Articles

Ce este imagistica de câmp larg?

by admin

Introducere

Toată tehnica microscopică în care întreaga probă este expusă la lumină este cunoscută sub numele de imagistică „în câmp larg”. Contrapartea câmpului larg este confocala, în care se utilizează găuri de ac pentru a bloca cea mai mare parte a luminii către și dinspre eșantion. Acest articol va discuta despre imagistica cu câmp larg și despre cele mai utilizate tehnici cu câmp larg în microscopie.

Microscoape cu câmp larg

În microscopul cu câmp larg, întreaga probă este luminată de o sursă de lumină cu lampă, fie de jos (un microscop vertical), fie de sus (un microscop inversat). Microscoapele verticale sunt utilizate frecvent cu eșantioane fixate, cum ar fi celulele sau țesuturile care au fost tratate și montate pe lamele de microscop, în timp ce microscoapele inversate sunt adesea mai bune pentru vizualizarea unui eșantion scufundat în lichid, deoarece acesta se scufundă de obicei în partea de jos și este mai ușor de văzut de jos cu obiectivele microscopului respectiv. Acest lucru permite vizualizarea celulelor în suspensie, deoarece celulele studiate în științele vieții sunt de obicei fie aderente (cresc atașate de o suprafață), fie cresc în suspensie (celule suspendate în lichid). Exemple de microscop vertical și inversat pot fi văzute în Fig.1.

Figura 1: Microscoape verticale vs. microscoape inversate. Stânga) Microscop vertical: imagine observată de sus și luminată de jos. Dreapta) Microscop inversat: imagine observată de jos și luminată de sus. Ambele microscoape pot utiliza, de asemenea, iluminarea epifluorescentă, unde sursa de lumină și imaginea trec prin aceleași obiective. Iluminarea trans include tehnici precum contrastul de fază și DIC, discutate mai jos. Imagine de la Molecular Probes.

Microscoapele cu câmp larg folosesc în mod obișnuit o sursă de lumină albă (cum ar fi o lampă) este suficientă cu unele filtre pentru lucrările de fluorescență. Acest lucru face, de asemenea, ca imagistica să fie mai simplă și dimensiunile fișierelor de imagine mai mici, facilitând lucrul cu câmp larg pentru aplicații cum ar fi documentarea celulară.

Tehnici de câmp larg

Exemple de tehnici de microscopie cu câmp larg sunt câmpul luminos, contrastul de interferență diferențială (DIC), contrastul de fază și fluorescența cu câmp larg.

Microscopia cu câmp luminos este o formă accesibilă de microscopie, în care o întreagă probă este iluminată de o lumină puternică. Această abordare implică o pregătire redusă a probei și poate fi utilizată pentru a verifica rapid și ușor celulele vii sau pentru a produce date suplimentare. Cu toate acestea, utilizarea unui agent de contrast este foarte recomandată, deoarece majoritatea eșantioanelor de celule sunt transparente și va fi dificil de rezolvat fără un colorant sau un colorant. Celulele sunt în cea mai mare parte apă și, atunci când sunt imaginate pe sticlă sau plastic transparent, poate fi dificil să se distingă structurile mai mici fără un contrast suplimentar.

Pentru contrastul de interferență diferențială (DIC), proba este iluminată de o lumină divizată în două fascicule de lumină polarizată, când aceste fascicule se recombină, diferențele de defazaj apar ca contrast în imaginea finală. În mod similar cu contrastul de fază, această tehnică nu este potrivită pentru eșantioane mai groase și necesită o configurație tehnică mai complexă decât alte tehnici.

Microscopia cu contrast de fază oferă un contrast mai bun decât câmpul luminos prin utilizarea luminii împrăștiate de la eșantion. Iluminând proba cu un inel de lumină și având un alt inel în fața vizorului microscopului, părțile probei care împrăștie lumina în mod diferit apar ca fiind mai întunecate sau mai deschise pe imagine, ceea ce îi conferă un contrast mai mare decât microscopia standard cu câmp luminos. Acest contrast îmbunătățit nu se observă pe eșantioane mai groase, deoarece produce artefacte, dar funcționează bine în cazul culturilor celulare. Un exemplu al acestor inele poate fi văzut în Fig.2.

