Etablishment of a Human Gastric Cancer Xenograft Model in Immunocompetent Mice Using the Microcarrier-6
Abstract
Cancerul gastric este printre cele mai frecvente tumori maligne ale tractului digestiv. Stabilirea unui model animal robust și fiabil reprezintă fundamentul pentru studierea patogenezei cancerului. Studiul de față a stabilit un model de șoarece de carcinom gastric prin inocularea șoarecilor imunocompetenți cu celule MKN45 cu ajutorul microcarrierului. Șaizeci de șoareci masculi C57BL/6 au fost împărțiți în mod aleatoriu în trei grupuri: un grup 2D, un grup de purtători goi și un grup 3D, în funcție de sistemul de cocultură a MKN45 și a micropurtătorului. Modelele de șoareci au fost stabilite prin injecție hipodermică. Timpul de dezvoltare a tumorii, rata de formare a tumorii și caracteristicile patologice au fost observate în fiecare grup. În grupul 3D, timpul de tumorigeneză a fost scurt, în timp ce rata de formare a tumorii a fost ridicată (75%). Nu a existat nicio formare tumorală detectabilă nici în grupul 2D, nici în grupul cu purtător gol. Atât H&E, cât și colorarea imunohistochimică a xenogrefei tumorale au arătat dovezi caracteristice ale neoplasmelor gastrice umane. Studiul de față a stabilit cu succes un model de carcinom gastric uman la șoareci imunocompetenți, care oferă un model animal nou și valoros pentru cercetarea cancerului și dezvoltarea de medicamente anticancerigene.
1. Introducere
Cu aproximativ un milion de cazuri nou diagnosticate anual, cancerul gastric reprezintă o amenințare serioasă pentru sănătatea și viața oamenilor din întreaga lume . Cu toate acestea, patogeneza și mecanismele de metastazare a cancerului gastric nu au fost încă complet clarificate. Modelele in vivo ale cancerului gastric sunt instrumente esențiale pentru explorarea caracteristicilor biologice ale acestui cancer și a potențialelor opțiuni noi de tratament . Modele de xenogrefe de cancer gastric de origine umană au fost stabilite pe șoareci imunodeficienți, cum ar fi șoarecii nude și șoarecii cu imunodeficiență combinată severă. Cu toate acestea, șoarecii imunodeficienți nu sunt ușor de crescut și sunt costisitori. În mod important, șoarecii imunodeficienți nu reflectă rolurile importante ale sistemului imunitar în dezvoltarea și progresia tumorilor. Astfel, stabilirea unui nou model de xenogrefă de cancer gastric uman la șoareci cu un sistem imunitar normal este de mare importanță. În studiul de față, MKN45, celulele canceroase gastrice umane și micropurtătorul au fost cultivate în cocultură, iar șoarecii imunocompetenți au fost ulterior inoculați cu suspensia, stabilindu-se cu succes o nouă xenogrefă de cancer gastric de origine umană.
2. Materiale și metode
2.1. Materiale
Roswell Park Memorial Institute- (RPMI-) 1640 mediu de cultură, tripsină, ser fetal de bovine și penicilină au fost achiziționate de la Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). Anticorpii monoclonali de iepure împotriva antigenului carbohidrat uman 199 (CA199), a citokeratinei 7 (CK-7) și a homeoboxului de tip caudal 2 (CDX-2) au fost achiziționați de la Abcam (Cambridge, Regatul Unit). Microcarrier-6 a fost achiziționat de la Elyon Biotechnologies LLC (Gaithersburg, MD, SUA).
2.2. Animale experimentale
Șaizeci de șoareci masculi C57BL/6 în vârstă de 6-8 săptămâni, cu greutatea de 22-25 g, au fost achiziționați de la Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co. (număr de licență: SCXK 20140007, provincia Shandong, China) și au fost adăpostiți într-un centru de animale fără agenți patogeni specifici la Spitalul afiliat al Colegiului Medical Jining (provincia Shandong, China). Toate experimentele pe animale au fost efectuate cu aprobarea Comitetului instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din cadrul Spitalului afiliat al Universității de Medicină din Jining și au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare aprobate.
