Pentru a acoperi distanța evolutivă mare dintre vertebratele actuale și cordata ancestrală cu un genom neduplicat, Sacerdot și colegii săi au reconstruit mai întâi genomul ancestral al amniotelor. Pentru a face acest lucru, ei au aplicat mai întâi algoritmul AGORA (Algoritm for Gene order Reconstruction in Ancestors) pe care îl dezvoltaseră anterior la ordinele, orientările și arborii genetici ai celor 61 de genomuri de animale existente din baza de date Ensembl. Printre acestea se numărau 40 de mamifere, 3 păsări, 2 reptile, 1 amfibian, 8 teleoste, 1 celacant, 2 tunicieri, 1 nematod și 1 muscă. Din nefericire, Ensembl nu include genomul niciunui pește cartilaginos (de exemplu, rechinul elefant, Callorhinchus milii, o chimaera, care are genomul vertebratelor cu cea mai lentă evoluție cunoscută) sau cel al hemicordatelor, echinodermelor sau cefalochordatelor – deuterostomi nevertebrați ale căror genomuri nu au suferit pierderea și compactarea considerabilă a genelor, caracteristice genomurilor de tunicate.

Sacerdot et al. au identificat apoi perechi de gene ohnologice putative în acest genom ancestral de amniote și au produs seturi de Regiuni Ancestrale Contigue (CAR). Ohnologii sunt gene omoloage în cadrul unei specii care rezultă din WGD-uri. În cele din urmă, ei au grupat aceste CAR într-un set de 51 care s-au încadrat în mod semnificativ în 17 grupuri de patru, sau tetrade; rezultatul așteptat al celor două runde de WGD. Pentru a distinge tiparul fuziunilor și fisiunilor cromozomiale în timpul evoluției, ei au dorit să compare aceste 17 tetrade cu organizarea genelor într-un genom prevertebrat neduplicat. Cu toate acestea, genomurile tunicatului evoluează foarte rapid și sunt destul de divergente față de cele ale altor deuterostomi nevertebrați, în timp ce ansamblul genomului publicat al cefalochordatului Branchiostoma floridae este prea fragmentat pentru această analiză. Prin urmare, autorii au comparat cele 17 tetrade de CAR-uri ale lor cu cele 17 grupuri de legătură ancestrale de chordate determinate anterior prin compararea sinteniei genelor de pe cromozomii umani și de pe scheletele genomului B. floridae. În mod remarcabil, fiecare dintre aceste grupuri de legături ale corzilor s-a corelat cu o tetradă CAR predominantă. Ei au concluzionat, în urma acestei comparații, că genomul vertebratelor ancestrale avea 17 cromozomi care s-au duplicat apoi în 34 de cromozomi printr-o singură rundă de WGD (1R). Ulterior, au avut loc 7 fuziuni cromozomiale, rezultând 27 de cromozomi, care, la originea vertebratelor, înainte de diviziunea agnatan/gnathosom, s-au duplicat din nou (2R WGD) în 54 de cromozomi. După 2R WGD, au avut loc patru fuziuni suplimentare înainte de vertebratele osoase ancestrale, urmate de o a cincea fuziune înainte de baza amniotelor. Astfel, cariotipul ancestral al vertebratelor osoase a inclus 50 de cromozomi, iar amniotul ancestral a avut 49 de cromozomi (Fig. 1b).

În plus față de reconstituirea duplicațiilor, fuziunilor și fuziunilor de cromozomi în timpul evoluției, algoritmul AGORA poate calcula ordinea genelor pe cromozomii strămoșului ipotetic al amniotului prin compararea ordinii genelor pe cromozomii descendenților săi actuali . Acest genom ancestral reconstruit al amniotelor conține 80% din cele 15.854 de gene din CAR. Distribuția inegală a acestor gene pe cei 49 de cromozomi ai amniotului ancestral ar putea reflecta realitatea sau, alternativ, dificultatea de a reconstrui ordinea genelor pe cromozomi care au suferit o rearanjare genetică considerabilă în timpul evoluției.

Chiar și așa, două lucruri ies în evidență în analiză. Primul este faptul că compararea genomului ancestral al amniotelor cu CAR-uri grupate în 17 tetrade cu super-scaunele din ansamblul genomului lamprei (Petromyzon marinus) arată un model clar de 1 la 4, în concordanță cu 2R WGD înainte de divizarea agnatan/gnathostom. Acest lucru este în dezacord cu rezultatele lui Smith et al. care au găsit dovezi puternice pentru doar 1R WGD la lamprey în comparație cu puiul. Această discrepanță ar putea fi explicată prin includerea datelor genomice de la mai multe specii în reconstituirea genomului ipotetic al amniotelor ancestrale, un proces care, în sine, elimină, de asemenea, rearanjamentele genomice confuze care au avut loc la vertebrate ulterior strămoșului amniotelor. Aceasta se datorează probabil și includerii datelor filogenetice pentru a determina tetradele CAR, dezvăluind astfel ohnologii care au deviat la baza evoluției vertebratelor.

Cel de-al doilea rezultat care iese în evidență este corespondența dintre ordinea genelor pe cromozomii umani și cei 17 cromozomi pre-1R. Atunci când cei 17 cromozomi pre-1R sunt codificați prin culori (Fig. 1b) și culorile fiecărei gene sunt transferate la pozițiile celor 8282 de gene umane care au descins din genele pre-1R, este evident modelul de duplicații și translocații ale genomului. De exemplu, cromozomul 1 din genomul pre-1R conține genele Hox. Un segment mare al cromozomului 2 uman conține clusterul HoxD plus multe alte gene care corespund celor de pe cromozomul 1 pre-1R. Celelalte 3 clustere Hox umane sunt localizate pe cromozomii umani 7, 12 și 17. În plus, un număr substanțial de omologi ai altor gene de pe cromozomul 1 pre-1R sunt localizați pe cromozomii umani 1, 3, 10, 16 și 22, ceea ce indică existența unor translocații.

.