Global bla KPC-E. coli sunt diverse, chiar și în cadrul celui mai răspândit ST, ST131, cu dovezi de transmitere locală

45 de izolate au fost obținute din 21 de orașe din 11 țări de pe patru continente (2010-2013; rezultatele anterioare ale tipizării de laborator sunt rezumate în tabelul S1). Un izolat a fost bla KPC-negativ la secvențierea întregului genom (WGS; ecol_252), fiind posibil să fi pierdut bla KPC în timpul depozitării sau al subculturii în intervalul de timp dintre momentul în care a fost efectuată tipizarea inițială și extracția ulterioară a ADN-ului și pregătirea pentru WGS. Pentru un izolat, datele WGS au fost neconforme cu rezultatele tipizării de laborator (ecol_451), reprezentând probabil o confuzie de laborator; ecol_252 și ecol_451 au fost, prin urmare, excluse din analizele ulterioare. Celelalte 43 de izolate au fost secvențiate cu succes (pentru indicatorii de calitate, a se vedea tabelul S1). Printre aceste 43 de izolate, au fost reprezentate douăzeci și unu de ST-uri diferite de E. coli (tabelul 1; prezise in silico din WGS), inclusiv: ST131 , ST410 , ST38 , ST10, ST69 (restul izolatelor ST singleton).

Din cele 16 053 de cadre deschise de citire (ORF) adnotate identificate în toate izolatele de KPC-E. coli, doar 2 950 (18,4%) au fost partajate în toate izolatele („core”), iar alte 222 (1,4%) în 95- < 100% din izolate („soft core „27). La nivel de nucleotide, au existat 213.352 de variante de nucleotide unice (SNV) în genomul de bază, în concordanță cu diversitatea speciilor observată anterior28. Profilurile genelor de rezistență au variat, de asemenea, în mod semnificativ de la o tulpină la alta, unele prezentând mai multe mecanisme de rezistență la beta-lactame, aminoglicozide, tetracicline și fluorochinolone (de exemplu, ecol_224), iar altele conținând doar bla KPC (de exemplu, ecol_584; Fig. 1). Pentru cele 16 tulpini KPC-ST131, 4 071/7 910 (51 %) ORF-uri au fost core, cu 6 778 SNV-uri în genomul de bază al acestor izolate, din nou în concordanță cu studiile globale anterioare privind diversitatea ST13123, 24 (figura S1). Genomurile accesorii au fost foarte concordante pentru unele (de exemplu, ecol_356/ecol_276/ecol_875), dar nu pentru toate (de exemplu, ecol_AZ159/ecol_244) izolatele care au fost strâns înrudite în genomurile lor de bază, susținând o dinamică evolutivă foarte variabilă între genomurile de bază și cele accesorii (Fig. 1). Distribuția geografică a izolatelor strâns înrudite atât în genomul central, cât și în cel accesoriu susține transmiterea locală (de exemplu, ecol_AZ166, ecol_AZ167 ) a anumitor tulpini KPC-E. coli. Omologia motivelor genetice de flancare din jurul genelor bla KPC în aceste perechi de izolate strâns înrudite ar fi, de asemenea, în concordanță cu această ipoteză și mai puțin în concordanță cu evenimente multiple de achiziție a bla KPC în cadrul aceluiași fond genetic, în special având în vedere diversitatea secvențelor de flancare bla KPC observată în restul setului de date (a se vedea mai jos).

Figură 1

Piglogenia KPC-Escherichia coli identificată în cadrul schemelor globale de supraveghere a rezistenței la carbapenem, 2008-2013. Panourile din dreapta filogeniei reprezintă mecanismele comune ale genelor de rezistență (detalii complete privind tipizarea genelor de rezistență în tabelul S2), componentele genomului central și accesorii. Pentru panoul genomului accesoriu, culoarea albastră reprezintă regiunile adnotate care sunt prezente, iar cea albă pe cele care sunt absente.

