Xylulose
3.06.4.1.1 Levedura Saccharomyces
Estudos recentes mostraram que a levedura Saccharomyces pode fermentar xilulose para etanol, embora não de forma eficiente. Assim, teoricamente, a levedura Saccharomyces só carece da(s) enzima(s) para converter a xilose em xilulose. Como descrito acima, as bactérias convertem a xilose em xilulose com uma única enzima que não necessita de cofactores (Figura 3). Em contraste, o sistema xilose para xilulose com levedura requereu duas enzimas que não são metabolicamente ideais, como descrito acima. Inicialmente, quase 10 laboratórios diferentes em todo o mundo tentaram clonar um gene de xilose isomerase bacteriana em leveduras. Ho et al. na Universidade Purdue foram o primeiro grupo a realizar a clonagem do gene da xilose isomerase da Escherichia coli. Entretanto, a proteína sintetizada na levedura pelo gene da bactéria clonada não tinha atividade da xilose isomerase.
Uma segunda abordagem foi clonar os genes XR e XD da P. stipitis na levedura Saccharomyces. Entretanto, a cinética dessas enzimas e o equilíbrio termodinâmico da reação favorecem a produção de xilitol ao invés de etanol. No início dos anos 90, três grupos (Kotter, Ciriacy e colegas da Universidade de Dusseldorf, Tantirungkij e colegas da Universidade de Osaka, e Hahn-Hägerdal e colegas da Universidade de Lund) relataram o sucesso da clonagem dos genes XR e XD na levedura Saccharomyces para torná-la capaz de fermentar a xilose. Entretanto, a levedura recombinante desenvolvida por esses grupos fermentou a xilose extremamente lentamente e produziu pouco etanol; o principal produto metabólico foi xilitol.
O grupo Ho formulou a hipótese de que a superexpressão da xilulokinase nativa (XK) junto com XR e XD de P. stipitis melhoraria o fluxo da xilose através do metabolismo para o etanol, diminuindo a concentração intracelular de xilulose. Como a xilulokinase catalisa uma reação irreversível em direção à produção de etanol (Figura 3), a alta atividade da xilulokinase resultará em baixas concentrações de xilulose. Isto é desejável porque o equilíbrio da reação catalisada por XD favorece o xilitol, e baixas concentrações de xilulose em estado estacionário são necessárias para direcionar o fluxo metabólico na direção da produção de etanol. Além disso, a clonagem destes três genes permitiu controlar a sua expressão na célula. Sob o sistema de controle de expressão nativa da célula, sua expressão é induzida pela presença de xilose e é inibida pela glicose. A levedura recombinante resultante poderia ser capaz de co-ferenciar glicose e xilose simultaneamente ao etanol sem o longo período de defasagem entre a fermentação da glicose e xilose, o que seria extremamente desejável para a produção industrial de etanol.
Em 1989, o grupo Ho na Purdue relatou pela primeira vez a clonagem do gene xilulokinase da levedura Saccharomyces. Posteriormente, o grupo Ho substituiu as sequências de DNA a montante dos genes estruturais XR, XD e XK por sequências a montante dos genes glicolíticos contendo promotores constituintes eficazes. Os genes XR, XD e XK resultantes foram clonados em um plasmídeo de alto número de cópias 2μ e o plasmídeo resultante, pLNH32, foi utilizado para transformar uma cepa de levedura Saccharomyces industrial do tipo selvagem conhecida por ser superior para a produção de etanol utilizando o amido (glucose) como matéria-prima. Em 1993, o mesmo grupo relatou o sucesso do desenvolvimento da levedura recombinante Saccharomyces 1400 (pLNH32) que poderia fermentar altas concentrações de xilose quase completamente em etanol com muito pouco xilitol como subproduto. Além disso, a levedura resultante poderia co-fermentar glicose e xilose ao etanol sem muito intervalo entre a fermentação desses dois açúcares, embora a taxa de fermentação da xilose seja mais lenta do que a da glicose (Figura 4). Posteriormente, foram relatados os detalhes da construção e desenvolvimento do 1400 (pLNH 32). Desde então, o grupo Ho tem continuado a melhorar a levedura com várias abordagens inovadoras como descrito abaixo.
