Efectele măsurate ale Wnt3a asupra proliferării celulelor HEK293T depind de testul aplicat
Abstract
Calea de semnalizare Wnt a fost asociată cu multe procese celulare esențiale. Acest studiu își propune să examineze efectele semnalizării Wnt asupra proliferării celulelor HEK293T cultivate. Celulele au fost incubate cu Wnt3a, iar activarea căii Wnt a fost urmărită prin analiza nivelului de proteină β-catenină și a nivelurilor de expresie a genelor țintă MYC și CCND1. Nivelul proteinei β-catenină a crescut de până la patru ori. În timp ce nivelul ARNm al c-Myc și al ciclinei D1 a crescut ușor, nivelul proteinelor a crescut de până la un factor de 1,5. În mod remarcabil, testele MTT și BrdU au arătat rezultate diferite atunci când au măsurat rata de proliferare a celulelor HEK293T stimulate de Wnt3a. În testele BrdU a putut fi detectată o creștere a ratei de proliferare, care a fost corelată cu concentrația de Wnt3a aplicată. În schimb, această corelație nu a putut fi demonstrată în testele MTT. Rezultatele MTT, care se bazează pe activitatea mitocondrială, au fost confirmate prin analiza complexului succinat dehidrogenază prin imunofluorescență și prin Western blotting. În ansamblu, studiul nostru arată că Wnt3a activează proliferarea celulelor HEK293. Aceste efecte pot fi detectate prin măsurarea sintezei ADN mai degrabă decât prin măsurarea modificărilor activității mitocondriale.
1. Introducere
Calea de semnalizare Wnt este cunoscută ca jucând un rol cheie în reglarea diferențierii celulare, proliferării, supraviețuirii și apoptozei . Proteinele Wnt sunt o familie foarte bine conservată de glicoproteine bogate în cisteină modificate cu lipide secretate care activează cascade de semnalizare în interiorul celulei prin legarea la un membru al familiei Frizzled (Fz) de receptori cuplați cu proteina G de pe matricea extracelulară . Există 19 membri ai Wnts la vertebrate , care pot fi grupați în două clase principale pe baza capacității lor de a stabiliza β-catenina citosolică: calea canonică și calea necanonică . Lucrări recente au arătat, de asemenea, că anumiți liganzi Wnt, cum ar fi Wnt5a, sunt capabili să activeze mai mult de o singură cale de semnalizare Wnt , astfel încât clasificarea strict binară devine din ce în ce mai depășită. Funcționarea defectuoasă a căii de semnalizare Wnt este legată de mai multe boli, cum ar fi osteoporoza , boala Crohn , boala Alzheimer , schizofrenia și, în special, cancerul .
Ligandul Wnt3a face parte din calea de semnalizare Wnt dependentă de β-catenină (canonică), care se leagă de receptorii transmembranari frizzled. Ulterior, complexul de receptori LRP5 (LRP5) sau LRP6 (low-density lipoprotein receptor-related protein 5 sau LRP6) activează proteinele dezordonate citoplasmatice, care declanșează inhibarea glicogen sintază kinazei 3β (GSK-3β). Protooncoproteina β-catenina se acumulează în citoplasmă ca o consecință a dezasamblării complexului de distrugere care este format din adenomatoza polipozei coli (APC), AXIN și GSK-3β. Astfel, β-catenina poate fi translocată în nucleu, unde activează transcrierea genelor țintă mediată de factorul de transcripție specific celulelor T (TCF)/factorul de amplificare a limfoidelor (LEF) . Aceste gene sunt responsabile pentru reglarea proceselor fiziologice esențiale în dezvoltarea embrionară și adultă, cum ar fi proliferarea celulară, diferențierea, morfogeneza și adeziunea celulară .
Cu indicația de proliferare, există o interacțiune complexă între semnalizarea Wnt canonică și ciclul celular. Calea de semnalizare Wnt/β-catenin este semnificativă în stimularea progresiei fazei G1 prin inhibarea GSK-3β, care reglează efectorii ciclului celular și regulatorii de creștere .