Genele bla KPC par să fie limitate la contexte plasmidice în E. coli în prezent, dar pot exista în copii multiple pe structuri plasmidice unice sau în plasmide cu număr mare de copii

Treizeci și patru de izolate (80%) conțineau bla KPC-2, iar nouă izolate (20%) bla KPC-3. Integrarea cromozomială a bla KPC a fost descrisă la alte Enterobacteriaceae, Pseudomonas și Acinetobacter spp. dar rămâne rară5, 29, 30. Nu a existat nicio dovadă de integrare cromozomială a bla KPC nici în cele 18 structuri cromozomiale reconstruite din secvențierea long-read, nici pe baza revizuirii adnotărilor din contigurile care conțin bla KPC (derivate din ansamblurile de novo Illumina) pentru celelalte 25 de izolate. Alelele bla KPC nu au fost segregate în funcție de ST.

Stimările numărului de copii bla KPC per cromozom bacterian au variat între <1 (ecol_879, ecol_881) și 55 (ecol_AZ152). În nouă cazuri, această estimare a fost ≥10 copii de bla KPC pe cromozom bacterian (ecol_276, ecol_356, ecol_867, ecol_869, ecol_870, ecol_875, ecol_AZ150, ecol_AZ152, ecol_AZ159, ecol_AZ159, tabelul S2). Șase dintre aceste izolate conțineau bla KPC într-un context plasmidic de tip col, în două cazuri tipul de rep plasmidic a fost necunoscut, iar într-un caz a fost un replicon IncN. Numărul de copii plasmidice este asociat cu niveluri mai ridicate de rezistență la antibiotice în cazul în care gena relevantă este localizată pe o unitate cu număr mare de copii. În mod interesant, se presupune că plasmidele cu număr mare de copii au șanse mai mari de a se fixa în celulele descendente, deoarece se distribuie mai bine din întâmplare și fără a fi nevoie de sisteme de separare31 , și de a fi transferate în orice eveniment de conjugare, fie direct, fie indirect32,33,34.

Populațiile de plasmidă bla KPC și non-bla KPC din tulpinile globale de KPC-E. coli sunt extrem de diverse

Tiparea plasmidelor Inc a relevat prezența unei medii de patru tipuri de repliconi plasmidici per izolat (interval: 1-6; IQR: 3-5), reprezentând o diversitate largă (tabelul 1). Cu toate acestea, repliconii IncN, col, IncFIA și IncI1 au fost suprareprezentați în mod disproporționat în anumite ST (p < 0,05; tabelul 1). Printre cele 18 izolate care au fost supuse secvențierii PacBio, am identificat 53 de plasmide KPC închise, non-bla, variind de la 1 459 pb la 289 903 pb (Tabelul S1; au fost prezente cel puțin patru structuri plasmidice suplimentare, parțial complete). Dintre aceste plasmide KPC non-bla, 10 (dimensiune: 2.571-150.994 pb) au avut o similitudine <70% (definită prin identitatea procentuală a secvenței înmulțită cu proporția de lungime de interogare care demonstrează omologia) cu alte secvențe disponibile în GenBank, subliniind că o parte din „plasmidomul” din KPC-E. coli rămâne incomplet caracterizat. Pentru celelalte 43 de plasmide, cea mai bună potrivire în GenBank a fost o plasmidă din E. coli în 35 de cazuri, K. pneumoniae în 5 cazuri și Citrobacter freundii, Shigella sonnei, Salmonella enterica în câte un caz (tabelul S3).

