În acest studiu, pentru a înțelege rolul căii IRE1a-XBP1, strategia noastră de bază a fost de a utiliza un model de diferențiere Th2 in vitro (Fig. 1b). Celulele T helper naive au fost activate prin activarea TCR în plăci acoperite cu anti-CD3e/CD28 în condiții de diferențiere Th2 timp de 72 de ore, s-au odihnit timp de 42 de ore și au fost restimulate prin activarea TCR folosind plăci acoperite cu anti-CD3e/CD28. Pentru a perturba calea IRE1a-XBP1, am utilizat un medicament bine stabilit 4μ8c care blochează în mod specific calea prin inhibarea activității de endonuclează IRE1a . Medicamentul a fost adăugat în mediile de cultură la o concentrație de 15μM la începutul culturii și în timpul trecerii de la placa de activare la placa de repaus. Alegerea concentrației de medicament a fost determinată de cea mai mare eficiență de inhibare a IRE1a cu cea mai mică toxicitate celulară (Fișier suplimentar 1: Figura S1). Am comparat transcriptomii limfocitelor Th2 naive și restimulate (tratate cu medicamente și netratate) prin secvențiere ARN, am identificat locurile de legare a factorului de transcripție XBP1 în Th2 reactivate prin ChIPmentation (secvențiere ChIP) și am integrat datele la nivelul genomului pentru a prezice țintele directe și rolul lor de reglementare.

Celele T helper activează calea IRE1a-XBP1 în timpul activării in vitro

Celele T helper activate și diferențiate secretă o abundență de citokine. Prin urmare, o mașinărie secretorie bine dezvoltată este o condiție prealabilă pentru ca celulele să se adapteze la acest stres secretor. Pentru a prezice implicarea căii ER-stress/UPR în timpul activării celulelor T helper, am comparat transcriptomul celulelor Th2 naive și diferențiate (Th2 restimulate). Genele exprimate diferențiat, așa cum au fost obținute în urma acestei comparații, au fost integrate în calea KEGG „Protein Processing in the Endoplasmic Reticulum” pentru a vizualiza componentele care sunt reglementate în sus sau în jos. Analiza arată că, atunci când celulele T helper naive sunt activate și diferențiate în celule Th2, acestea cresc expresia genelor implicate în calea stresului ER (Fișier suplimentar 1: Figura S2). Mai mulți factori care au fost caracterizați anterior ca fiind controlori ai replierii și secreției proteinelor, inclusiv XBP1 însuși, sunt supraregulați în timpul diferențierii celulelor T helper.

Pentru a valida această predicție și pentru a investiga în mod specific implicarea căii IRE1a-XBP1, am măsurat expresia ARNm și a proteinei IRE1a în limfocitele Th2 diferențiate și reactivate in vitro (Fig. 1b). Celulele au fost analizate prin qPCR și Western blot pentru a compara ARNm și, respectiv, proteinele. Am constatat că atât nivelul ARNm, cât și cel al proteinelor au fost crescute în celulele T helper activate (Fig. 1c, panoul din stânga și din mijloc). Se știe că fosforilarea lui IRE1a denotă starea sa funcțională. Am observat că proteina este fosforilată în limfocitele Th2 activate (Fig. 1c, panoul din dreapta). Această fosfo-IRE1a crescută poate fi explicată prin sinteza crescută a proteinei, deși nu putem exclude posibilitatea unei activități kinazice crescute și a autofosforilării. Analiza densitometrică a benzii Western blot sugerează că ambele mecanisme, creșterea sintezei proteice și creșterea fosforilării, sunt implicate. Upreglementarea proteinei a crescut de trei ori, dar fosfoproteina a crescut de 4,5 ori (Fig. 1c).

IRE1a activată îmbină ARNm XBP1 (XBP1u) neîmpărțit și produce o izoformă de ARNm XBP1 (XBP1s) îmbinată. Am observat creșteri ale formei splitate a XBP1 (XBP1s), atât la nivelul ARNm, cât și la nivelul proteinelor, în urma activării celulelor T helper (Fig. 1d, e). Tunicamicina a fost utilizată ca un control pozitiv. Acesta este un medicament care inhibă glicozilarea legată de N și, prin urmare, provoacă acumularea de proteine desfășurate (de exemplu, stresul reticulului endoplasmatic (ER)) și crește XBP1s prin creșterea activității IRE1a. Inhibarea specifică a activității endonucleazei IRE1a prin tratarea celulelor cu 4μ8c a abolit atât ARNm cât și izoformele proteice ale XBP1s, confirmând faptul că formarea formei splitate a fost dependentă de activitatea IRE1a (Fig. 1d, e).