Figure 4. (Esquerda) Saccharomyces cepa de levedura 1400 transformada com o plasmídeo pai do pLNH32 contendo ou não XR, XD ou XK ou contendo apenas XR e XD, mas não XK, usada para fermentar uma mistura de glicose e xilose. (direita) 1400 levedura transformada com plasmídeo pLNH32, contendo genes XR, XD e XK clonados. A levedura foi utilizada para fermentar glicose e xilose sob condições idênticas aos resultados descritos na figura à esquerda. Os genes clonados nestes plasmídeos foram modificados e construídos de forma idêntica como descrito na referência 9.
O 2 μ plasmídeo, pLNH32, contendo o gene clonado XR-XD-XK é um plasmídeo hospedeiro amplo, projetado para ser capaz de transformar qualquer cepa de levedura Saccharomyces, incluindo levedura Saccharomyces do tipo selvagem industrial. Este plasmídeo pode ser utilizado para peneirar melhores hospedeiros para a produção de etanol celulósico. O grupo Ho também desenvolveu uma nova técnica única de integração de genes facilitando a integração efetiva de múltiplos genes no cromossomo da levedura em múltiplas cópias. Esta técnica é fácil de realizar e quase garante que os genes clonados no plasmídeo de integração e transformados em células de levedura hospedeira possam ser integrados no genoma hospedeiro em tantas cópias quantas se deseje para proporcionar as melhores atividades (Figura 5). Esta técnica de integração foi utilizada para desenvolver a estirpe estável de xilose 1400 (LNH-ST), integrando primeiro os genes XR-XD-XK como um cassete no cromossoma da levedura em cópias suficientes até que a levedura resultante fermente a xilose com a maior eficiência (Figura 6). A melhor cepa atual desenvolvida pelo grupo Ho, 424A (LNH-ST), foi triada a partir de 10 cepas diferentes de levedura Saccharomyces, transformando primeiro cada cepa com o plasmídeo 2 μ pLNH32 para garantir que estas cepas fossem capazes de fermentar xilose, bem como co-fermentar glicose/xilose efetivamente na presença do pLNH32, seguido pela integração dos genes nos cromossomos das cepas de levedura selecionadas para desenvolver a “levedura estável” por esta nova técnica de integração. A co-fermentação da glicose/xilose por 424A (LNH-ST) é mostrada na Figura 7.
Figure 5. Demonstração da integração gradual de múltiplas cópias dos genes XR-XD-XK nos cromossomos da cepa de levedura Saccharomyces 259, pelo método descrito em Ho et al. . Leveduras em diferentes estágios de integração foram utilizadas para fermentar glicose e xilose sob condições idênticas para demonstrar o progresso da integração destes genes: a) no estágio inicial de integração, b) 25% de conclusão, c) 50-75% de conclusão, d) após a conclusão da integração. A conclusão da integração é refletida pelas células do processo de integração produzindo os mesmos resultados de fermentação por um período de tempo suficientemente longo.
Figure 6. Co-fermentação da glicose e xilose com 1400 (LNH-ST) contendo múltiplas cópias dos genes XR-XD-XK integrados nos cromossomos de levedura pelo método de Ho et al. .
Figure 7. Co-fermentação da glicose e xilose com 424A (LNH-ST) cepa recombinante Saccharomyces contendo múltiplas cópias dos genes XR-XD-XK integrados nos cromossomos de levedura da cepa Saccharomyces 424A pelo método de Ho et al. . Esta é a melhor levedura Ho-Purdue desenvolvida na Universidade Purdue antes de 2007 e atualmente sendo fornecida à indústria para a produção de etanol celulósico.