Vreo douăzeci și două de structuri plasmidice bla KPC au fost complet rezolvate (17 numai din datele Pacbio, patru numai din datele Illumina, 1 atât din datele PacBio, cât și din datele Illumina), variind de la 14 029 pb la 287 067 pb (mediana = 55 590 pb; IQR: 23 499-82 765 pb). Aceste plasmide care conțin bla KPC, precum și șase cazuri suplimentare în care bla KPC a fost identificat pe un contig care conține replicon, au fost foarte diverse pe baza tipizării Inc (tabelul S1). IncN a fost cel mai frecvent tip (n = 8/28 structuri bla KPC tipizabile; 29 %), urmat de plasmide mici, de tip col (n = 6/28 ; 21 %). Alte tipuri mai puțin frecvente au fost: A/C2, FII(k), U (toate n = 2); și L/M, P, Q1 și R (toate n = 1). Patru (14%) plasmide bla KPC au fost construcții multi-replicon, și anume: col/repA, FIB/FII, FIA/FII și FIA/FII/R.

Baze plasmidice IncN comune s-au dispersat la nivel global în cadrul E. coli

Din GenBank, am selectat pentru comparație toate secvențele plasmidice IncN-bla KPC unice, complet secvențiate, IncN-bla (tabelul S4), care datează încă din 2005, aproximativ din momentul primelor rapoarte privind E. coli producătoare de KPC. Coloanele vertebrale plasmidice și secvențele flancate care înconjoară bla KPC în aceste 16 referințe plasmidice și un subset de 12 secvențe de studiu (a se vedea „Metode”) au fost în concordanță cu achizițiile multiple ale celor două complexe IncN-Tn4401-bla KPC cunoscute în ST divergente de E. coli: în primul rând, în cadrul unui fond asemănător Plasmid-9 (FJ223607, 2005, SUA) și, în al doilea rând, în cadrul unui element asemănător Tn2/3 într-un fond asemănător Plasmid-12 (FJ223605, 2005, SUA).

În primul caz, au fost identificate similitudini genetice între Plasmid-9, pKPC-FCF/3SP, pKPC-FCF13/05, pCF8698, pKP1433 (reprezentând un hibrid IncN) și plasmidele bla KPC din izolatele ecol_516, ecol_517, ecol_656 și ecol_736 (prezentul studiu). Plasmidul-9 conține elemente Tn4401b duplicate în orientare inversă, cu patru secvențe flancate diferite de 5 bp într-o dispunere atipică în cadrul unui intron de grup II35. Structurile coloanei vertebrale ale celorlalte plasmide din acest grup sunt în concordanță cu un eveniment separat de achiziție a unui element Tn4401b între regiunile pld și traG în cadrul unei versiuni ancestrale a structurii Plasmid-9, cu generarea unei duplicări a situsului țintă TTCAG (TSD) de flancare (etichetată ca Plasmidă asemănătoare Plasmid 9 (ipotetică), Fig. 2). Răspândirea internațională urmată de o evoluție locală atât în cadrul speciilor, cât și între specii, ar explica diferențele dintre plasmide, inclusiv: (i) variația la nivel de nucleotide (observată în toate plasmidele); (ii) evenimente mici de inserție/deleție (observate în toate plasmidele); (iii) evenimente mai mari de inserție/deleție mediate de elemente transpozabile (de exemplu, pCF8698_KPC_2); și (iv) recombinarea omologă probabilă, rezultând în variații grupate în cadrul unui spiță de plasmidă similară (de ex. ecol_656/ecol_736), precum și rearanjamente mai distincte, inclusiv formarea de plasmide „hibride” (de exemplu, pKP1433)(Fig. 2).

Schema de comparare a plasmidelor IncN asemănătoare cu FJ223607 (asemănătoare cu Plasmid 9) (disponibile în mod public; acest studiu), precum și originea lor geografică/datele de izolare. Denumirile secvențelor plasmidice cu roșu sunt cele din acest studiu, derivate din datele PacBio și structurile plasmidice închise (ecol_517, ecol_656) sau incomplete (ecol_516, ecol_736) derivate din datele Illumina. Barele aliniate adiacente numelor plasmidelor reprezintă secvențe de plasmidă: gri deschis denotă regiuni cu identitate de secvență de 100 %; negru reprezintă diversitatea nucleotidelor între secvențe; iar liniile subțiri reprezintă indels. Secvențele de codificare sunt reprezentate prin săgeți grase sub barele de secvențe individuale și sunt codificate în culori conform cheii de culori. Schema inserată care descrie variația genetică între secvențe prezintă exemple de evenimente evolutive identificate: (a) modificări la nivelul unui singur nucleotid, (b) indeluri mici (≤100 bp), (c) indeluri mari (>100 bp), (d) evenimente de recombinare.