Aceste rezultate confirmă faptul că calea IRE1a-XBP1 este conservată în limfocitele Th2 și este crescută în timpul activării in vitro a celulelor T helper. În continuare, ne-am propus să investigăm dacă acest lucru este valabil și in vivo.

Celulele T helper activate in vivo reglează pozitiv calea IRE1a-XBP1

Pentru a testa dacă calea IRE1a-XBP1 este operațională în celulele T CD4+ in vivo, am infectat șoareci C57BL/6 cu parazitul helmintic Nippostrongylus brasiliensis, un model bine stabilit de răspuns imunitar determinat de Th2 . După 7 zile post-infecție, am analizat expresia proteinei XBP1s în celulele T helper prin citometrie de flux. Am constatat că celulele T helper de la șoarecii infectați cu viermi exprimă semnificativ mai mult XBP1s în comparație cu șoarecii de control neinfectați, sugerând o suprareglementare a căii (Fig. 2).

Aceste rezultate confirmă faptul că această cale este activă in vivo. Prin urmare, ne-am propus să disecăm calea folosind abordări la nivel genomic în limfocitele Th2.

Analiza transcriptomică la nivel genomic a expresiei diferențiale a genelor relevă genele reglate de IRE1a-XBP1

Pentru a surprinde un rol global de reglementare genetică a căii IRE1a-XBP1, am comparat celulele Th2 activate in vitro cu celulele cu activitate inhibată a endonucleazei IRE1a prin adăugarea de 4μ8c în mediile de cultură celulară. Apoi am comparat transcriptomii limfocitelor Th2 activate cu sau fără inhibarea căii IRE1a-XBP1. Transcriptomii celulelor Th2 tratate cu 4μ8c și netratate au fost obținuți prin secvențiere ARNm (RNA-seq). Controlul calității datelor de secvențiere ARN este prezentat în fișierul suplimentar 1: Figura S3. Comparând transcriptomii limfocitelor Th2 naive și activate, am constatat că 10995 gene au fost reglementate diferențiat la activarea Th2. Inhibarea căii IRE1a-XBP1 prin tratamentul cu 4μ8c a dus la exprimarea diferențiată a 3144 de gene în comparație cu controlul Th2 netratat (Fig. 3a, Fișier suplimentar 1: Figura S3 panoul din dreapta). Două mii șase sute șaptezeci dintre aceste gene au fost implicate în diferențierea Th2 (Fig. 3a). Gruparea ierarhică a genelor relevă grupurile de gene reglementate în sus și în jos la tratamentul cu 4μ8c (Fișier suplimentar 1: Figura S3, dreapta). Examinarea detaliată a acestor gene a evidențiat faptul că multe dintre ele sunt asociate cu răspunsul proteic desfășurat și cu stresul ER, indicând un impact major al căii IRE1a-XBP1 (Fig. 3b) asupra acestor procese biologice. Lista completă a genelor exprimate diferențiat poate fi găsită în Fișierul suplimentar 2: Tabelul S1. Analiza Gene Ontology (GO) a acestor gene exprimate diferențiat în urma tratamentului cu 4μ8c la celulele Th2 (adică genele reglementate de calea IRE1a-XBP1) a arătat că acestea sunt îmbogățite în următoarele procese biologice: „Răspuns la stresul ER” (GO:0006950), „Reglarea transducției semnalelor” (GO:0009966), „Producția de citokine” (GO:0001816), „Proliferarea celulară” (GO:0008283), „Ciclul celular” (GO:0007049) și Răspunsul imunitar (GO:0006955) (Fig. 3c). Aceste modificări ale modelelor de expresie genetică la inhibarea IRE1a sugerează o implicare extinsă a factorului de transcripție XBP1 în activarea și proliferarea Th2, precum și în diferențiere. Prin urmare, ne-am propus să găsim modelele de ocupare a cromatinei la nivelul întregului genom ale factorului de transcripție XBP1.

