czyz, A., & Syed, F. (2013). Epignome methyl-seq kit: a novel post-bisulfite conversion library prep method for methylation analysis. Nature Methods, 10(10).
7. Laird, P. W. (2003). The power and the promise of DNA methylation markers (Puterea și promisiunea markerilor de metilare a ADN-ului). Nature Reviews Cancer, 3(4), 253-266. doi:10.1038/nrc1045
8. Laura-Jayne, G., Mark, Q. T., Lisa, O., Jonathan, P., Neil, H., & Anthony, H. (2015). A genome-wide survey of dna methylation in hexaploid wheat. Genome Biology, 16(1), 273.
9. Lin Liu, Ni Hu, Bo Wang, Minfeng Chen, Juan Wang, & Zhijian Tian, et al. (2011). A brief utilization report on the illumina hiseq 2000 sequencer. Mycology, 2(3), 169-191.
10. Meissner, A., Gnirke, A., Bell, G. W., Ramsahoye, B., Lander, E. S., & Jaenisch, R. (2005). Secvențierea bisulfitului cu reprezentare redusă pentru analiza comparativă de înaltă rezoluție a metilării ADN. Nucleic Acids Research, 33(18), 5868-77.
11. Meyer, M., Kircher, M., Gansauge, M. T., Li, H., Racimo, F., & Mallick, S., et al. (2012). O secvență de genom cu acoperire ridicată de la un individ denisovan arhaic. Science, 338(6104), 222-6.
12. Olova, N., Krueger, F., Andrews, S., Oxley, D., Berrens, R. V., & Branco, M. R., et al. (2018). Compararea strategiilor de pregătire a bibliotecilor de pregătire a bibliotecilor de secvențiere bisulfită a întregului genom identifică sursele de părtinire care afectează datele de metilare a ADN. Genome Biology, 19(1), 33.
13. Raine, A., Manlig, E., Wahlberg, P., Syvänen, A. C., & Nordlund, J. (2016). Splinted ligation adapter tagging (splat), o nouă metodă de pregătire a bibliotecilor pentru secvențierea bisulfitului întregului genom. Nucleic Acids Research, 45(6), e36.
14. Ziller, M. J., Müller, F., Liao, J., Zhang, Y., Gu, H., & Bock, C., et al. (2011). Distribuția genomică și variația inter-eșantioane a metilării non-cpg în tipurile de celule umane. Plos Genetics, 7(12), e1002389.