În Plasmid-12 (FJ223605), Tn4401b s-a inserat într-un element hibrid de tip Tn2-Tn3 (cu gene de rezistență la medicamente asociate, inclusiv bla TEM-1, bla OXA-9 și mai multe gene de rezistență la aminoglicozide), deși în absența duplicării secvenței țintă, posibil ca rezultat al unui eveniment de transpoziție intramoleculară, replicativă, care a generat secvențe de situs țintă nepotrivite (L TSS = TATTA; R TSS = GTTCT). Acest complex este, la rândul său, situat între două elemente asemănătoare IS15DIV (IS15Δ)/IS26 flancate de repetări inversate de 8 pb și localizate între loci traI (891 pb de la capătul 3′) și pld (~28 Kb; Fig. 3A). Componentele coloanei vertebrale a Plasmid-12 IncN sunt în concordanță cu cele observate într-un focar de la NIH5 și într-o versiune rearanjată într-un focar de la Universitatea din Virginia (CAV1043; 2008)6. Din acest studiu, plasmidele din ecol_224, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_422 și scheletele din ecol_AZ151, ecol_744, ecol_AZ150 au toate structuri aproape identice cu Plasmid-12, cu variații grupate la nivel de nucleotide prezente în genele traJ-traI, în concordanță cu un eveniment de recombinare omoloagă care afectează această regiune, precum și dovezi ale unor evenimente sporadice de inserție/deleție (Fig. 3A). Cu toate acestea, structurile bla KPC-Tn4401 din aceste izolate sunt aproape în întregime degradate de prezența altor elemente genetice mobile (MGE), inclusiv elemente asemănătoare Tn2/Tn3, ISKpn8/27 și Tn1721. În ecol_224, bla KPC-2 a fost inserat în coloana vertebrală IncN ca parte a două structuri repetate, inversate de tip Tn3, flancate de un TSD TTGCT și mai aproape de traI (136 pb de la capătul 3′) decât complexul IS15DIV (IS15Δ)/IS26-like menționat anterior în Plasmid-12 (Fig. 3B). Deși nu este posibil să se urmărească cu exactitate istoria evolutivă a acestei regiuni genomice având în vedere datele disponibile, prezența semnăturilor comune ale acestei structuri în ecol_422, ecol_744, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_AZ150 și ecol_AZ151 sugerează o achiziție comună și multiple rearanjamente ulterioare mediate de prezența numărului mare de MGE care flanchează bla KPC-2.

Schema de comparare a plasmidelor IncN KPC asemănătoare cu FJ223605 (asemănătoare cu Plasmid-12) din acest studiu. Panoul 3A. Originea geografică, datele de izolare și alinierea globală a structurilor plasmidelor/contig. Numele secvențelor de plasmidă cu roșu sunt cele din acest studiu, derivate din datele PacBio și structurile plasmidice închise (ecol_224, ecol_422, ecol_881, ecol_AZ159) sau incomplete (ecol_744, ecol_AZ151, ecol_AZ150) derivate din datele Illumina. Barele aliniate adiacente numelor plasmidelor reprezintă secvențe de plasmidă: gri deschis denotă regiuni cu o homologie de secvență de 100 %; negrul reprezintă diversitatea nucleotidelor între secvențe; iar liniile subțiri reprezintă indels. Secvențele de codificare sunt reprezentate prin săgeți grase sub barele de secvențe individuale și sunt codificate în culori conform cheii de culori. Schema inserată care descrie variația genetică între secvențe prezintă exemple de evenimente evolutive identificate: (a) modificări la nivelul unui singur nucleotid, (b) indeluri mici (≤100 bp), (c) indeluri mari (>100 bp), (d) evenimente de recombinare. Panoul 3B. Prim-planul regiunii dintre traI și pld care conține bla KPC-2 numai în izolatele de studiu. Secvențele codificatoare sunt codificate prin culori ca în Fig. 3A; regiunile de secvențe la care se face referire în text sunt adnotate.