ChIPmentarea XBP1 dezvăluie genele țintă directe ale XBP1 în celulele Th2

Pentru a identifica gradul de ocupare a cromatinei de către XBP1 la nivelul întregului genom, am efectuat ChIPmentation, o metodă recent dezvoltată care s-a dovedit a fi mai rapidă, mai sensibilă și mai robustă decât abordările ChIP-seq tradiționale , utilizând un anticorp de calitate ChIP împotriva XBP1. Pentru ChIP-ul XBP1 au fost utilizate celule Th2 diferențiate in vitro și reactivate. Au fost efectuate două replici biologice independente. Am obținut 19,3 milioane și, respectiv, 22,4 milioane de lecturi pair-end pentru fiecare replică. Utilizând MACS2 cu o valoare q mai mică de 0,01 și o îmbogățire de peste 5 ori, am identificat 9031 și, respectiv, 7662 vârfuri, în cele două replici. Analiza de suprapunere cu ajutorul bedtools a sugerat că 5892 de vârfuri erau prezente în ambele replici. Prin urmare, ne-am concentrat doar pe aceste 5892 de vârfuri pentru analiza în aval.

Așa cum era de așteptat, au fost identificate vârfuri de legare în jurul regiunilor promotoare în genele țintă cunoscute ale XBP1, cum ar fi Hspa5, care codifică proteina BiP a chaperonului ER, cunoscută și sub numele de Grp78; un eveniment de legare a fost, de asemenea, observat în jurul promotorului lui XBP1 însuși (Fig. 4a), indicând o potențială autoreglare a XBP1. Pentru a afla caracteristicile genomice asociate cu situsurile de legare XBP1, am comparat locația vârfului său cu genele RefSeq folosind HOMER . Majoritatea vârfurilor de legare a XBP1 au fost localizate în cadrul promotorului (definit ca fiind în amonte de 1000 bp și în aval de 500 bp în raport cu site-urile de pornire a transcripției adnotate) (36%) și în regiunile intronice (35%), iar evenimentul de legare intergenică distală (25%) a fost, de asemenea, observat frecvent (Fig. 4b). Distribuția genomică a vârfurilor XBP1 indică faptul că acesta se leagă atât de promotori, cât și de potențiali intensificatori.

Pentru a caracteriza în continuare regulomul XBP1, am efectuat descoperirea de novo a motivelor folosind HOMER pentru a identifica motivele ADN îmbogățite în cadrul regiunilor de legare a XBP1. Motivul de top identificat este secvența consensuală GCCACGT, care este aproape identică cu motivul de legare a XBP1 uman definit în liniile celulare de cancer de sân (Fig. 4c) . Acest lucru indică specificități de legare foarte conservate ale XBP1 între om și șoarece și între tipurile de celule. Motivul de top îmbogățit în datele noastre pentru șoareci seamănă, de asemenea, cu motivul XBP1 din baza de date JASPAR , susținând din nou calitatea ridicată a datelor noastre de ChIPmentare. Al doilea motiv cel mai îmbogățit este motivul de legare NF-Y (Fișier suplimentar 1: Figura S4C). În mod interesant, motivul NF-Y a fost găsit frecvent în jurul regiunilor promotoare ale genelor ciclului celular, în special gene implicate în reglarea ciclului celular G2/M . Atât motivul XBP1, cât și motivul NF-Y coexistă în jurul unui subset de 258 de vârfuri de legare XBP1 (Fig. 4d), indicând o potențială cooperare între factorii de transcripție XBP1 și NF-Y pentru a regla un subset de gene țintă. Lista genelor țintă care sunt potențial coreglate de XBP1 și NF-Y este afișată în fișierul suplimentar 3: Tabelul S2, iar lista completă a țintelor XBP1 este, de asemenea, furnizată în fișierul suplimentar 3: Tabelul S2. Primele cinci motive îmbogățite sunt afișate în fișierul suplimentar 1: Figura S4C. Pentru a investiga funcțiile genelor legate de XBP1, am folosit GREAT pentru a caracteriza vârfurile de legare a XBP1. Majoritatea termenilor GO semnificativi sunt legați de plierea proteinelor și de stresul ER (Fig. 4e), ceea ce este în concordanță cu rolul biologic cunoscut al XBP1.

În ansamblu, experimentele de ChIPmentation prezic un rol al XBP1 în creșterea pliajului și secreției de proteine, precum și în activarea limfocitelor Th2.