O genă țintă directă a căii de semnalizare Wnt/β-catenin este protooncogenei MYC, care a fost identificată ca o țintă Wnt în celulele cancerului de colon . Regulatorul de transcripție c-Myc controlează multe funcții celulare, în special reglarea progresiei ciclului celular . Gena codificatoare a ciclinei D1 CCND1 este, de asemenea, o genă țintă a căii Wnt/β-catenin, care a fost descrisă în celulele cancerului de colon . Ciclina D1 ca activator al kinazei dependente de ciclină (cdk) 4 sau cdk 6 conduce tranziția de fază G1/S .
Există mai multe modalități de măsurare a proliferării celulare induse de Wnt3a. O metodă non-radioactivă este o imunodozare bazată pe încorporarea 5-bromo-2′-deoxiuridinei (BrdU) în ADN pentru a determina sinteza ADN, care se corelează cu tranziția la faza S și, prin urmare, cu proliferarea celulară . O altă metodă utilizează măsurarea activității mitocondriale a celulelor viabile. În testul MTT, un produs formazan albastru insolubil este produs de dehidrogenazele mitocondriale prin reducerea MTT (bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazoliu) .
În acest studiu am investigat proliferarea celulelor HEK293T sub influența liganzilor Wnt3a prin utilizarea testului MTT, precum și a testului BrdU. Mai mult decât atât, am comparat rezultatele acestor teste cu activitatea mitocondrială a celulelor tratate cu Wnt3a, măsurată prin imunocolorația proteinei lanțului de transport al electronilor SDHA (subunitatea A a complexului succinat dehidrogenazei).
2. Materiale și metode
2.1. Celule și cultivare celulară
Celele de rinichi embrionar uman, HEK293T, au fost cultivate în mediu Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) suplimentat cu 10% ser fetal de bovine (PAN Biotech, Aidenbach, Germania), 1% aminoacizi neesențiali și 1% penicilină/streptomicină (Sigma Aldrich, St. Louis, SUA) la 37°C în 5% CO2.
2.2. Teste de proliferare
Sesizările cu MTT și BrdU au fost efectuate pe plăci cu 96 de godeuri. Zece mii de celule au fost însămânțate pe puț și celulele au fost stimulate cu doze crescânde de Wnt3a (R&D Systems, Minneapolis, SUA), și anume, 0, 10, 50, 100, 150 și 200 ng/mL, timp de 24, 48 și 72 h. MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, SUA) a fost dizolvat în PBS la 5 mg/mL și 20 μL de soluție de MTT au fost adăugate în fiecare puț, urmate de o incubare de trei ore la 37°C la 5% CO2. Mediul cu MTT a fost apoi îndepărtat și s-au adăugat 200 μL de DMSO. Pentru a dizolva cristalele, celulele au fost agitate timp de 15 minute la temperatura camerei. Plăcile au fost citite cu un cititor ELISA (Tecan Group Ltd., Männedorf, Elveția) la 590 nm. Pentru dozarea BrdU s-a utilizat un kit comercial „Cell Proliferation ELISA BrdU colorimetric” (Roche, Mannheim, Germania) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. După adăugarea soluției de marcare BrdU, celulele au fost incubate timp de trei ore la 37°C la 5% CO2. După etapa finală de spălare, s-au adăugat 100 μL/puț de soluție de substrat în celule, iar reacția a fost oprită după 15 minute de incubare la temperatura camerei cu ajutorul acidului sulfuric. Plăcile au fost citite imediat cu ajutorul unui cititor ELISA la 450 nm. Toate testele au fost efectuate în triplu exemplar (). Pentru calibrare, celulele au fost însămânțate în numere diferite (0,1 × 104 până la 3 × 104).
2.3. Imunocitochimie și microscopie de fluorescență
Celele HEK293T au fost însămânțate în plăci cu 24 de godeuri și tratate cu 0-200 ng/mL Wnt3a la o confluență de 30% și fixate în formaldehidă 4% după 24, 48 și 72 h. S-a adăugat anticorpul SDHA (Abcam, Cambridge, UK) la o diluție de 1 : 200 și celulele au fost incubate timp de o oră. Nucleii celulelor au fost contrariați cu DAPI timp de 5 minute. Celulele au fost analizate prin microscopie cu fluorescență (Observer. Z1 de la Zeiss, Jena, Germania) și software-ul însoțitor AxioVision 4.7.
