Abstract

Wnt5a está envolvida na activação de várias vias de sinalização não canónica de Wnt, que podem inibir ou activar a via de sinalização canónica de Wnt/β-catenin de uma forma dependente do contexto receptor. A sinalização de Wnt5a é fundamental para regular os processos normais de desenvolvimento, incluindo a auto-renovação de células-tronco, proliferação, diferenciação, migração, adesão e polaridade. Além disso, a ativação ou inibição aberrante da sinalização de Wnt5a está emergindo como um evento importante na progressão do câncer, exercendo efeitos oncogênicos e supressores do tumor. Estudos recentes mostram o envolvimento da sinalização de Wnt5a na regulação da auto-renovação normal e das células estaminais cancerígenas, na proliferação de células cancerígenas, na migração e na invasão. Neste artigo, revisamos descobertas recentes sobre os mecanismos moleculares e papéis da sinalização de Wnt5a nas células-tronco na embriogênese e na mama ou ovário normal ou neoplásico, destacando que o Wnt5a pode ter efeitos diferentes sobre as células-alvo dependendo dos receptores de superfície expressos pela célula alvo.

1. Introdução

Células-tronco, incluindo células-tronco embrionárias e células-tronco identificadas em tecidos adultos, têm uma capacidade de auto-renovação e de gerar uma progênie mais diferenciada. A célula estaminal embrionária é derivada da massa celular interna do blastocisto, é pluripotente e, portanto, pode gerar todos os tecidos do corpo. As células-tronco em tecidos adultos residem em nichos especializados, onde integram vários inputs de sinalização ambiental e intrínseca que determinam o destino celular e mantêm a homeostase dos tecidos.

Os fatores de não-renovação são um grupo destas moléculas de sinalização que atuam sobre as células-tronco dentro do nicho de células-tronco para ajudar a manter sua capacidade de auto-renovação. Sabe-se que os factores de Wnt se ligam a diferentes receptores para transduzir a via de sinalização canónica ou não canónica que regulam diversas actividades biológicas. A via de sinalização canónica de Wnt é iniciada quando os factores Wnt se ligam aos receptores familiares Frizzled (Fzd) e aos receptores de proteína 5/6 lipoproteínas de baixa densidade (LRP5/6) para formar complexos. Isto resulta no recrutamento de Axin e dishevelled (Dvl) para a membrana plasmática e disrupção do complexo de degradação β-catenin, levando ao acúmulo de β-catenin no citoplasma, que então transloca para o núcleo, onde se liga ao fator de célula T (TCF)/fator realçador de linfóides (LEF) e ativa a transcrição dos genes alvo canônicos de Wnt. Em contraste, vários fatores Wnt ativam caminhos independentes do β (caminhos de sinalização não canônicos de Wnt), conhecidos como caminho Wnt-Ca2+ ou caminho da polaridade das células planas (PCP), que agem para direcionar a migração celular durante a embriogênese .

Nineteen secreted cysteine-rich Wnt family glycoproteins have been identified in mice and humans. Durante a embriogênese precoce de mamíferos ou a manutenção da homeostase de tecidos adultos, esses fatores Wnt e seus receptores são dinamicamente expressos para ativar a sinalização apropriada, para garantir o equilíbrio certo entre proliferação e diferenciação. Perturbação da sinalização de Wnt com expressão aberrante dos fatores Wnt, seus receptores, ou moléculas de sinalização a jusante podem levar ao desenvolvimento de vários cancros humanos . Como a capacidade de iniciação tumoral parece estar restrita a uma pequena população de células tumorais que são dotadas da capacidade de auto-renovação e diferenciação, elas são frequentemente referidas como células-tronco cancerígenas (CSCs, ou células de iniciação tumoral). Mais importante ainda, a biologia das células-tronco embrionárias, células-tronco normais e CSCs está altamente inter-relacionada. Isto é evidente pelo fato de que sinais moleculares (por exemplo, sinalização de Wnt) que definem e mantêm células-tronco embrionárias ou células-tronco normais adultas são frequentemente aberrantemente ativadas em células tumorais.