Integrarea datelor transcriptomice și a datelor ChIP-seq pentru a desluși rețeaua de reglementare a genelor controlate de XBP1

Pentru a dezvălui genele țintă directe reglementate de XBP1 și rețeaua sa de reglementare transcripțională, am integrat datele transcriptomice la nivel de genom și datele ChIPmentation. O genă țintă directă este definită de expresia sa diferențială la inhibarea IRE1a (adică tratamentul cu 4μ8c) și de ocuparea factorului de transcripție XBP1 la nivelul locusului genei. Am găsit 1143 de gene țintă directă în Th2, dintre care 122 de ținte au fost raportate anterior ca fiind ținte directe ale XBP1 în alte tipuri de celule (de exemplu, mușchi, celule β pancreatice și celule plasmatice) (Fig. 5a). În acest context, 1021 gene pot fi considerate ca fiind specifice Th2. Acțiunea XBP1 asupra țintelor sale directe nu are o direcție definită, conținând gene up- și downregulate. Primele 38 de gene care urmează oricare dintre aceste modele sunt prezentate în Fig. 5b, iar lista completă poate fi găsită în Fișierul suplimentar 4: Tabelul S3. Cele mai semnificative procese și căi biologice identificate sunt legate de plierea proteinelor și de stresul ER (Fișierul suplimentar 1: Figura S5), care sunt în concordanță cu rolurile sale biologice cunoscute și includ, de asemenea, noi ținte specifice Th2.

În ciuda preponderenței rolului XBP1 în controlul acestei căi, se constată că sunt implicați și alți factori de transcripție. Pentru a examina cascada de reglementare care urmează reglementării XBP1, am construit o rețea de reglementare transcripțională prin extragerea factorilor de transcripție adnotați cu vârfuri ChIP-seq de promotor sau exonic/intronic (Fig. 5c). Lista completă a factorilor de transcripție poate fi găsită în fișierul suplimentar 5: Tabelul S4. Această rețea a fost completată în continuare prin adăugarea de gene exprimate diferențiat care au interacțiuni adnotate cu factorii de transcripție țintă în baza de date STRING (Fișier suplimentar 6: Tabelul S5).

Factorii de transcripție care sunt direct reglați de XBP1 pot fi clasificați în trei categorii funcționale largi implicate în următoarele: rezolvarea stresului ER de secreție a proteinelor, reglarea ciclului celular și a proliferării și controlul funcției celulelor imune efectoare. Factorii de transcripție implicați în stresul ER sunt susceptibili de a facilita secreția de citokine în limfocitele Th2. Această predicție se bazează pe rapoartele anterioare din celulele secretoare, cum ar fi celulele acinare pancreatice și celulele plasmatice. S-a demonstrat că acești factori de transcripție, și anume Bhlha15, Atf3, Atf6, Atf6b, Atf4 și Creb3l2, sunt implicați în adaptarea ER la stresul secretor.

Scopul proliferării celulare și al factorilor de transcripție legați de ciclul celular ar putea fi acela de a facilita expansiunea rapidă controlată a celulelor Th2 activate. Factorii legați de răspunsul imunitar sunt probabil implicați în diferențierea Th2 și în producția de citokine. Prin urmare, am dorit să testăm efectul downreglementării XBP1s în secreția de citokine, proliferarea celulară și producția de citokine.

Calea IRE1a-XBP1 controlează secreția de citokine în celulele T helper

Compararea la nivel de genom a genelor reglate de XBP1s prezice că factorul este implicat în secreția de citokine. Pentru a valida această predicție, am blocat activitatea endonucleazei IRE1a în celulele Th2 și am analizat supernatantul de cultură celulară pentru a cuantifica nivelul IL4 prin ELISA. Am selectat IL4 ca citokină candidată testabilă, deoarece ARNm și proteina sa sunt neschimbate prin downreglementarea XBP1 (Fișierul suplimentar 1: Figura S6A panoul din stânga, Fig. 6 panoul din stânga și panoul din mijloc al rândului de sus). Am constatat că secreția de IL4 este inhibată în mod semnificativ în celulele tratate cu 4μ8c (Fig. 6, panoul din dreapta din rândul de sus). După cum era de așteptat, acest rezultat susține implicarea căii IRE1a-XBP1 în facilitarea secreției de citokine în celulele Th2, așa cum s-a prezis. Inhibarea căii în timpul fazei de restimulare nu are niciun efect inhibitor semnificativ asupra secreției de IL4 (Fișier suplimentar 1: Figura S6B). Acest rezultat sugerează că XBP1s este necesară în timpul diferențierii Th2, posibil pentru dezvoltarea unei mașinării secretorii eficiente.