2.4. Electroforeza pe gel a proteinelor și Western Blot
Utilizând testul Bradford-Assay s-au determinat concentrațiile de proteine în lizații de celule întregi. Cantități egale de proteine au fost încărcate pe geluri de SDS-poliacrilamidă (NuPAGE, 4-12%, Life Technologies, Carlsbad, SUA). Gelurile au fost rulate la 150 V timp de 1 h și transferate pe membrane de nitroceluloză prin intermediul sistemului iBlot (Life Technologies). Membranele au fost analizate cu ajutorul anticorpilor primari împotriva SDHA, β-cateninei, c-Myc, ciclinei D1 și β-actinei (Cell Signaling, Cambridge, UK), diluați la 1:1000 în TBS-Tween cu 3% lapte, urmați de o incubare cu un anticorp secundar corespunzător conjugat cu peroxidază de hrean (diluție 1:2000). Benzile de proteine au fost vizualizate cu ajutorul detecției ECL.
2.5. Izolarea ARN-ului și RT-PCR
ARN total a fost izolat cu NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Germania) și 1 μg de ARN a fost transcris invers cu Verso cDNA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania) într-un volum de 40 μL. Secvențele amorselor (MWG, München, Germania) utilizate pentru PCR semi-cantitativă cu transcriptază inversă sunt pentru GAPDH 5′-catggtggctgagagatttgccaac-3′ (înainte) și 5′-tcaacacaccttgaccttctctcatcac-3′ (invers), pentru MYC 5′-ccggagcaaggacgacgcgactctctc-3′ (înainte) și 5′-gcctttcagagaagagcgggtcctcct-3′ (invers), iar pentru CCND1 5′-gcctgaacacctgaggagcccca-3′ (înainte) și 5′-gtcacacttgatcactctgg-3′ (invers). Amplificarea PCR a fost realizată utilizând My Taq Red Mix (Bioline, Luckenwalde, Germania) în conformitate cu protocolul producătorului. Reacția a fost realizată cu denaturare preliminară timp de 2 minute la 94°C, urmată de 30 de cicluri de denaturare la 94°C timp de 1 minut, recoacere la 55°C (CCND1), 57°C (GAPDH) sau 60°C (MYC) timp de 30 de secunde și prelungire la 72°C timp de 1 minut. Etapa finală de extensie a durat 10 min la 72°C. Produsele PCR au fost analizate prin electroforeză pe un gel de agaroză de 1,5 %.
2.6. Analiza datelor
Programul Microsoft Excel a fost utilizat pentru gestionarea datelor, inclusiv pentru calcularea abaterilor standard. western blots și gelurile de agaroză au fost scanate cu sistemul de documentare pe gel Quantum ST4 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Germania). Benzile au fost cuantificate cu ajutorul software-ului ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, SUA).
3. Rezultate
3.1. Efectele Wnt3a asupra inducerii β-Cateninei și a genelor țintă tipice Wnt
Pentru a dovedi activarea căii Wnt, am detectat cantitatea de concentrație a proteinei β-catenină în celulele HEK293T după tratamentul cu Wnt3a (Figura 1). După 24 de ore de tratament, concentrația proteinei β-catenină a crescut odată cu creșterea concentrațiilor de Wnt3a. Cea mai mare concentrație a proteinei β-catenin a fost identificată la 24 de ore cu o concentrație de 200 ng/mL Wnt3a. Aici, cuantificarea a arătat o creștere de patru ori mai mare în comparație cu martorul. La punctele de timp 48 și 72 de ore după tratament, efectul inducerii β-cateninei nu mai este clar recognoscibil. În plus, am analizat reglarea genelor țintă Wnt CCND1 și MYC după tratamentul cu Wnt3a atât prin RT-PCR semicantitativă, cât și prin Western blot (figurile 2 și 3). În celulele netratate s-a detectat un nivel bazal al c-Myc și al ciclinei D1. Rezultatele RT-PCR au arătat modificări marginale ale cantității de ADNc MYC și o inducție a CCND1 după 24 și 48 de ore cu 10 ng/mL Wnt3a, precum și după 72 de ore cu o concentrație de 100-200 ng/mL Wnt3a. S-a observat o ușoară creștere a nivelului proteic al c-Myc cu o concentrație de 50 ng/mL după 24 de ore. Cuantificarea prin Western blot a ciclinei D1 a arătat o creștere de un factor de 1,5 cu o concentrație de Wnt3a de la 50 la 200 ng/mL după 24 de ore. Nivelul proteic al c-Myc a urcat în același mod cu o concentrație de 50 ng/mL Wnt3a după 24 de ore.