Figura 2: Imaginea de sus arată un microscop glisant pentru câmp luminos și contrast de fază, cu cercul cel mai din dreapta folosit pentru câmp luminos și celelalte două folosite pentru contrast de fază, în funcție de mărire (4x și 10/20/40x, după cum se arată). Imaginea de jos prezintă eșantioane imaginate cu DIC sau cu contrast de fază și diferențele dintre aceste tehnici. Imagini adaptate de la Eurotek, Olympus.

Microscopia de fluorescență în câmp larg este similară cu cea în câmp luminos, dar se folosesc lungimi de undă specifice de lumină pentru a excita moleculele fluorescente cu care proba a fost tratată în prealabil (deși unele probe sunt autofluorescente în mod natural). Probele pot fi colorate cu markeri fluorescenți pentru proteine specifice sau componente celulare, iar apoi lumina de emisie a fluorescenței de la acești markeri formează o imagine. Semnalul de fluorescență înseamnă că există un contrast mai bun în comparație cu alte tehnici, deoarece, prin utilizarea unor lungimi de undă specifice de lumină, doar moleculele fluorescente emit lumină, spre deosebire de întreaga imagine care este iluminată. Cu toate acestea, deoarece întreaga probă este iluminată cu ajutorul acestei lumini, semnalele de fluorescență din afara zonei de vizualizare pot cauza fluorescență de fond și imagini neclare.

Figura 3: DIC vs. microscopie cu contrast de fază vs. microscopie cu fluorescență pentru aceeași probă de neuron. Stânga) DIC, celulele pot fi identificate, dar nu și axonii, contrastul este slab. Centru) Contrastul de fază, contrast mai mare decât DIC, celulele și axonii fiind ușor de identificat. Dreapta) Fluorescență în câmp larg, celulele și axonii sunt ușor de identificat, cu proteine selectate evidențiate mai departe în culoare de markerii fluorescenți (verde pentru β-tubulină, un marker neuronal, albastru pentru DAPI, un marker al nucleului). Imagine de la Leica Microsystems: Introduction to Widefield Microscopy.

Lumina nefocalizată

Inconvenientul principal este că, pe măsură ce toată proba este iluminată, în timp ce planul focal primește lumină și poate genera o imagine, planurile de deasupra și de sub planul focal primesc, de asemenea, lumină, rezultând o lumină nefocalizată care provoacă degradarea imaginii. În special în cazul excitației prin fluorescență, rezoluția unui sistem cu câmp larg este limitată din cauza fluorescenței de fond care este, de asemenea, captată de aparatul de fotografiat și care scade raportul semnal/zgomot.

Certe tehnici de câmp larg evită această problemă, cum ar fi microscopia cu iluminare structurată (SIM), care utilizează modele de lumină pentru a genera un model complex, imagistica bazată pe modelul de interferență permite niveluri de detaliu de super-rezoluție, rezolvând obiecte de până la 200 nm. Mai multe despre SIM pot fi citite în nota de aplicație SIM de pe site-ul nostru.

Summary

Imagistica în câmp larg este baza majorității studiilor celulare, permițând cercetătorilor să obțină rapid și ușor imagini ale probelor, cu un nivel scăzut de pregătire a probelor sau de expertiză tehnică necesară. De la imagistica în câmp luminos la cea în fluorescență, widefield este o tehnică puternică și variată cu care mulți cercetători sunt familiarizați. Deși tehnica poate fi lipsită de rezoluție în comparație cu cea confocală sau cu alte aplicații avansate de microscopie, imagistica cu câmp larg are un loc ferm în cercetare și va continua să se dezvolte în timp.

.