Um dos principais focos desta revisão é o papel da sinalização de Wnt5a através de diferentes receptores de superfície na regulação das células-tronco na embriogênese e na mama ou ovário normal ou neoplásico, já que já existem várias excelentes revisões que cobrem aspectos da sinalização de Wnt no câncer de cólon . Resumimos os últimos avanços nas vias de sinalização que são ativadas pelo Wnt5a e que constituem um enigma para o desenho racional de drogas destinadas a esgotar os CSCs (ou células de iniciação tumoral) dentro dos tumores, poupando a função dos tecidos normais.

2. Wnt5a Signaling Pathway

Wnt5a é um ligante não-canônico de Wnt que é conservado evolutivamente e desempenha um papel importante no desenvolvimento. Ratos homozigotos Wnt5a nocturnos têm letalidade perinatal devido a defeitos de desenvolvimento. Estudos anteriores mostraram que o Wnt5a pode interagir com Fzd2 e receptor de tirosina como o receptor órfão 2 (ROR2) para ativar Rac1 em um caminho independente do β. Mais recentemente, demonstramos que o Wnt5a induziu a heterooligermização do receptor de tirosina tipo receptor órfão 1/2 (ROR1/ROR2), que recrutou e ativou fatores de troca de guanina (GEFs), que por sua vez ativaram RhoA e Rac1, respectivamente, aumentando a quimiotaxia das células leucêmicas e a proliferação . Por outro lado, como outra ação do Wnt5a, competiu com o Wnt3a pela ligação a Fzd2, inibindo assim a fosforilação LRP6 dependente de Wnt3a e o acúmulo de Wnt3a em células intactas, inibindo a capacidade do Wnt3a de induzir o acúmulo de β-catenin, inibindo assim a sinalização de Wnt3a dependente de β-catenin.

No entanto, Wnt5a também poderia activar a via dependente de β-catenin e induzir a formação de eixos secundários em embriões Xenopus que coexpressavam o receptor Fzd5 . Posteriormente, outro estudo descobriu que Wnt5a poderia inibir a sinalização canônica Wnt/β-catenin em células que expressavam ROR2, mas também poderia induzir a sinalização canônica Wnt/β-catenin em células que expressavam Fzd4 e LRP5 . Assim, um único ligante Wnt5a pode ter efeitos díspares nas células, dependendo da disponibilidade do receptor. Portanto, o contexto celular dita o efeito do Wnt5a. Isto pode levar à observação de que o Wnt5a poderia exercer efeitos oncogênicos ou supressores tumorais em diferentes cancros .

3. Sinalização do Wnt5a em células-tronco embrionárias

O caminho do Wnt (desencadeado pelo Wnt3a, Wnt5a, ou Wnt6) também poderia estar envolvido na manutenção a curto prazo da pluripotência tanto de células ES do rato como de células ES humanas . A primeira evidência para isso foi fornecida por um estudo de um inibidor farmacológico do glicogênio sintetase quinase-3 (GSK3) que poderia modular a atividade do GSK3, levando à ativação da sinalização canônica de β-catenin e ao aumento da estabilidade do c-Myc . Wnt5a e Wnt6 posteriormente foram encontrados como sendo produzidos por células alimentadoras de fibroblastos embrionários, o que poderia inibir a diferenciação das células ES do rato de uma forma sérica dependente do soro. A ativação direta da β-catenin, usando constitutivamente ativa β-catenin (S33Y) sem perturbar os componentes a montante da Wnt/β-catenin, recapitulou totalmente o efeito do Wnts sobre as células ES. É importante notar que o Wnt5a também é um potente inibidor da fosforilação da β-catenin, estabilizando assim a β-catenin . Estes dados sugerem que o Wnt5a sinaliza para estabilizar a β-catenin para ativar ainda mais a sinalização canônica Wnt/β-catenin em células ES de camundongos. Finalmente, a via Wnt/β-catenin pode upregular o mRNA para STAT3, um conhecido regulador da auto-renovação das células ES, sugerindo um mecanismo molecular pelo qual a via Wnt/β-catenin atua para prevenir a diferenciação das células ES através da convergência na via LIF/JAK-STAT ao nível do STAT3 . Entretanto, quais receptores de superfície estão envolvidos na ativação da sinalização de Wnt5a/β-catenin em células ES e se a sinalização não-canônica de Wnt5a também poderia ser ativada por Wnt5a em células ES permanece obscura.