3.2. Teste de proliferare celulară
Pentru a studia efectele proteinelor Wnt asupra creșterii celulare, celulele HEK293T au fost cultivate în plăci cu 96 de godeuri timp de 24 de ore înainte de a fi tratate cu concentrații de proteine Wnt3a de 0, 10, 50, 100, 150 sau 200 ng/mL, respectiv. După 24, 48 și 72 de ore de incubație, s-au efectuat testele MTT și BrdU. Testele BrdU arată o tendință clară; odată cu creșterea concentrațiilor de Wnt3a, citirea asociată a crescut [figura 4(a)], în care Wnt3a indică cea mai mare rată de creștere după 48 de ore și o concentrație de 200 ng/mL.
(a)
(b)
(a)
(b)
În contrast cu testele BrdU, testele MTT nu au arătat o corelație între concentrațiile de Wnt și numărul de celule. Numerele de celule au rămas toate aproximativ la fel sau au scăzut în comparație cu controalele lor relevante [a se vedea figura 4(b)].
3.3. Activitatea mitocondrială
Pentru a susține și mai mult rolul lui Wnt3a legat de activitatea mitocondrială în celulele HEK293T, cantitățile de proteină SDHA au fost determinate prin Western blot, precum și prin analiză imunocitochimică. Succinat dehidrogenaza (SDH) cu subunitatea sa SDHA este o componentă cheie a ciclului acidului citric, care este implicată în complexul II al lanțului mitocondrial de transport al electronilor și este responsabilă pentru transferul de electroni de la succinat la ubichinonă. Celulele au fost tratate în mod egal cu experimentele de analiză a proliferării și au fost incubate cu anticorpul SDHA conform descrierii de mai sus. Rezultatele (figura 5) au arătat o creștere a semnalului de fluorescență și, de asemenea, un semnal mai intens la testul Western Blot în raport cu martorul după 24 de ore de tratament cu Wnt3a. După 48 de ore, nivelul proteic înregistrat prin microscopie de imunofluorescență sau prin analiza western blot nu a prezentat nicio modificare semnificativă. După 72 de ore de tratament cu Wnt3a, s-a observat chiar o scădere a semnalului în ambele experimente. Cel mai mare semnal a fost măsurat după 24 de ore cu 50 ng/mL Wnt3a.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4. Discuție
Proteinele Wnt sunt implicate în diverse funcții celulare, inclusiv în reglarea expresiei genice pentru ciclul celular și proliferare . Wnt3a este cunoscută ca un promotor al proliferării și migrației celulelor epiteliale ale cristalinului uman , de asemenea pentru proliferarea fibroblastelor sau ca regulator al proliferării celulelor beta NIT-1 pancreatice . MYC și CCND1 sunt gene țintă ale căii de semnalizare Wnt în celulele mamiferelor. De exemplu, Yoon et al. au expus faptul că semnalizarea Wnt activează biogeneza mitocondrială prin efectuarea unui screening RNAi pe scară largă; ei au identificat gene care afectează funcția mitocondrială, printre altele MYC .