2.3. Liniile celulare
Linia celulară de cancer gastric uman MKN45 a fost achiziționată de la Cell Bank of the Chinese Academy of Science (Shanghai, China) și cultivată în mediu RPMI-1640 care conține 10% ser fetal de bovine și 100 U/mL penicilină la 37°C cu 5% CO2. Mediul de cultură a fost schimbat la fiecare 24 h, iar celulele au fost recoltate prin digestie cu tripsină 0,25%.
2.4. Stabilirea unui model de cultură celulară tumorală tridimensională (3D)
Microcarrierul-6 a fost îmbibat în etanol 75% timp de 24 h, spălat de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat 1x și incubat în mediu RPMI-1640 timp de 24 h. Ulterior, microcarrierul-6 a fost modificat prin incubare timp de 3 h cu factorul 1 alfa derivat din celule stromale (SDF-1α) și factorul de creștere endotelială vasculară (VEGF), ambele la o concentrație de 100 ng/mL. Celulele aflate în faza de creștere logaritmică au fost numărate în urma colorației cu albastru trypan și ajustate la o concentrație de atunci când viabilitatea a fost >95%. Suspensia de celule MKN45 a fost amestecată cu micropurtătorul-6 modificat și incubată la 37°C cu 5% CO2 timp de încă 24 de ore pentru a satura celulele cu micropurtătorul, așa cum s-a observat prin microscopie [figurile 1(c) și 1(d)].
(a)
(b)
(c)
.
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
2.5. Gruparea animalelor
Cei 60 de șoareci C57BL/6 au fost împărțiți în mod aleatoriu în trei grupuri (20 de șoareci pe grup): grupul bidimensional (2D) (animale inoculate cu conținând ), grupul de purtători goi (animale inoculate cu conținând 30 μg de micropurtător-6) și grupul 3D (animale inoculate cu conținând și 30 μg de micropurtător-6).
2.6. Generarea modelului animal
Modelul de cultură de celule tumorale 3D a fost stabilit în prima zi a experimentului și incubat timp de 24 h. În a doua zi, complexele de celule cultivate – micropurtător au fost spălate de trei ori în și ușor amestecate cu pentru a ajusta concentrația la celule și 300 μg de micropurtător-6 la 1 ml de suspensie, și plasate la gheață pentru utilizare ulterioară. Celulele MKN45 în faza de creștere logaritmică au fost recoltate, tripsinizate, spălate de trei ori cu , și resuspendate în la o concentrație de , care a fost plasată la gheață pentru utilizare ulterioară. Microcarrierul-6 modificat a fost spălat de trei ori cu , resuspendat în la o concentrație de 300 μg/mL și plasat la gheață pentru utilizare ulterioară. Fiecare șoarece din toate cele trei grupuri experimentale a fost inoculat cu 100 μL din soluția corespunzătoare sub creasta axilară dreaptă.
2.7. Detectarea indicatorilor și examinarea patologică
După inoculare, șoarecii au fost adăpostiți separat pe grupuri și au fost monitorizate zilnic apetitul, activitățile și greutatea. S-a înregistrat timpul de formare a tumorii locale și volumul tumorii la fiecare șoarece. Odată ce tumorile au fost vizibile, diametrul lung (a) și diametrul scurt (b) al fiecărei tumori au fost măsurate zilnic, iar volumul tumoral a fost calculat în conformitate cu formula volumului tumoral : . Șoarecii purtători de tumori au fost sacrificați în trei loturi: 10, 20 și 30 de zile postinoculare. Țesuturile tumorale au fost îndepărtate complet de la fiecare șoarece, iar calitatea, textura și gradul de infiltrare și necroză a tumorii au fost înregistrate. Țesuturile tumorale au fost ulterior fixate în formaldehidă tamponată neutră 4% și colorate cu hematoxilină și eozină (H&E). Tehnica de colorare în doi pași EnVision a fost utilizată pentru imunohistochimie. Rezultatele colorației au fost determinate pe baza colorației citoplasmatice granulare pozitive a tumorii. Colorarea negativă (-ve) a fost definită ca <5% celule colorate pozitiv, iar colorarea pozitivă (+ve) a fost definită ca ≥5% celule colorate pozitiv.
