Abstract

Eșantioane de ser de la 474 de păsări sălbatice, 378 de cai și 42 de oameni cu meningită și meningită limfocitară au fost colectate între 2010 și 2014 din diferite zone ale Poloniei. Anticorpii împotriva virusului West Nile (WNV) au fost detectați cu ajutorul testelor imunoenzimatic de competiție: ELISA-1 ID Screen West Nile Competition, IDvet, ELISA-2 ID Screen West Nile IgM Capture și ELISA-3 Ingezim West Nile Compac. Anticorpii au fost găsiți în 63 (13,29%) din 474 de probe de ser de păsări sălbatice și în una (0,26%) din 378 de probe de ser de cal. Paisprezece (33,33%) din 42 de seruri de la pacienți au fost pozitive față de antigenul WNV și un ser a fost îndoielnic. Probele pozitive obținute la păsări au fost apoi retestate cu testul de microneutralizare a virusului pentru a confirma rezultatele pozitive și reacțiile încrucișate cu alți antigeni ai complexului encefalitei japoneze. Suspectăm că rezultatele serologice pozitive la oameni, păsări și cai indică faptul că WNV poate fi cumva în strânsă legătură cu ecosistemul din Polonia.

1. Introducere

Virusul West Nile (WNV) poate afecta o gamă largă de specii de păsări, cai și oameni. Virusul este un agent emergent responsabil de boli la aceste animale și la oameni din întreaga lume. Principalii vectori ai WNV sunt mai multe specii de insecte hematofage, care pot transmite virusul la păsări, cai și oameni .

Infecțiile se caracterizează prin pirexie ridicată, paralizie și morbiditate cauzate de factorii recunoscuți până acum ca fiind patogeni doar pentru animale. Mai des, infecțiile se caracterizează prin semne clinice ușoare .

WNV se află pe lista Organizației Mondiale pentru Sănătatea Animalelor (OIE) ca factor neurotropic cauzator de boală cu obligație de notificare. Febra West Nile (West Nile Fever – WNF) cauzată de acest virus este o zoonoză, care reprezintă principala problemă de sănătate publică în SUA .

WNV este un arbovirus aparținând familiei Flaviviridae, genul Flavivirus inclus în complexul antigenic al encefalitei japoneze induse de virusul encefalitei japoneze (JEV), virusul encefalitei St. Louis (SLEV), virusul encefalitei Murray Valley (MVEV) și virusul Usutu (USUV), înrudite antigenic. Genomul ssRNA+ al virusului conține un singur cadru de lectură deschis de 11.000-12.000 de nucleotide. Genomul virusului este format din șapte proteine nestructurale, NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b și NS5, și trei proteine structurale: glicoproteina E, proteina de nucleu C și proteina premembranară prM .

Păsările tropicale și migratoare, care aparțin unor specii diferite, sunt principalul rezervor al virusului . Linia 1 a WNV este o linie izolată în întreaga lume, dar linia 2 a fost izolată doar în Africa și Madagascar, până la apariția focarelor maghiare de WNV, care a fost cauzată de o nouă linie 2, care a fost introdusă în Ungaria, cel mai probabil de către păsările migratoare din Africa, în 2004 . Același neam 2 a provocat în vara anului 2010 boala neuroinvazivă endemică (WNND) la oameni în Grecia, cu 262 de cazuri confirmate și 35 de decese. În 2011, virusul s-a răspândit în Grecia centrală, dar cu mai puține cazuri, 101 cazuri diagnosticate și 9 decese. Numărul total de persoane din Grecia infectate de virus este estimat la 18000 .

Peste 300 de specii diferite de păsări au fost infectate de VNO. De obicei, virusul circulă între păsările sălbatice și țânțari într-un ciclu închis și poate fi transportat de păsări în timpul migrațiilor lor în diferite regiuni .

Virusul este prezent în multe țări din întreaga lume și, de asemenea, în 20 de țări europene, inclusiv în țări, care sunt vecine apropiate ale Poloniei, unde prezența virusului a fost confirmată . Prezența anticorpilor WNV a fost, de asemenea, confirmată în probe de ser de la păsări sălbatice și de la oameni din Polonia .

