Para fazer a ponte entre a grande distância evolutiva entre os vertebrados existentes e a data ancestral com um genoma não duplicado, Sacerdot e colegas reconstruíram primeiro o genoma amniote ancestral. Para isso, primeiro aplicaram o algoritmo AGORA (Algoritmo para Reconstrução da Ordem dos Genes em Ancestrais) que tinham desenvolvido anteriormente às ordens genéticas, orientações e árvores genealógicas de 61 genomas de animais extintos da base de dados Ensembl. Estes incluíam 40 mamíferos, 3 aves, 2 répteis, 1 anfíbio, 8 teleósteos, 1 celacanto, 2 tunicados, 1 nemátodo e 1 mosca. Infelizmente, Ensembl não inclui o genoma de nenhum peixe cartilaginoso (por exemplo, o tubarão elefante, Callorhinchus milii, uma quimera, que tem o genoma de vertebrados de evolução mais lenta conhecido), ou os de hemicordatos, equinodermes ou cefalocordatos – deuterostomos invertebrados cujos genomas não sofreram a considerável perda genética e compactação característica dos genomas sintonizados.

Sacerdot et al. identificaram então os pares de genes ohnolog putativos neste genoma amniote ancestral e produziram conjuntos de Regiões Ancestrais Contíguas (CARs). Os ohnologs são genes homólogos dentro de uma espécie resultante de WGDs. Finalmente, eles agruparam estes CARs em um conjunto de 51 que caíram significativamente em 17 grupos de quatro, ou tetrads; o resultado esperado de duas rodadas de WGD. Para distinguir o padrão de fusões cromossômicas e fissões durante a evolução, eles queriam comparar essas 17 tetrads com a organização dos genes em um genoma pré-vertebrado não duplicado. No entanto, os genomas sintonizados estão evoluindo muito rapidamente e são bastante divergentes daqueles de outros deuterostomas invertebrados, enquanto que a montagem do genoma publicado do cefalocordate Branchiostoma floridae é excessivamente fragmentada para a análise. Portanto, os autores compararam seus 17 tétrades de CAR com os 17 grupos ancestrais de ligação de corda previamente determinados por comparação da síntese de genes em cromossomos humanos e em andaimes do genoma B. floridae. Notavelmente, cada um destes grupos de ligação de coratas correlacionou-se com um tétrade de CAR predominante. Eles concluíram desta comparação que o genoma do vertebrado ancestral tinha 17 cromossomos que depois se duplicaram em 34 cromossomos através de uma rodada de WGD (1R). Posteriormente, houve 7 fusões cromossômicas resultando em 27 cromossomos, que na origem dos vertebrados, antes da divisão do agnatã/gnatostoma, se duplicaram novamente (2R WGD) em 54 cromossomos. Após o 2R WGD, houve quatro fusões adicionais antes do vertebrado ósseo ancestral seguido de uma quinta fusão antes da base dos amniotes. Assim, o cariótipo ancestral dos vertebrados ósseos incluía 50 cromossomos e o amniote ancestral tinha 49 cromossomos (Fig. 1b).

Além de reconstruir duplicações, fusões e fissões de cromossomos durante a evolução, o algoritmo AGORA pode calcular as ordens gênicas nos cromossomos do hipotético ancestral amniote comparando as ordens gênicas nos cromossomos de seus descendentes existentes. Este genoma amniote ancestral reconstruído contém 80% dos 15.854 genes dos CARs. A distribuição desigual desses genes nos 49 cromossomos do amniote ancestral poderia refletir a realidade ou, alternativamente, a dificuldade de reconstruir a ordem dos genes nos cromossomos que sofreram considerável rearranjo genético durante a evolução.

Even, portanto, duas coisas se destacam na análise. A primeira é que a comparação do genoma amniote ancestral com os CARs agrupados em 17 tetrads com os super-esqueletos do conjunto genético da lampreia (Petromyzon marinus) mostra um padrão claro de 1 a 4, consistente com 2R WGD antes da divisão agnathan/gnathostome. Isto está em desacordo com os resultados de Smith et al. que encontraram fortes evidências de apenas 1R WGD na lampreia quando comparado com a galinha. Esta discrepância poderia ser explicada pela inclusão de dados genômicos de mais espécies na reconstrução do hipotético genoma amniote ancestral, um processo que por si só também elimina a confusão dos rearranjos genômicos que ocorreram em vertebrados posteriores ao ancestral amniote. É provável que também seja devido à inclusão de dados filogenéticos para determinar os tétrades CAR, revelando assim ohnologs que divergiram na base da evolução dos vertebrados.

O segundo resultado que se destaca é a correspondência entre a ordem dos genes nos cromossomas humanos e os 17 cromossomas pré-1R. Quando os 17 cromossomos pré-1R são codificados por cores (Fig. 1b) e as cores de cada gene são transferidas para as posições dos 8282 genes humanos que descendem dos genes pré-1R, o padrão de duplicações e translocações do genoma é aparente. Por exemplo, o cromossoma 1 no genoma pré-1R contém genes Hox. Um grande segmento do cromossoma 2 humano contém o cluster HoxD mais muitos outros genes correspondentes aos do cromossoma 1 pré-1R. Os outros 3 clusters de Hox humanos estão localizados nos cromossomos humanos 7, 12 e 17. Além disso, um número substancial de homólogos de outros genes no cromossomo 1 pré-1R está localizado nos cromossomos humanos 1, 3, 10, 16 e 22, indicativo de translocações.