4. Wnt5a Sinalização em células-tronco em glândula mamária normal e tecido ovariano

Uma linha de evidência suporta a importância de Wnt na manutenção de células-tronco mamárias na glândula mamária. Entretanto, Wnt5a não induz a atividade de transativação β-catenin/TCF no tecido da glândula mamária. As células da glândula mamária são hiperproliferativas em ratos knockout Wnt5a, enquanto que na presença de Wnt5a ectópico, a extensão ductal é inibida . Estes fenótipos são o inverso da activação da sinalização canónica de Wnt/β-catenin. Portanto, Wnt5a pode limitar e controlar o crescimento da glândula mamária através da supressão da sinalização de Wnt/β-catenin. É intrigante então que esta inibição do crescimento da glândula mamária não tenha sido observada nas linhagens transgênicas MMTV-Wnt5a .

No germário Drosophila, a sinalização de Wingless alterada (Wg; o homólogo da mosca Wnt) ocorre nas células-tronco da linha germinal dos ovários (GSCs) através da remoção de seus reguladores como desgrenhado, tatu, Axin, e desgrenhado; isto causa a perda de GSC, influencia a proliferação de células foliculares, e induz a diferenciação . A utilização de genes condicionais para Wnt5a nas células granulosas ovarianas (GC) resulta na subfertilidade feminina associada ao aumento da atresia folicular e à diminuição das taxas de ovulação. Outro estudo descobriu que o Wnt5a regula seus genes alvo não por sinalização através da via de polaridade Wnt/Ca2+ ou células planares, mas sim por inibição da via canônica, fazendo com que os níveis da proteína de ligação de elementos responsivos ao Wnt5a e cAMP (CREB) diminuam através de uma via dependente da kinase-3β do glicogênio sintetase nas células de granulosa ovariana (GC). Estes dados indicam que o Wnt5a é necessário para o desenvolvimento normal do folículo ovariano e pode antagonizar a resposta à gonadotropina nas células da granulosa, suprimindo a sinalização canónica Wnt/β-catenin .

Collectivamente, o Wnt5a tem maior probabilidade de suprimir a sinalização de β-catenin nas células estaminais normais da glândula mamária e dos tecidos ovarianos, embora o Wnt5a seja capaz de activar a sinalização de β-catenin nas células estaminais embrionárias. Se esta diferença é devida a receptores que são diferentemente expressos em células estaminais embrionárias versus células estaminais da glândula mamária normal ou o ovário precisa ser mais investigado.

5. Wnt5a Sinalização nas células-tronco do câncer de mama

Os fatores Wnt podem afetar várias células epiteliais mamárias e induzir uma expansão das células-tronco durante a progressão do tumor . Além disso, a expressão aberrante da β-catenina foi associada a cancros mamários basais, tri-negativos e a um mau resultado clínico . A ocorrência de sinais aberrantes de Wnt em subtipos específicos de câncer de mama é menos provável que seja ditada por ativação causada por mutações somáticas. Mutações não foram identificadas na CTNNB1, que codifica β-catenin, e mutações dentro da APC foram identificadas em menos de 20% das amostras de pacientes com câncer de mama . Mais investigação é necessária para determinar quais ligandos e receptores Wnt causam esta aberrante sinalização Wnt/β-catenin.