Plasmidele de tip col pot reprezenta un vector important de transmitere pentru bla KPC în E. coli

Plasmidele mici asemănătoare colului au fost al doilea cel mai frecvent tip de plasmidă purtătoare de bla KPC în E. coli (n = 5 ), dar trei dintre acestea au fost identice (bla KPC-2, 16 559 bp), toate izolate în Pittsburgh, SUA, de la izolate ST131 de-a lungul unui interval de timp de doi ani (ecol_276 , ecol_356 , ecol_875 ). Aceste trei izolate conțineau, în plus, repliconi FIA, FIB, FII, X3 și X4, sugerând persistența stabilă a unei tulpini clonale + plasmide de-a lungul timpului, în concordanță atât cu analizele SNV/core, cât și cu cele ale genomului accesoriu (Fig. 1, Figura S1).

Celelalte două plasmide asemănătoare cu colul reprezintă, în mod efectiv, porțiuni scurte de ADN care codifică diferite gene de mobilizare (mbeA/mbeC/mbeD), legate la modulele KPC Tn4401/bla. Secvențele de 5 pb care flanchează Tn4401 au fost în concordanță cu transpoziția directă, intermoleculară în ambele cazuri (ecol_870: TGTTT-TGTTT; ecol_867: TGTGA-TGTGA). În acest set de date a fost observată, de asemenea, o plasmidă co-integrată col/repA (ecol_AZ161), în care Tn4401b a fost inserată între secvențele de semnătură colE3 și un element Tn3 (Tn4401 TSS: AGATA-GTTCT). Formarea unor astfel de structuri plasmidice co-integrate în E. coli a fost, de asemenea, descrisă anterior36, inclusiv cea a unei structuri plasmidice de tip col/pKpQIL fuzionată (pKpQIL fiind istoric asociată cu bla KPC)37.

Plasmide de tip col au fost asociate cu producătorii de KPC în alte studii regionale mai mici21, 38. Îngrijorător este faptul că s-a demonstrat că acești mici vectori sunt responsabili pentru difuzarea între specii a genelor qnr care mediază rezistența la fluorochinolone, chiar și în absența oricărei presiuni evidente de selecție antimicrobiană39. Asocierea semnificativă a plasmidelor de tip col cu anumite ST de E. coli (predominant ST131) în acest studiu ar putea fi o explicație pentru reprezentarea disproporționată a bla KPC în acest neam.

Diverse secvențe Tn4401 5 bp target site sequences (TSSs) susțin o mobilitate ridicată a transpozonului

Izoformele Tn4401 complete care flanchează bla KPC-2 sau bla KPC-3 au fost observate doar în 24/43 (56%) de izolate, inclusiv Tn4401a/a-like (n = 10; un izolat cu o întrerupere de contig în amonte de bla KPC), variantele Tn4401b (n = 12) și Tn4401d (n = 2). Au fost identificate 11 perechi diferite de secvențe de secvențe de situs țintă (TSS) de 5 bp, dintre care 7 (64 %) nu au fost observate în nicio plasmidă de comparație descărcată din GenBank (tabelul S5). Tn4401a avea trei TSS-uri 5 bp diferite, Tn4401b șapte, iar Tn4401d una. Cele mai multe reprezentau TSD-uri, dar în trei cazuri Tn4401 era flancat de TSS-uri de 5 bp diferite, în concordanță cu evenimente de transpoziție directă inter- și intramoleculară replicativă.