Se um microrganismo recombinante é utilizado para a produção industrial em larga escala, como para a produção de etanol, é necessário integrar os genes a serem clonados nos cromossomos hospedeiros por duas razões chave. Uma é que se os genes clonados forem integrados nos cromossomos hospedeiros por um método confiável, os genes clonados podem ser mantidos no cromossomo hospedeiro sem a necessidade do uso de produtos químicos especiais, meios, antibióticos e aditivos. A exigência de produtos químicos ou antibióticos para manter as características não só acrescenta o custo dos produtos químicos, mas também acrescenta o custo e a dificuldade no processo de aprovação regulamentar e de limpeza de quaisquer efluentes. Mesmo na presença de um agente seletivo, plasmídeos de alto número de cópias, como o pLNH32, usados para clonar os genes nas células hospedeiras podem não ser capazes de sustentar operações industriais em larga escala. O grupo Ho mostrou que a levedura estável desenvolvida usando o novo sistema de integração, 1400 (LNH-ST), foi capaz de sustentar a fermentação contínua de hidrolisados de milho para etanol em uma planta piloto, enquanto a mesma cepa de levedura contendo o plasmídeo, 1400 (pLNH32), foi incapaz de fazê-lo.
A cepa 424A (LNH-ST) e outras cepas estáveis, 1400 (LNH-ST) e 259 (LNH-ST), desenvolvidas pela nova técnica de integração, foram todas validadas por outras e provaram ser sustentáveis e eficazes para a produção de etanol celulósico com hidrolisados de diferentes matérias-primas lignocelulósicas. A cepa 424A (LNH-ST) também tem sido utilizada industrialmente para a produção de etanol celulósico a partir de resíduos agrícolas em uma planta de demonstração desde 2004.
A levedura recombinante desenvolvida por Hahn-Hägerdal tem sido amplamente melhorada pela clonagem de diferentes genes adicionais, incluindo a clonagem do gene xilulokinase depois que o grupo Ho na Universidade Purdue demonstrou que a expressão aumentada deste gene nativo melhora a produção de etanol a partir da xilose .
A levedura desenvolvida pelo grupo Ho na Purdue está disponível para a produção de etanol celulósico industrial. Ele provavelmente terá uma boa chance de sucesso, já que é uma levedura industrial produtora de etanol, e tem sido testada extensivamente. Recentemente, o grupo Purdue tem continuado a melhorar a cepa, tornando-a co-fermenta arabinose com os outros quatro açúcares (glicose, xilose, manose e galactose), e tornando-a mais resistente ao etanol e ao ácido acético.
Embora a tentativa inicial de desenvolver uma levedura xilo-isomérica Saccharomyces xilo-fermentante à base de isômeros de xilose não tenha sido bem sucedida e uma levedura xilo-fermentante eficaz à base de XR/XD tenha sido desenvolvida, o interesse no desenvolvimento de uma levedura xilo-isomérica à base de isômeros de xilose tem continuado ao longo dos anos, em parte, porque este caminho não tem um desequilíbrio redox. Em 2009, Brat et al. construíram S. cerevisiae xilose-fermentante utilizando a isomerase xilose de Closteidium phytofermentans. Também em 2009, Cargill relatou o desenvolvimento de uma cepa de levedura não-Saccharomyces expressando xilose isomerase e capaz de fermentar eficientemente uma mistura de glicose e xilose a pH baixo e na presença de 1% de ácido acético.
A arabinose está presente apenas em pequenas quantidades na biomassa de gramíneas como parte da hemicelulose GAX, algumas fontes especiais de biomassa como a fibra de milho contêm quantidades relativamente grandes de arabinose. No entanto, é ideal ter os micróbios produtores de etanol celulósico capazes de fermentar as cinco diferentes moléculas de açúcar presentes na biomassa celulósica, já que a reciclagem de fluxos de processo dentro de um processo industrial pode aumentar a concentração de componentes menores .
O mecanismo do metabolismo da arabinose em microrganismos é tão complicado quanto o metabolismo da xilose. Novamente, o mecanismo do metabolismo da arabinose em leveduras é diferente das bactérias. Semelhante ao metabolismo da xilose, o mecanismo metabólico da levedura não favorece o metabolismo anaeróbico. Recentemente, Hahn-Hägerdal e seus colegas de trabalho têm desenvolvido mais recentemente sua levedura Saccharomyces xilose para co-ferenciar a arabinose com xilose e outros açúcares pela via fúngica l-arabinose. Contudo, a levedura de engenharia resultante ainda não foi capaz de fermentar arabinose em uma quantidade significativa de etanol, mas foi capaz de converter uma pequena quantidade de arabinose em arabitol.