Recentemente, um estudo sobre células primárias de camundongos MMTV-Wnt1 descobriu que tanto o Wnt3a recombinante como o Wnt5a recombinante poderiam melhorar a formação de mamoas in vitro. A formação de mamoesferas Wnt5a não foi causada por um aumento na sinalização canônica Wnt/β-catenina, mas sim mediada por sinalização não canônica de Wnt que requeria o receptor tirosina quinase ROR2 e a atividade da quinase terminal Jun N, JNK, em células de câncer de mama de camundongo. Isto é consistente com a observação de que pacientes com cânceres de mama que expressam ROR2 tiveram uma sobrevida global significativamente menor do que aqueles com tumores sem expressão de ROR2 . No entanto, o silenciamento da ROR2 nas linhas de células cancerosas da mama humana diminuiu tanto os alvos dependentes de β-catenin como os independentes de β-catenin , sugerindo que a ROR2 pode estar envolvida tanto nas vias de sinalização de Wnt dependentes de β-catenin como nas vias de sinalização de Wnt independentes de β-catenin. A ROR1 predominantemente parece ser expressa por tumores menos bem diferenciados que têm alto potencial de recidiva e metástases e que também expressam marcadores associados à transição epitelial-mesenchimal (TME). Por outro lado, o silencioso ROR1 nas linhas celulares humanas de câncer de mama poderia atenuar a expressão dos genes associados ao EMT e prejudicar sua capacidade de migração/invasão in vitro e seu potencial metastático in vivo . Muito recentemente, Chien et al. relataram que a expressão da ROR1 poderia ser um fator prognóstico adverso independente em pacientes com câncer de mama tri-negativo . Se ROR1 pode ter um efeito semelhante com ROR2 nas células estaminais do cancro da mama e que vias de sinalização são activadas por ROR1 nas células estaminais do cancro da mama permanece desconhecido.

Um estudo num modelo de rato de cancro da mama induzido por ErbB2 encontrou evidências contraditórias sobre o efeito de Wnt5a nas células estaminais humanas do cancro da mama. Durante a tumorigenese mamária induzida por ErbB2, as células iniciadoras do tumor basal (TIC), que exibiram uma maior capacidade tumorigênica em comparação com os progenitores luminosos correspondentes, perderam preferencialmente a expressão Wnt5a, como determinado pela análise de perfil de transcrição. Além disso, a heterozigosidade Wnt5a promoveu multiplicidade tumoral e metástase pulmonar. Como substrato TGFβ, o Wnt5a produzido por células luminais induziu uma alça de alimentação que ativou o SMAD2 de forma RYK- e TGFβR1-dependente para limitar a expansão do TIC basal de forma parácrina, uma explicação potencial para o efeito supressor do Wnt5a sobre a tumorigenese mamária. Neste modelo de mouse, permanece incerto se a sinalização canônica Wnt/β-catenin foi ativada ou se Wnt5a também inibiu a sinalização canônica β-catenin para suprimir a expansão do TIC basal.

O laboratório Weinberg estudou células epiteliais mamárias humanas imortalizadas (mMECs) e descobriu que tanto as vias canônicas quanto as não canônicas do Wnt cooperaram com a sinalização TGFβ não só na manutenção, mas intrigantemente também na indução, das propriedades das células-tronco . Além disso, apenas os ligandos Wnt não canónicos Wnt5a e Wnt16 foram encontrados sem prepreenchimento nas células estaminais em relação às células não estaminais. Portanto, é possível que Wnt5a ou Wnt16 possam activar a via de sinalização canónica ou não canónica de Wnt de forma dependente do contexto receptor nas células estaminais do cancro da mama humana.

6. Wnt5a Sinalização nas células estaminais do cancro do ovário

Similiar ao cancro da mama, o efeito Wnt5a no cancro do ovário também é controverso. Um estudo precoce dos tumores ovarianos primários () que mostraram baixos níveis de Wnt5a no câncer de ovário em relação ao ovário normal é preditivo de um mau resultado. A expressão ectópica de Wnt5a inibe a proliferação da linha de células cancerosas dos ovários humanos OVCAR5 tanto in vitro como in vivo modelos de camundongos com câncer de ovário ortotópico. Mecanicamente, a expressão ectópica de Wnt5a nos antagonismos OVCAR5 antagoniza a sinalização canônica de Wnt/β-catenin e induz a senescência celular ativando a via de senescência do repressor histórico A (HIRA)/ leucemia peripromielocítica (LPM) .

