7.2 Arhitectura testiculară

Lue et al. (2005, 2010a) au raportat că șoarecii adulți 41,XXY aveau testicule mici și ferme care conțineau tubuli SCO cu diametrul scăzut, cu un număr crescut de celule Leydig în interstițiu. Aceste constatări sunt identice cu cele pentru modelul alternativ de KS, șoarecele 41,XXY* (Lewejohann et al., 2009a; Wistuba et al., 2010, Fig. 24.2) și seamănă perfect cu fenotipul testicular observat la marea majoritate a bărbaților adulți cu KS (Fig. 24.3). În plus, șoarecii 41,XXY au prezentat un model aberant de expresie a receptorului de androgeni (AR), care nu a fost observat până în prezent în KS (Lue et al., 2005).

Figura 24.2. Fenotipul testicular al modelului de șoarece 41,XXY* de KS.

(A) Hibridizare in situ cu fluorescență (FISH) a cromozomilor sexuali în nucleii interfazici obținuți din probe de sânge periferic de șoareci masculi din tulpina B6Ei.Lt-Y*. Partea stângă: nuclei leucocitari de la șoareci masculi 40,XY*, partea dreaptă: nuclei leucocitari de la șoareci masculi 41,XXY*. (a) cromozomi Y* (vârfuri de săgeată) detectați cu ajutorul sondei fluorescente verzi specifice de șoarece; (b) cromozomul X (săgeți) detectat cu ajutorul sondei fluorescente roșii specifice de șoarece; (c) colorație nucleară DAPI; (d) suprapunerea a-c. Observați cele două semnale ale cromozomului X în leucocitele 41,XXY*. Un cromozom X este întotdeauna situat în strânsă asociere cu semnalul Y*. Suprapunerea parțială a acestor cromozomi poate fi detectată prin culoarea gălbuie. (B) Comparație a greutății bitesticulare între masculii adulți 41,XXY* (n = 98) și martorii lor de litieră 40,XY* (n = 91). Pierderea celulelor germinale la masculii cu un cromozom X supranumerar a dus la reducerea semnificativă a dimensiunii testiculelor. Valorile sunt media ± SEM. (C și D) Micrografiile reprezentative ale histologiei testiculare ale epiteliului seminifer. (C) Șoarece de control 40,XY* care prezintă o spermatogeneză completă. (D) Testicul de șoarece 41,XXY*. Toate celulele germinale au fost epuizate din epiteliul seminifer, lăsând doar sindromul celulelor Sertoli. Celulele Sertoli prezintă un început de vacuolizare. (E și F) Micrografii reprezentative ale histologiei testiculare ale spațiului interstițial. (E) La șoarecii de control 40,XY*, celulele Leydig sunt dispuse în mod normal în spațiile interstițiale dintre pereții tubulari. (F) În schimb, la șoarecii 41,XXY*, numărul celulelor Leydig este crescut, formând o hiperplazie. Barele reprezintă 20 μm. Simboluri: X, celule Sertoli; *, celule germinale în diferențiere; #, celule Leydig. Colorație: Hematoxilină-Eozină.

Figura 24.3. Histologia țesutului testicular uman: Comparație între spermatogeneza normală și sindromul SCO observat de obicei la pacienții Klinefelter.

(A, C și E) Micrografii reprezentative ale histologiei testiculare umane normale care prezintă spermatogeneză completă. (B, D și F) Micrografiile reprezentative ale histologiei testiculare ale unui pacient KS cu sindrom SCO. (A și B) prezentare generală a secțiunilor transversale tubulare: în timp ce țesutul de control prezintă o distribuție normală a zonelor interstițiale și tubulare, situația SCO prezintă o pierdere completă a celulelor germinale și pereți tubulari hialinizați. Tubii seminiferi conțin doar celule Sertoli. (C și D) Detaliu al epiteliului seminifer: În martor, sunt prezente toate stadiile celulelor germinale până la spermatozoizii maturi. În mod obișnuit, la bărbații adulți cu KS, lipsesc toate celulele germinale. Celulele Sertoli prezintă un început de vacuolizare. (E și F) Detaliu al spațiului interstițial. În testiculul de control, celulele Leydig sunt dispuse în mod normal în spațiile interstițiale dintre pereții tubulari. În schimb, în țesutul obținut de la un pacient cu KS, numărul celulelor Leydig este ridicat, prezentând o hiperplazie tipică. Barele reprezintă 20 μm. Simboluri: X, celule Sertoli; *, celule germinale în diferențiere; #, celule Leydig. Colorație: Hematoxilină-Eozină.