2.8. Analiză statistică
Pentru analiza statistică a fost utilizat software-ul SPSS 13.0 (IBM SPSS, Chicago, IL, SUA). Datele de măsurare sunt prezentate ca medii ± eroarea standard a mediei (SEM). Diferențele dintre valorile medii ale fiecărui grup au fost comparate utilizând analiza varianței (ANOVA) cu o singură cale sau testul Kruskal-Wallis, după caz. este considerată o diferență semnificativă din punct de vedere statistic.
3. Rezultate
3.1. Stabilirea sistemului de cultivare in vitro a tumorilor 3D MKN45 cu ajutorul micropurtătorului-6
Micropurtătorul-6 este un micropurtător nou compus din polimeri organici electrificabili pozitiv cu o structură poroasă multistrat. Dimensiunea porilor, densitatea de încărcare pozitivă a suprafeței și dimensiunea microcarrierului-6 pot fi ajustate prin sinteză chimică. Micropurtătorul de tip C-6, cu volum mic, dimensiune mare a porilor și pliere spațială de mai multe ori, este utilizat în principal pentru cultura celulară 3D și pentru experimentele de sensibilitate la medicamente [figurile 2(a) și 2(b)]. Micropurtătorul de tip M-6, cu volum mare, dimensiuni mici ale porilor și timpuri mici de pliere internă, este utilizat în principal pentru cercetarea în domeniul ingineriei tisulare [figurile 2(c) și 2(d)]. Microcarrierul de tip C-6 a fost utilizat în studiul nostru. Microcarrierul-6 este un compus organic pur, care nu este predispus la contaminare, nu are impurități, are un nivel scăzut de imunogenitate și metabolism și este foarte biocompatibil, oferind un micro-mediu stabil pentru creșterea celulelor [figurile 2(a)-2(d)]. În plus, micropurtătorul-6 este încorporat direct în pielea șoarecilor, inducând creșterea vaselor de sânge [figurile 2(e) și 2(f)], ceea ce poate asigura un aport sanguin suficient pentru creșterea celulelor tumorale. Celulele MKN45 au aderat rapid în mediul 2D, iar morfologia celulară observată prin microscopie după 24 h de cultură a prezentat o formă neregulată de poligon [figura 1(a)]. Microcarrierul-6 a prezentat o formă neregulată sau fusiformă lungă și o textură lejeră [Figura 1(b)]. În urma unei coculturi de 24 de ore între MKN45 și micropurtătorul-6 modificat, celulele MKN45 au aderat bine la micropurtător și au ajuns la confluență. În plus, au fost observate grupuri neregulate de celule în jurul celulelor MKN45 care au aderat la micropurtătorul-6 (figura 1(c)). Complecșii celulă MKN45-micropurtător au fost colorați cu soluție de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), dezvăluind un număr mare de celule MKN45 aderate la scheletul micropurtător-6 [Figura 1(d)]. Structura poroasă multistrat a micropurtătoarelor poate fi observată la microscopul electronic de scanare [Figura 1(e)]. Celulele MKN45 au aderat la micropurtătoare, iar celulele care au aderat la suprafață au format grupuri de celule [Figura 1(f)].