Em contraste, estudos envolvendo um grande número de pacientes constataram que a upregulação de Wnt5a estava associada a um prognóstico relativamente ruim . Em comparação com a freqüência da expressão Wnt1 no câncer ovariano, Wnt5a foi mais freqüentemente encontrado em pacientes com câncer de ovário maligno epitelial (80% de um total de 38) . De notar que as pacientes com cancros ovarianos que expressam níveis elevados de Wnt1 e Wnt5a tiveram uma probabilidade significativamente menor de sobrevivência a longo prazo do que as pacientes com cancros ovarianos que não expressaram Wnt1 ou Wnt5a. Além disso, Wnt5a é prevalente no fluido ascite obtido de mulheres com câncer de ovário, sugerindo que contribui para o microambiente do tumor ovariano. Isto é consistente com a observação de que níveis elevados de Wnt5a estão associados com o aumento do risco de metástases .

Activar as mutações na via canónica do Wnt é raro no cancro dos ovários, com excepção dos cancros dos ovários endometrióides . A contribuição da sinalização canónica de Wnt para a progressão do cancro dos ovários permanece desconhecida. Por outro lado, estudos sobre sinalização não canônica de Wnt/β-catenin mostram que Wnt5a pode regular o câncer de ovário EMT, migração ou metástase através de vias de sinalização não canônica . De acordo com esta noção, estudos recentes descobriram que a expressão de ROR1, um receptor de Wnt5a, foi altamente expressa por cancros ovarianos de alto grau e menos diferenciados e associada a uma sobrevivência relativamente curta e livre de doenças, em comparação com cancros ovarianos que não expressavam ROR1 . Os cancros ovarianos que expressam níveis elevados de ROR1 tinham assinaturas de expressão genética associadas a CSCs ovarianas . Além disso, a expressão das células tumorais da ROR1 aparentemente correlaciona-se com a expressão da ALDH1 e a capacidade de formar esferóides tumorais in vitro (ambos marcadores de CSC). O tratamento das células tumorais primárias do xenoenxerto derivado de ovário (PDX), que expressam níveis elevados de ROR1 com um anti-ROR1 mAb (UC-961 ou cirmtuzumab), inibiu a formação de esferóides e a migração in vitro e o enxerto e re-enxerto em ratos imunodeficientes, indicando que a ROR1 pode influenciar a auto-renovação das células estaminais do câncer ovariano. Outros estudos são necessários para determinar se a Wnt5a é responsável pela influência que a ROR1 aparentemente tem na biologia das células estaminais do câncer de ovário.

7. Observações Conclusivas

Wnt5a pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento de células estaminais embrionárias e órgãos. No entanto, o papel do Wnt5a nas células estaminais cancerígenas é variado e complexo. Ele pode suprimir ou promover a progressão do tumor. Para elucidar os mecanismos moleculares que impulsionam o comportamento celular alterado, é necessária uma pesquisa adicional sobre a expressão específica dos receptores e coreceptores específicos dos tecidos. Em particular, um entendimento mais detalhado da complexa conversa cruzada entre Wnt5a e receptores específicos que são expressos em células-tronco embrionárias e que podem ser reexpressos ou reativados em células-tronco cancerígenas, mas não em tecidos somáticos normais (por exemplo, ROR1 e ROR2), podem permitir o desenvolvimento de inibidores específicos que bloqueiam a sinalização aberrante e, portanto, impactam favoravelmente a sobrevivência do paciente.

Conflitos de interesse

Os autores declaram que não há conflitos de interesse em relação à publicação deste trabalho.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Breast Cancer Research Foundation (NIH Grant P01-CA081534), pelo California Institute for Regenerative Medicine, pela National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant no. 2016YFC009159), e pela Science and Technology Foundation of Shenzhen, China (Shenzhen Peacock Innovation Team Project, Grant no. KQTD20140630100658078).