Celele Sertoli sunt situate în tubulii seminiferi, unde susțin diferențierea spermatogenă prin asigurarea hranei și medierea semnalizării endocrine (Wistuba et al., 2007). Ca atare, orice alterare a acestor celule esențiale influențează profund funcția testiculară. S-au găsit dovezi privind apoptoza timpurie a celulelor Sertoli în KS, ceea ce a condus la propunerea că pierderea sprijinului și a comunicării dintre celulele Sertoli și celulele germinale ar putea fi legată de sărăcirea celulelor germinale observată în acest sindrom (Aksglaede et al., 2006; Wistuba et al., 2010). Celulele Sertoli exprimă receptorul de androgeni (AR) și produc proteina de legare a androgenilor și inhibina. Prin urmare, orice perturbare a celulelor ar putea influența cantitatea de ITT din spațiile interstițiale și, ca urmare, ar putea afecta feedback-ul endocrin de-a lungul axei hipotalamo-hipofizare gonadale. Nu s-a putut obține nicio dovadă empirică solidă privind alterarea prezenței, dezvoltării și/sau funcției celulelor Sertoli până când nu au fost disponibile primele constatări sistematice din modelele experimentale. Constatările primelor studii (Lue et al., 2005) au fost deosebit de interesante și importante, deoarece au arătat că AR a fost exprimat în celulele Sertoli ale șoarecilor adulți de control XY, dar nu și la șoarecii XXY. Aceasta în ciuda faptului că ambele animale au avut un model similar până în ziua 20 postpartum (pp), ceea ce indică faptul că pierderea expresiei AR la șoarecii XXY are loc în jurul pubertății și sugerează că, la aceste animale, maturarea celulelor Sertoli poate fi alterată, ceea ce indică faptul că acestea pot influența sau pot fi influențate de dezvoltarea anormală a celulelor germinale. O anumită credibilitate a acestei noțiuni a fost furnizată de o evaluare histologică a testiculelor modelului 41,XXY*, care a constatat că numărul de celule Sertoli este scăzut în comparație cu cel al martorilor.

Investigațiile efectuate până în prezent oferă suficiente dovezi pentru a presupune că celulele Sertoli sunt alterate la masculii cu un cromozom X supranumerar. Pentru a înțelege fundamentele interacțiunii dintre celulele Sertoli și celulele germinale, apoptoza celulelor Sertoli, maturizarea și diferențierea, sunt necesare evaluări mai aprofundate; studii care necesită cantități substanțiale de material și cronica proliferării, diferențierii și maturizării pe o perioadă de timp extinsă. Aceste investigații sunt imposibil de realizat la om. Numai cu ajutorul modelelor de șoareci poate fi întreprinsă o explorare semnificativă a modificărilor acestei celule testiculare somatice cruciale.

A fost raportat faptul că în timpul degenerării testiculare observate în KS, de asemenea, celulele Sertoli degenerează în timp (Aksglaede și Juul, 2013; Aksglaede et al., 2006), o observație care este în concordanță cu datele din modelul nostru de șoarece care demonstrează că numărul celulelor Sertoli este modificat în timpul dezvoltării postnatale (Werler et al., 2014). Luate împreună, fiziologia alterată a celulelor Sertoli necesită analize mai detaliate ale acestui tip de celule somatice deja în timpul dezvoltării prenatale. Propagarea și diferențierea liniei germinale este în special afectată de consecințele aberației cromozomiale. Astfel, punctele de control majore și, în consecință, procesele care au loc în mod specific în linia germinală ar putea fi alterate de dezechilibrul cromozomial, și anume, dezvoltarea sistemului de celule stem primordiale și spermatogonice (PGC, SSC). După cum s-a menționat anterior, studiile in vitro au arătat că celulele germinale nediferențiate aneuploide au murit atunci când au fost izolate din gonadele embrionare și numai cele cu un cariotip corectat aleatoriu au supraviețuit în cultură (Hunt et al., 1998; Mroz et al., 1999). Astfel, SSC-urile cu un cariotip aberant trebuie să fi intrat într-o cale implicită în timpul fazei intrauterine, dar cel mai târziu în perioada perinatală. Atunci când numai celulele germinale cu un cariotip corectat supraviețuiesc in vitro după ce au fost izolate din gonada embrionară, în timp ce celulele germinale aberante au murit în timp, se pune întrebarea de ce – în vivo – pierderea celulelor germinale progresează postnatal, așa cum s-a demonstrat recent (Werler et al., 2014). Chiar dacă câteva celule germinale aberante sunt încă prezente în testiculul perinatal, o anumită proporție dintre cele prezente la momentul nașterii ar trebui să aibă un cariotip corect, iar populația de celule spermatogonice ar trebui cel puțin să rămână stabilă, dacă nu se propagă. Pornind de la această observație parțial contradictorie și acceptând ipoteza cea mai plauzibilă conform căreia corecția prin propulsie aleatorie explică supraviețuirea unei populații reduse de celule germinale primordiale (PGC; Mroz et al., 1999; Sciurano et al., 2009) și, ulterior, de gonocite în perioada postnatală, unii dintre acești supraviețuitori și-ar putea pierde proprietățile de celule stem încă înainte de naștere. Aparent, acestea se pierd în timpul diferențierii peripuberale, în timp ce foarte puține pot supraviețui ocazional, exprimă corect toți markerii relevanți și conduc focare de spermatogeneză. Evaluarea sistematică a modificărilor fenotipice în timpul dezvoltării in utero este, în sine, posibilă doar într-un model de șoarece.