În 2010, morbiditatea și mortalitatea umană cauzate de infecția cu WNV au fost raportate în Grecia, Rusia, România, Italia și Israel . circulația virusului Usutu a fost confirmată și în Polonia . Nu au fost publicate alte studii privind circulația altor virusuri responsabile de complexul encefalitei japoneze în Polonia.

Scopul studiului a fost detectarea anticorpilor WNV în probe de ser de la diferite păsări sălbatice, cai și pacienți spitalizați cu simptome neurologice.

2. Materiale și metode

Păsări. Eșantioane de ser de la 474 de păsări sălbatice, 400 de berze albe (Ciconia ciconia), 21 de fazani comuni (Phasianus colchicus), 19 chiștoace comune (Fringilla coelebs), nouă rațe sălbatice (Anas platyrhynchos), patru vulturi cu coadă albă (Haliaeetus albicilla), doi șopârlii de vest (Tetrao urogallus), șase porumbei călători (Ectopistes migratorius), trei acvile de nord (Accipiter gentilis), două ciori cu glugă (Corvus cornix), trei acvile nordice (Accipiter gentilis) și o rândunică comună (Apus apus), o mierlă comună (Turdus merula), un starling comun (Sturnus vulgaris), un corb comun (Corvus corax) și un uliu comun (Buteo buteo buteo), au fost colectate în diferite locații din Polonia (Grădinile zoologice, Centrul de reabilitare a animalelor protejate). Cu toate acestea, majoritatea eșantioanelor au provenit de la Centrul de reabilitare a păsărilor sălbatice, Fundația Albatros. Probele au fost colectate în perioada martie-octombrie, 2010-2014, când activitatea țânțarilor a fost cea mai mare (Figura 1).

Figura 1

Hartă a Poloniei. Zonele în care au fost colectate probele.

Călărași. Au fost obținute 378 de probe de ser de la cai domestici sănătoși din câteva ferme situate în patru districte. Probele de ser au fost prelevate, de asemenea, de la cai de curse (Figura 1).

Humani. Probe de ser provenite de la 42 de pacienți (17 bărbați și 25 de femei) de la Departamentul de Boli Infecțioase și Neuroinfecții, Universitatea de Medicină din Bialystok. Pacienții prezentau simptome neurologice caracteristice meningitei, meningitei limfocitare și encefalitei transmise de căpușe. Aceștia au fost spitalizați între mai și septembrie 2010. Toți pacienții au fost testați pentru depistarea anticorpilor împotriva virusului encefalitei transmise de căpușe cu ajutorul Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus, Siemens . Probele au fost conservate la -20°C.

Toate probele examinate au fost dublu verificate și testate în condiții de biosecuritate de nivel 3+.

ELISA-1. Studiul serologic a fost efectuat cu o competiție disponibilă în comerț, ELISA ID Screen West Nile Competition (Innovative Diagnostics, Montpelier, Franța), pentru detectarea anticorpilor virusului West Nile împotriva proteinelor de înveliș pr-E și pr-M care conțin un epitop comun cu virusul encefalitei japoneze, în conformitate cu protocolul producătorului. Toate probele au fost examinate de două ori. Microplacile au fost citite la 450 nm. ELISA a fost validat atunci când s-au calculat ratele de legare reziduale (S/N%). Probele de ser cu rațiuni S/N egale sau mai mici de 40 % au fost considerate pozitive; probele cu rațiuni mai mari de 50 % au fost considerate negative. Valorile S/N cuprinse între 40% și 50% au fost îndoielnice.

ELISA-2 a fost efectuată folosind ID Screen West Nile IgM Capture (Innovative Diagnostics, Montpelier, Franța). Puțurile au fost acoperite cu anticorp policlonal IgM. Atunci când s-au obținut rezultate pozitive, prezența anticorpilor a apărut sub forma unei soluții albastre, iar după adăugarea soluției de oprire a devenit galbenă. În absența anticorpilor, nu a apărut nicio colorație. Plăcile au fost citite la 450 nm.