Din setul complet de plasmide GenBank și din experimentele de transpoziție in vitro efectuate de alții, au fost caracterizate 30 de tipuri diferite de perechi de TSS-uri de 5 bp, dintre care șapte doar în cadru experimental40. Plasmidele descărcate provin de la o serie de specii și perioade de timp (2005-2014), deși este posibil ca acestea să sub-reprezinte o diversitate mai largă a situsurilor de inserție Tn4401 ca urmare a prejudecăților de eșantionare. Cu toate acestea, datele noastre ar fi în concordanță cu o mobilitate semnificativă a Tn4401 în E. coli ca urmare a achiziționării diverselor izoforme Tn4401 și/sau reprezintă evenimente multiple de import în E. coli de la alte specii.

Asociația tradițională a bla KPC cu Tn4401 a fost erodată în mod semnificativ în plasmidele KPC din E. coli

În mod special, în celelalte 19/43 (44%) de izolate, structura Tn4401 a fost degradată prin înlocuirea cu MGE, dintre care doar unele au fost descrise anterior41, 42. Două izolate aveau structuri Tn4401Δb noi (trunchieri în amonte de către IS26 sau IS26-ΔIS5075 ). O structură de tip Tn4401e (deleție de 255 pb în amonte de bla KPC) a fost prezentă în trei izolate (ecol_227, ecol_316, ecol_583): aceasta a fost caracterizată în continuare într-un ansamblu complet de plasmidă PacBio (ecol_316) și a reprezentat o rearanjare în locul L TSS al elementului ISKpn7. În acest plasmid, un al doilea element Tn4401 parțial a fost prezent fără bla KPC, ceea ce ar fi în concordanță cu un eveniment de transpoziție intramoleculară incomplet, replicativ, intramolecular (GGGAA = L TSS și R TSS pe cele două elemente Tn4401b, în orientare inversă). Alte motive care flanchează bla KPC au inclus: elemente hibride Tn2/Tn3-ISKpn8/27-bla KPC (n = 1; ecol_224); IS26-ΔtnpR(Tn3)-ISKpn8/27- bla KPC-ΔTn1721-IS26 (n = 5; ecol_AZ153-AZ155, ecol_AZ166, ecol_AZ167); ISApu2-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC- korC-klcA-ΔTn1721-IS26 (n = 1; ecol_542); IS26-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC-korC-IS26 (n = 1; ecol_545); elemente hibride Tn2/Tn3 + ΔblaTEM-bla KPC-ΔTn1721 (n = 2; ecol_744, ecol_422), elemente Tn3-Δbla TEM-bla KPC- ΔTn1721 (n = 4; ecol_881, ecol_AZ151, ecol_AZ159, ecol_AZ150) și ΔTn3-Δ-Δ -ΔIS3000 (Tn3-like) (n = 1; ecol_AZ152). Nu am fost în măsură să evaluăm contextul flancat de bla KPC în ecol_452 din cauza limitărilor ansamblului.

Această diversitate aparentă a MGE-urilor dobândite independent în jurul genei bla KPC extinde mijloacele prin care bla KPC poate fi mobilizată. Este interesant faptul că, așa cum s-a observat anterior43, toate secvențele Tn4401 degradate din acest set de date au fost asociate cu secvențe variabile de secvențe flancate de tip Tn2/3, ceea ce sugerează că inserția Tn4401 într-un context de tip Tn2/Tn3 ar fi putut permite ca acesta din urmă să acționeze ca un hotspot pentru inserția altor MGE6. O constatare specială de remarcat este asocierea cu IS26, care a fost legată de diseminarea mai multor alte gene de rezistență în E. coli, inclusiv CTX-M ESBLs24, 44; este capabilă să crească expresia genelor de rezistență strâns co-localizate45; participă la formarea de co-integrări și, prin urmare, la rearanjarea plasmidică46; și sporește apariția altor evenimente de transfer mediate de IS26 în plasmidele care găzduiesc IS26 46.

.