În această lucrare am determinat efectele lui Wnt3a asupra proliferării celulelor HEK293T. Pentru aceasta am aplicat două teste majore, care sunt utilizate pe scară largă pentru analiza ratelor de proliferare a celulelor cultivate, și anume, testele MTT și BrdU. Astfel, efectele specifice ale liganzilor Wnt asupra sintezei ADN și activității mitocondriale au fost detectate și comparate direct.
Pentru a stabili sistemul nostru și pentru a dovedi efectul Wnt3a asupra căii Wnt în celulele HEK293T am demonstrat inducerea β-cateninei după 24 de ore de tratament cu Wnt3a și am analizat nivelurile de expresie ale MYC și CCND1. Nivelul celor două gene țintă a crescut, de asemenea, după 24 de ore de expunere la Wnt3a. C-Myc are un rol cheie în progresia fazei G1; aceasta reglează în sens ascendent ciclina D1 și reprimă p21 și p27 . La rândul său, ciclina D1 promovează fosforilarea și inhibarea complexului retinoblastomului (Rb), care la rândul său crește nivelul ciclinei E . Îmbogățirea ciclinei E duce la trecerea punctului de control al fazei G1/S .
În timpul fazei G1 mitocondriile trebuie să furnizeze o cantitate mare de energie . Această fază oxidativă este urmată de o perioadă reductivă în timpul fazei S-/G2-/M- din ciclul celular, în care are loc replicarea ADN-ului și proliferarea mitocondriilor .
Ratele de proliferare a HEK293T tratate cu Wnt3a au fost diferite, atunci când au fost măsurate prin cele două teste utilizate în acest studiu. Explicăm această diferență prin mecanismele de detecție diferite ale acestor metode. Testul MTT măsoară activitatea mitocondriilor; pe de altă parte, testul BrdU detectează cantitatea relativă de ADN nou sintetizat. Wagner et al. se referă la o relație foarte semnificativă între BrdU și MTT în rezultatele lor privind proliferarea limfocitelor canine, deși testul BrdU se dovedește a fi mai sensibil decât testul MTT . Efectul aparent negativ al Wnt3a asupra numărului de celule ar putea fi explicat printr-un declin al activității mitocondriale. Cu toate acestea, testul BrdU a arătat un efect de promovare a sintezei ADN în aceste celule. Experimentele privind activitatea mitocondrială au arătat că numai după 24 de ore de tratament cu Wnt3a a crescut nivelul SDHA. Activarea cu Wnt3a recombinant nu are, probabil, niciun efect asupra activității mitocondriale după 48 de ore sau mai târziu. În conformitate cu acest efect limitat în timp este semnalul în scădere în timpul testului MTT după 48 și 72 de ore. Acest lucru este confirmat, de asemenea, de acumularea în scădere a β-cateninei de către Wnt3a după 24 de ore. Alte publicații susțin această ipoteză conform căreia celulele tratate cu Wnt3a indică un nivel crescut de β-catenină doar în timpul unei perioade de 24 de ore . Explicăm rezultatele noastre, care sunt contrare efectului de proliferare publicat al Wnt3a prin faptul că majoritatea studiilor au folosit celule supraexprimate cu Wnt3a, mediu condiționat cu Wnt3a sau celule lipsite de ser cu proteină Wnt recombinantă pentru activarea căii de semnalizare Wnt/β-actină.
În concluzie, rezultatele din testele BrdU și MTT sunt greu comparabile atunci când se măsoară efectele Wnt3a asupra ratei de proliferare a celulelor HEK293T. Diferențele pot fi explicate prin punctele lor de aplicare diferite, și anume activitatea mitocondrială și sinteza ADN-ului. Pentru a oferi dovezi definitive cu privire la rata de proliferare celulară, interpretarea rezultatelor unei singure metode ar putea fi înșelătoare. Pentru evaluarea proliferării celulare, numărarea directă a celulelor prin metode optice ar reflecta cel mai bine situația reală. Ar fi interesant de comparat rezultatele corespunzătoare cu rezultatele testelor biochimice, cum ar fi BrdU și MTT.
Conflict de interese
Autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.
Recunoștință
Această lucrare a fost susținută financiar de către Ministerul Federal al Educației și Cercetării (BMBF) .