ELISA-3 a fost realizat cu ajutorul testului enzimatic Ingezim WNV Compac (Ingenasa, Spania) bazat pe ELISA de blocare, în care a fost utilizat un anticorp monoclonal (MAb) specific proteinei E a WNV. În cazul în care anticorpii erau prezenți în probele de ser, aceștia se legau de antigen. Atunci când s-a adăugat MAb specific proteinei E, acesta s-a legat la antigenul care nu a fost blocat de anticorpii din proba de ser. În cazul în care anticorpii blocau antigenul, conjugatul nu s-a legat de acesta. Testul a fost citit printr-o reacție colorimetrică după adăugarea substratului. Probele au fost considerate pozitive atunci când valorile DO au fost egale sau mai mici decât cele ale probelor serice de control pozitiv. Probele au fost considerate ca fiind negative atunci când valoarea DO a fost egală sau mai mare decât pragul negativ. Eșantioanele cu valoarea DO în intervalul celor două valori au fost considerate îndoielnice.

Test de microneutralizare a virusului. Testul de microneutralizare a virusului cu probe ELISA pozitive de la păsări sălbatice a fost efectuat în Laboratorul European de Referință, ANSES, Franța. În cadrul testului au fost utilizate celule Vero și virusul West Nile, tulpina IS-98-ST1. Testul s-a bazat pe procedura standard OIE .

3. Rezultate

Districtele din Polonia și zonele în care au fost colectate probele sunt prezentate în figura 1.

Majoritatea probelor au fost prelevate de la păsări în timpul asignării și al tratamentelor veterinare. Unele dintre păsări se aflau la centrul de reabilitare în urma unor accidente. Păsările nu au manifestat niciun simptom de boli neurologice și niciun semn de infecții neurologice. Fiecare pasăre a fost furnizată de către organizația care a trimis probele cu informații despre locație, sex, vârstă și, atunci când a fost posibil, despre istoricul călătoriei.

Examinarea probelor de ser a evidențiat anticorpi specifici WNV în 63 de probe de la păsări sălbatice: 62 de la berze albe și una de la chiparos comun. O probă de ser pozitivă a fost obținută de la iapă.

În ceea ce privește probele de ser uman, 14 din 42 au fost pozitive și una a fost îndoielnică. Toți pacienții aveau antecedente de mușcături de țânțari și căpușe. Encefalita transmisă de căpușe a fost diagnosticată la 16 pacienți.

Pentru a confirma rezultatele, s-a efectuat ELISA-2 pentru a detecta anticorpii serici specifici WNV IgM ca primă linie de răspuns imunitar. Rezultatele au fost negative și, prin urmare, nu au confirmat prezența anticorpilor IgM sau orice dovadă a unei infecții recente a animalelor.

Pentru a verifica rezultatele obținute prin ELISA-1, s-a efectuat ELISA-3, iar prezența anticorpilor specifici WNV a fost confirmată în aceste cazuri. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 1.

Pentru confirmarea rezultatelor pozitive, probele serice pozitive ale păsărilor au fost retestate prin testul de microneutralizare a virusului. Toate cele 63 de probe de ser de la păsările sălbatice au fost confirmate și identificate ca fiind pozitive pentru anticorpii VNO, cu titlul 10 în 60 de probe și titlul 30 în trei probe. În ceea ce privește examinările altor membri ai JECV, probele au fost, de asemenea, negative pentru virusul Usutu. Nu au fost observate reacții de reactivitate încrucișată.

Compararea rezultatelor obținute prin diferite metode de diagnosticare (teste ELISA și teste de microneutralizare a virusului) este prezentată în tabelul 1.

4. Discuții

În ultimii ani, s-a observat că WNV se răspândește în țările cu climă moderată. țânțarii din familia Culicidae sunt cel mai frecvent vector de răspândire a virusului și în prezent șase dintre speciile de țânțari există în zona climatică poloneză . În anii ’90 ai secolului trecut, Juřicová et al. folosind testul de inhibiție a hemaglutinării au confirmat anticorpi WNV la 12,1% dintre vrăbiuțele domestice (Passer domesticus) și la 2,8% dintre vrăbiuțele arboricole eurasiatice (Passer montanus) în zona pădurii Campinas din Polonia. În următorii câțiva ani, au fost găsiți anticorpi WNV la trei berze, o cioară (Corvus corone cornix) și o lebădă mută (Cygnus olor) în cealaltă parte a Poloniei .