Deranjarea axei HPG, care cauzează hipogonadismul hipergonadotropic frecvent întâlnit la pacienții cu KS, împreună cu numărul crescut de celule Leydig sugerat în biopsiile testiculare, a condus la ipoteza că funcția și/sau maturarea celulelor Leydig ar putea fi afectate de dezechilibrul cromozomial sexual. Celulele Leydig sunt steroidogene, fiind sursa testosteronului care este esențial pentru dezvoltarea fenotipului masculin sănătos și crucial pentru continuarea și finalizarea spermatogenezei normale.

Ca și în cazul celorlalte fațete ale KS, factorul restrictiv pentru orice investigație aprofundată este accesul limitat la țesutul testicular. Odată cu disponibilitatea șoarecilor masculi 41,XXY*, studiile asupra celulelor Leydig de la masculi cu un cromozom X supranumerar au devenit fezabile de investigat. Utilizând acest model, am confirmat prezența hiperplaziei celulelor Leydig, așa cum a fost determinată prin microscopie stereologică, și am constatat, de asemenea, că nivelurile de ITT au fost similare cu cele de la șoarecii de control (Wistuba et al., 2010). Acest lucru a fost surprinzător, având în vedere nivelurile scăzute de T seric observate atât la pacienții cu KS, cât și la șoarecii 41,XXY* (Lanfranco et al., 2004; Smyth și Bremner, 1998; Wistuba, 2010). În concordanță cu nivelurile scăzute de T circulant a fost constatarea că, odată ce celulele Leydig din modelul KS au fost scoase din mediul testicular, cultivate in vitro și normalizate pentru numărul de celule, funcția lor a fost într-adevăr alterată. Cu toate acestea, nu a fost afectată, așa cum s-ar fi crezut la început, ci hiperactivată. Atunci când au fost analizate profilurile de expresie ARNm ale genelor marker Tsp2 (trombospondină 2: o proteină matricelulară de origine fetală care este exprimată predominant în celulele Leydig juvenile), Rlf (factor asemănător relaxinei: marker al celulelor Leydig mature), Est (estrogen sulfotransferaza: marker al celulelor Leydig mature) și LHR (receptor LH: investigat pentru corelația cu experimentele de stimulare a celulelor Leydig, a se vedea mai târziu) au fost determinate, celulele Leydig XXY* izolate au prezentat un profil de expresie ARNm matur și o activitate transcripțională semnificativ mai mare în comparație cu controalele (Wistuba et al., 2010; O’Shaughnessy și colab., 2002). Analiza expresiei genice a evidențiat o creștere generală a expresiei genelor specifice celulelor Leydig XXY*, Est fiind exprimată de aproximativ 20 de ori, Rlf de 8 ori, Tsp2 de 5 ori și LHR de 3 ori mai mult decât celulele Leydig de tip sălbatic. Stimularea in vitro a celulelor Leydig XXY* a indicat un receptor LH matur, care a răspuns chiar mai puternic la stimularea cu gonadotropină corionică umană (hCG, un surogat pentru LH) decât celulele de control. Mai mult, activitatea steroidogenică a celulelor Leydig XXY* a fost ridicată, în sensul că s-a produs mai mult T pe celulă ca răspuns la hCG.

Aceste rezultate interesante nu numai că duc la un nou concept privind originea hipogonadismului hipergonadotropic, dar demonstrează, de asemenea, validitatea modelului de șoarece KS, cu consecințele sale translaționale directe pentru înțelegerea noastră a pacienților cu KS. Rezultatele modelului de șoarece indică faptul că funcția celulelor Leydig nu este afectată în sine, sugerând că alți factori din mediul testicular sunt responsabili pentru endocrinologia androgenică perturbată observată la pacienții cu KS. În special, deoarece am putut confirma, de asemenea, la pacienți, că valorile ITT nu au fost diferite de cele ale controalelor (Tüttelmann et al., 2014). Este posibil ca arhitectura testiculară modificată asociată cu această afecțiune să împiedice transportul endocrinelor în circulație, o propunere care a fost susținută de constatările conform cărora pacienții cu KS prezintă, de asemenea, un diametru diminuat al vaselor de sânge (Foresta et al., 2012). Ținând cont de acest lucru, ne-am propus să găsim o posibilă explicație „vasculară” pentru lipsa eliberării de T în fluxul sanguin testicular. În biopsiile de testicule de la pacienți, analiza fiabilă a vaselor nu este, totuși, posibilă din cauza prejudecății rezultate din tehnica de disecție care necesită evitarea vaselor de sânge mai mari pentru a preveni sângerarea. În consecință, constituția vaselor de sânge a fost evaluată în secțiuni de testicule întregi de la șoareci masculi adulți 41,XXY* și 40,XY*. Într-adevăr, raportul vase de sânge/suprafață testiculară, corectând testiculele mai mici ale șoarecilor XXY*, a fost semnificativ mai mic la acești șoareci în comparație cu martorii XY*. În concluzie, producția de T testiculară nu pare să fie afectată la bărbații cu KS. Datele din modelul de șoarece ne permit să speculăm că o aprovizionare vasculară redusă ar putea fi implicată în eliberarea mai mică de T în fluxul sanguin.