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2. Supraviețuirea șoarecilor și formarea de tumori
Nici o schimbare semnificativă a apetitului, a blănii sau a greutății corporale nu a fost observată între grupuri în timpul experimentului (tabelul 1). Șoarecii din grupul 3D au prezentat o ușoară scădere a activității la o săptămână postinoculare. Niciun animal nu a murit în niciun grup și nu s-a constatat formarea de tumori în grupurile cu purtător gol sau 2D în timpul experimentului de 30 de zile. Masele subcutanate la 15 din cei 20 de șoareci din grupul 3D au fost identificate prin palpare la 7-10 zile după inoculare, ceea ce sugerează o rată de formare a tumorilor de 75 % (tabelul 1). Xenogrefele tumorale au crescut rapid și au fost observate ca mase subcutanate la aproximativ 10 zile de la inoculare [Figura 3(a), Figura suplimentară 3]. Xenogrefele tumorale au crescut până la o dimensiune de 0,5-1,0 cm3 de la 2 până la 3 săptămâni postinoculare. Țesuturile xenogrefei tumorale au fost separate cu ușurință de țesuturile adiacente și s-au prezentat sub forme relativ regulate, în cea mai mare parte rotunde sau ovale, de culoare alb-cenușie sau roșu-cenușie și cu o aprovizionare abundentă cu sânge periferic (figurile 3(b) și 3(c) și figura suplimentară 3). Au existat modificări histologice ale locului de injectare în grupul de purtători goi, dar nu au existat modificări în grupul 2D [figurile 3(d) și 3(e)]. Au fost observate mase subcutanate mici cu o culoare galbenă în grupul de purtători goi [Figura 3(d)].
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Datele sunt afișate ca .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
.
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3. Colorarea H&E
Histomorfologia, observată prin microscopie optică, a arătat un număr mare de celule dezordonate și atipice în xenogrefele tumorale de la șoarecii din grupul 3D (figurile 4(a)-4(c)). S-a observat un număr mare de celule heterotipice, micropurtătoare reziduale și vase de sânge abundente, la 10 zile postinoculare (Figura 4(a)). La 20 de zile după inoculare, s-a observat un număr mic de micropurtători reziduali (figura 4(b)) și un număr mare de leziuni necrotice (figura 4(d)). Cu toate acestea, micropurtătorii au fost eliminați în mod substanțial la 30 de zile după inoculare [figura 4(c)]. Un număr mare de micropurtători și un număr mic de celule inflamatorii au fost observate în grupul de purtători goi, dar nu s-au găsit celule tumorale [figura 4(e)].
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.4. Imunohistochimie
Imunohistochimia a fost efectuată la animalele eutanasiate la 20 de zile după xenogrefa tumorală. Țesuturile xenogrefei tumorale au prezentat o colorare pozitivă pentru CA199, CK-7 și CDX-2 (figurile 4(f)-4(h)), confirmând și mai mult faptul că celulele atipice erau celule tumorale de origine umană.
4. Discuție
Modelurile animale au fost utilizate pe scară largă pentru a studia patogeneza și mecanismele metastatice ale cancerului gastric și joacă un rol extrem de important în evaluarea eficacității și toxicității medicamentelor terapeutice . În prezent, modelele animale de cancer gastric includ în principal următoarele: modelul de inducție, modelul de transplant și modelul de inginerie genetică . Dintre cele trei tipuri de modele, modelul de transplant este ușor de operat și, prin urmare, utilizat pe scară largă. Tipul de animale experimentale, xenogrefele tumorale, precum și locul și calea de transplant au fost considerați factori care afectează succesul modelelor de xenogrefă . Șoarecii cu defecte ale funcției imunitare, cum ar fi șoarecii nude și șoarecii cu imunodeficiență combinată severă (SCID), sunt utilizați în mod obișnuit pentru modelele de xenogrefe . Cu toate acestea, din cauza costului relativ scump, a duratei scurte de viață și a lipsei de răspuns imun la tumori la șoarecii cu imunodeficiență, am selectat șoarecii C57BL/6 imunocompetenți pentru modelul de xenogrefă pentru a evita neajunsurile șoarecilor cu imunodeficiență. În general, se crede că apariția cancerului gastric nu este legată de nivelul de estrogen, iar incidența cancerului gastric la bărbați este mai mare decât la femei. Astfel, am folosit șoareci masculi ca modele. În plus, studiul de față a utilizat celule de cancer gastric uman MKN45 pentru a stabili modelul in vitro, în principal din cauza caracteristicilor puternic invazive și metastatice ale liniei celulare . Mai mult decât atât, regiunea subcutanată subrațului și transplantul ectopic au fost selectate ca loc și, respectiv, cale de transplantare a celulelor tumorale, ca urmare a alimentării abundente cu sânge și a structurii țesutului liber din această zonă, care facilitează creșterea tumorii la șoareci .