CaleaIRE1a-XBP1 este necesară pentru exprimarea și secreția de citokine în limfocitele Th2. Celulele T helper naive au fost cultivate după condiția de activare Th2 în prezența inhibitorului IRE1a 4μ8c timp de 3 zile, s-au odihnit timp de 2 zile, au fost reactivate prin placă acoperită și au fost analizate prin citometrie în flux pentru a detecta expresia citokinelor intracelulare IL4, IL5 și IL13. Profilurile FACS reprezentative sunt afișate în primele două coloane. Expresia citokinei intracelulare este comparată în coloana 3, cu trei până la șapte replici biologice independente. Coloana a patra: supernatantele de cultură celulară de la Th2 tratată cu 4μ8c sau tratată cu DMSO au fost analizate prin ELISA pentru a măsura concentrația de citokine. FACS gating: limfocite > singlete > celule vii > citokine

Calea IRE1a-XBP1 controlează expresia citokinelor IL13 și IL5

IL5 și IL13 sunt două citokine de tip 2 proeminente care sunt implicate în eozinofilie, alergii și infecții helmintice. Am constatat că inhibarea căii IRE1a-XBP1 suprimă în mod semnificativ expresia proteinelor IL5 și IL13 și secreția acestora în mediul de cultură (Fig. 6 panourile din dreapta din rândul de mijloc și de jos). Analiza bioinformatică a transcriptomului Th2 prezice că calea IRE1a-XBP1 controlează în mod pozitiv expresia genelor IL5 și IL13, deoarece ambele gene au fost identificate ca gene exprimate diferențiat în urma inhibării IRE1a (Fișier suplimentar 2: Tabelul S1). Am validat această predicție prin analiza expresiei genice mediată de RT-qPCR (Fișier suplimentar 1: Figura S6A, panoul din mijloc și din dreapta) și prin citometrie în flux (Fig. 6). Aceste rezultate sugerează o implicare transcripțională a căii care reglează IL5 și IL13. În mod notabil, nivelurile ARNm și proteice ale IL4 nu sunt afectate, indicând o reglare specifică a IL5 și IL13.

CaleaIRE1a-XBP1 facilitează proliferarea celulelor T helper dependente de activare

Rata de proliferare celulară este un rezultat al interacțiunii dintre regulatorii pozitivi și negativi. Am observat că genele care codifică atât regulatorii pozitivi, cât și cei negativi ai genelor de proliferare celulară sunt exprimate diferențiat atunci când calea IRE1a-XBP1 a fost blocată de 4μ8c (Fig. 7a, panoul din stânga, Fișierul suplimentar 7: Tabelul S6), dintre care multe gene s-au dovedit a fi ținte directe ale XBP1 (Fig. 7a, panoul din dreapta, Fișierul suplimentar 8: Tabelul S7). Această observație prezice o modificare a ratei de proliferare la inhibarea IRE1a. Prin urmare, am fost interesați să verificăm efectul inhibării IRE1a-XBP1 asupra proliferării celulare. Am efectuat un test de proliferare celulară folosind celule Th2. Celulele T CD4+ splenice naive au fost marcate cu CellTrace violet și activate în condiții de diferențiere Th2 în prezența sau absența 4μ8c. Dezintegrarea colorantului fluorescent a fost monitorizată prin citometrie în flux. Am constatat că downreglementarea XBP1s inhibă semnificativ proliferarea celulară (Fig. 7b), dar nu induce moartea celulară (Fișier suplimentar 1: Figura S7).