Am efectuat trei teste ELISA diferite pentru a prezenta și apoi a confirma rezultatele obținute. Primul ELISA a fost ID Screen West Nile Competition, test specific pentru WNV, dar care dă și reacții serologice încrucișate între membrii JECV. În cazul în care s-au obținut rezultate pozitive, s-a efectuat testul ELISA-2 West Nile IgM Capture, care este specific doar pentru WNV și permite excluderea reacțiilor încrucișate, dar detectează doar IgM. Aceasta înseamnă că putem identifica doar infecția recentă și nu putem detecta anticorpii IgG. ELISA-3 a fost utilizat pentru a confirma rezultatele obținute prin ELISA-1 și rezultatele au fost confirmate în 100% din cazuri.

În studiul nostru, rezultatele pozitive cu probe de ser de păsări sălbatice obținute prin ELISA au fost confirmate prin testul de microneutralizare a virusului. În plus, ELISA a evidențiat anticorpi împotriva WNV în 14 din cele 42 de probe de ser de la pacienți cu simptome de meningită, meningită limfocitară și encefalită transmisă de căpușe, dar nu am putut verifica rezultatele obținute cu testul de neutralizare prin reducerea plăcii (PRNT). Infecția cu WNV la om și identificarea WNV în lichidul cefalorahidian au fost confirmate, de obicei, prin RT-PCR, Nested PCR , sau în țesuturile umane fixate în formol și incluse în parafină prin RT-PCR. Conform studiului lui Czupryna și colab. , toate probele de lichid cefalorahidian de la 24 de pacienți spitalizați la Departamentul de Boli Infecțioase și Neuroinfecții, Universitatea de Medicină din Bialystok, au fost negative pentru ARN VNO.

Eșantioane de serum de la oameni, păsări și cai au fost folosite ca probe adecvate pentru determinarea anticorpilor specifici VNO. În cazul în care am confirmat anticorpii specifici în probele de ser, s-a considerat că animalul sau omul a avut contact cu virusul (în Polonia sau în afara țării). Se presupune că păsările sălbatice pozitive ar putea avea contact cu virusul în afara țării. În ceea ce privește probele pozitive de la oameni, 11 pacienți nu au părăsit niciodată țara, ceea ce înseamnă că aceștia trebuiau să fi intrat în contact cu virusul deja în Polonia. Același lucru este și în cazul cailor, care, conform istoricului lor de călătorie, nu au părăsit niciodată țara.

Pe baza situației epidemiologice din Europa, a rolului păsărilor sălbatice în transmiterea VNO și a rezultatelor examinărilor serologice anterioare ale oamenilor și păsărilor indică faptul că prezența VNO în Polonia poate fi posibilă. În Polonia, anticorpii WNV au fost detectați la femeia febrilă și la lucrătorii forestieri sănătoși din regiunile Swietokrzyskie (28,85%) și Podlaskie (34,14%) . Rezultatele noastre serologice pot sugera că virusul este deja prezent în zona noastră climatică și în ecosistemul nostru. Trebuie luată în considerare posibilitatea reacției încrucișate cu virusurile encefalitei transmise de căpușe și ale bolilor endemice.

Aprobare etică

Studiul a fost aprobat de Comisia de Etică locală II din Lublin (numărul 92/2010 din 16 noiembrie 2010) și a obținut permisiunea Directorului General de Protecție a Mediului (numărul DOP-OZGŁZ. 6401.03.36.2011.dł).

Conflict de interese

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Recunoștințe

Autorii doresc să recunoască sprijinul financiar oferit de un proiect-cadru P/020, Free Living Water Birds as a Reservoir and the Vector during the Expansion of Viral Diseases, și de proiectul-cadru W/211, Development Diagnostic Methods and Risk Evaluation of the Occurrence of West Nile Virus Infection in Birds in Poland (2014-2018).

.