Ca o punte între sistemul de cultură celulară 2D și modelul animal, sistemul de cultură celulară 3D simulează mai bine micro-mediul de creștere a celulelor tumorale și a devenit un subiect atractiv în cercetarea actuală . Cultura 3D a celulelor canceroase va forma organoizi tumorali, iar modelele de xenogrefe tumorale de șoarece bazate pe organoizi tumorali au început să fie aplicate la screening-ul medicamentelor anticancerigene . Studiul de față a utilizat noul microcarrier-6 și celulele MKN45 pentru experimentele de cocultură pentru a stabili cu succes un model de creștere 3D. Am încorporat direct micropurtătorul-6 în țesutul subcutanat al șoarecilor pentru a permite vaselor de sânge să intre în micropurtătoare, prezentând un avantaj specific care nu este obținut cu alte micropurtătoare. Studiile au raportat o imunosupresie ușoară a șoarecilor imunocompetenți pentru a obține rezistență la celulele tumorale umane, stabilind cu succes un model de șoarece purtător de tumori ; cu toate acestea, până în prezent, nu există rapoarte privind succesul transplantului ectopic al unei tumori umane în șoareci normali în condiții neimunosupresive. În plus, atunci când am ajustat concentrația de celule MKN45 la și am injectat imediat 100 μL de suspensie de celule MKN45 subcutanat la fiecare șoarece, nu s-a obținut o formare stabilă a tumorii din cauza clearance-ului imunitar puternic al celulelor tumorale umane transplantate ectopic. Microcarrierul-6 utilizat în studiul de față a prezentat o imunogenitate scăzută și o textură lejeră cu numeroși pori în centru, facilitând creșterea celulelor tumorale. Microcarrier-6 a acționat, de asemenea, ca o barieră pentru a bloca celulele imune să ucidă direct celulele tumorale. Micropurtătorul-6 modificat a permis vaselor de sânge să se dezvolte cu ușurință în interiorul tumorii, oferind condiții adecvate pentru creșterea rapidă a celulelor tumorale.
Imunitatea celulară este principala armată împotriva creșterii tumorilor; celulele implicate includ în principal celulele T, celulele ucigașe naturale, macrofagele și celulele dendritice . Datorită structurii neregulate de tip „labirint” a microcarrierului-6, acesta poate acționa ca o barieră pe termen scurt și poate bloca, într-o anumită măsură, uciderea directă a celulelor tumorale de către celulele imune. În plus, cu trei ore înainte de experiment, microcarrier-6 a fost modificat în continuare cu SDF-1α și VEGF pentru a accelera formarea vaselor de sânge și a asigura o alimentare cu sânge pentru creșterea rapidă a tumorii, ceea ce a depășit efectul imunitar antitumoral al șoarecilor. În același timp, am constatat că macrofagele din sângele periferic și țesuturile splenice ale șoarecilor au fost semnificativ diminuate în timpul etapei timpurii de formare a tumorii transplantate, în comparație cu grupul de control normal (Figura suplimentară 1). Numărul de macrofage din măduva osoasă a scăzut treptat între grupul de purtători goi, grupul 2D și grupul 3D, dar nu a existat nicio semnificație statistică (Figura suplimentară 2A, 2B). Comparativ cu grupul de purtători goi, numărul de limfocite T din splină în grupul 2D a fost redus, dar nu a existat nicio semnificație statistică (Figura suplimentară 2C). Numărul de limfocite T din splină în grupul 3D a fost semnificativ mai mic decât cel din grupul 2D (Figura suplimentară 2C). Acest lucru sugerează că creșterea tumorii a inhibat sistemul imunitar, permițând tumorii să se dezvolte rapid.