Proliferarea celulelor T helper este asociată cu diferențierea și producția de citokine. Expresia redusă a IL5 și IL13 (Fig. 6) ar putea fi potențial explicată prin faptul că proliferarea celulară este întârziată. Cu toate acestea, în cazul în care proliferarea redusă a fost motivul principal al lipsei de secreție, producția de IL4 ar fi, de asemenea, inhibată. Cu toate acestea, nu am observat nicio modificare semnificativă a expresiei IL4 la inhibarea IRE1a (Fig. 6, Fișier suplimentar 1: Figura S6A). Pentru a examina în continuare această discrepanță, am efectuat teste de proliferare celulară utilizând linii de șoareci reporteri IL13-GFP și IL4-GFP. În celulele Th2 care exprimă IL4-GFP, am observat o inhibare a producției de IL4 în primele câteva generații de diviziune celulară până la 72 h după tratamentul cu 4μ8c (Fișier suplimentar 1: Figura S8). Dar la 96 h, diferența de expresie a IL4 devine nesemnificativă, indiferent de generația de diviziune celulară în care se află celulele. Această observație sugerează că întârzierea proliferării datorată inhibării IRE1a nu este suficientă pentru a inhiba expresia IL4. În schimb, în cazul IL13-GFP, am observat scăderea expresiei IL13 încă de la prima generație și aceasta continuă de-a lungul generațiilor ulterioare (Fișier suplimentar 1: Figura S9).

InhibareaIRE1a întârzie progresia ciclului celular prin faza S și G2/M

Analiza bioinformatică a genelor exprimate diferențiat (Th2 vs. Th2 tratat cu 4μ8c) și a genelor țintă directă a XBP1 relevă mai multe gene care sunt implicate în controlul progresiei ciclului celular prin diferite etape (de ex, G1, S, G2/M) au fost grupate în două grupe suprareglementate sau subreglementate (Fig. 8a). Am luat genele exprimate diferențiat în Th2 tratate cu 4μ8c în comparație cu Th2 netratate (valoare p ajustată < 0,05) (Fig. 8a, stânga, Fișier suplimentar 9: Tabelul S8) și genele exprimate diferențiat genele țintă directă XBP1 (Fig. 8a, dreapta, Fișier suplimentar 10: Tabelul S9), și am verificat rolurile cunoscute în diferite etape distincte ale ciclului celular utilizând fie o listă curată manual pe baza datelor RNA-seq, fie o bază de date publicată . Am constatat că multe gene din toate etapele ciclului celular (adică G1, S și G2/M) au fost afectate. Pentru a identifica etapele ciclului celular reglementate de calea IRE1a-XBP1, am creat și utilizat o tulpină de șoareci transgenici FUCCI (indicator fluorescent al ciclului celular cu ubiquitină) care exprimă proteina Cdt1 marcată cu mCherry și proteina Geminin marcată cu mVenus. Tulpina este similară cu cea utilizată în . Celulele G1 sunt mCherry+ mVenus- (Q3; Fig. 8b), celulele G1-S sunt mCherry+ mVenus+ (Q2; Fig. 8b) și SG2M sunt mCherry- mVenus+ (Q1; Fig. 8b), în timp ce celulele în mitoză și care intră în G1 sunt mCherry- mVenus- (Q4; Fig. 8b). Am comparat profilurile ciclului celular ale celulelor Th2 tratate cu vehicul și cu 4μ8c în timpul activării celulelor T. Am constatat că celulele s-au acumulat în faza S și/sau G2/M atunci când calea IRE1a-XBP1 este blocată (Fig. 8b). Rezultate similare au fost obținute într-o abordare diferită, utilizând testul de încorporare BrdU cu colorare DAPI (Fișier suplimentar 1: Figura S10).

Expresia transgenică a XBP1s completează inhibarea mediată de 4μ8c a activității endonucleazei IRE1a

Pentru a testa dacă fenotipurile observate la tratamentul cu 4μ8c se datorează pierderii XBP1s, am efectuat teste de completare prin transducția unui vector de expresie XBP1s în celulele Th2 in vitro. Vectorul a codificat forma splicată a XBP1 (XBP1s), a cărei funcție este independentă de funcția IRE1a. Am constatat că expresia ectopică stabilă a XBP1s anulează efectul tratamentului cu 4μ8c și că nu există nicio modificare semnificativă a transcriptomului la tratamentul cu 4μ8c atunci când celulele Th2 supraexprimă XBP1s (Fișier suplimentar 1: Figura S11A). Celulele Th2 care supraexprimă XBP1s proliferează și se diferențiază în mod normal în prezența 4μ8c (Fișier suplimentar 1: Figura S11B și, respectiv, S11C). Aceste rezultate sugerează cu tărie că fenotipurile observate la tratamentul cu 4μ8c se datorează pierderii XBP1s.

.