Studiul de față a stabilit un model de creștere 3D a celulelor MKN45, stabilind cu succes un model de xenogrefă de cancer gastric uman la șoareci imunocompetenți în grupul 3D, în timp ce șoarecii din grupurile 2D și purtător gol nu au format nicio tumoare. Acest model de xenogrefă a fost caracterizat de creșterea rapidă a tumorilor, care au putut fi palpate cu mâna la 7-10 zile postinoculare și au atins o creștere optimă la 10-15 zile postinoculare; volumul tumorii a fost de 0,5-1,0 cm3 la aproximativ 20 de zile după inoculare. Un număr mare de celule cu atipie nucleară care au infiltrat țesuturile musculare și adipoase au fost detectate prin colorația H&E. Microcarrierul-6 rezidual a fost înconjurat de celule inflamatorii și a format granuloame cu o zonă mare de necroză în centru, care a fost probabil cauzată de un aport sanguin insuficient din cauza creșterii rapide a tumorii. Aceste fenomene sunt în concordanță cu dezvoltarea tumorilor la om. Mai mult, capilarele abundente au fost localizate în principal la periferia tumorilor. În prezent, nu există un marker tumoral specific pentru cancerul gastric; cu toate acestea, CA199, CK-7 și CDX-2 sunt utilizate în mod obișnuit ca markeri ai tumorilor gastrointestinale . Astfel, am ales acești trei markeri pentru etichetarea și identificarea celulelor canceroase gastrice de origine umană. Colorarea imunohistochimică a CA199, CK-7 și CDX-2 a fost pozitivă, confirmând și mai mult că celulele heteromorfe erau celule umane de cancer gastric.
5. Concluzii
Am stabilit cu succes un model xenograft de cancer gastric uman la șoareci imunocompetenți. Acest model poate reflecta interacțiunea dintre sistemul imunitar al organismului și tumori și are perspective largi de aplicare în viitoarele cercetări privind imunitatea tumorală, precum și în cercetarea și dezvoltarea de noi medicamente.
Date disponibile
Datele utilizate pentru a susține concluziile acestui studiu sunt disponibile la cerere la autorul corespondent.
Conflicte de interese
Autorii declară că nu au conflicte de interese.
Contribuții ale autorilor
Yanzhen Bi, Quanyi Wang și Yonghong Yang au contribuit în mod egal la această lucrare.
Recunoștințe
Acest studiu a fost sprijinit prin granturi de la Fundația Națională de Științe Naturale a Chinei (81170395 și 81570556), Fundația de Științe Naturale a provinciei Jilin (20180101137JC și 20180101130JC) și Fondul de cercetare pentru stația de lucru a academicianului Lin He de medicină nouă și traducere clinică în Universitatea de Medicină din Jining (JYHL2019FMS21).
Materiale suplimentare
Schimbări ale celulelor inflamatorii și alte date tumorigene. Figura suplimentară 1: modificările celulelor inflamatorii la șoarecii purtători de tumori în timpul etapei timpurii de formare a tumorii transplantate. Figura suplimentară 2: modificările celulelor inflamatorii în diferite grupuri în timpul etapei timpurii de formare a tumorii transplantate. Figura suplimentară 3: șoareci purtători de tumori și țesuturile tumorale transplantate. (Materiale suplimentare)