B Photoreceptors

Photoreceptor degenerations are the most common form of blindness in the Western world and involve the loss of vision due to dystrophy and/or death of retinal photoreceptors. Essas patologias podem ser divididas aproximadamente naquelas condições que inicialmente afetam os fotorreceptores de haste, como a retinite pigmentosa (RP), e aquelas que inicialmente afetam os fotorreceptores de cone, como a degeneração macular.141 Embora a degeneração fotorreceptora também possa ser causada indirectamente por defeitos primários no RPE, que desempenha uma função importante na saúde fotorreceptora e homeostase, este tópico será discutido numa secção posterior (ver secção II.C).

Os fotorreceptores são células sensoriais altamente polarizadas que consistem de um segmento interno (SI) que é conectado a um segmento externo (SO) por um cório altamente modificado (Fig. 5).189 Nos fotorreceptores maduros, proteínas que são necessárias para o crescimento e manutenção dos SO fotorreceptores, bem como para fototrandução, são transportadas ao longo de microtubos polarizados do SI basal para o SO apical. Os fotorreceptores são semelhantes às células epiteliais na medida em que suas superfícies são divididas em domínios apicais e basolaterais por junções celulares. Seus centromas estão localizados na superfície apical, enquanto seus núcleos residem basicamente.190 O desenvolvimento adequado e a manutenção subsequente dos fotorreceptores vertebrados dependem do estabelecimento de polaridade apical-basal adequada, bem como da função da maquinaria de transporte. Não é, portanto, surpreendente que dos mais de 100 loci genéticos conhecidos por causar degenerações fotorreceptoras em vertebrados, a maioria afete a estrutura e função do OS.191

Fig. 5. Estrutura dos fotorreceptores de haste e cone. As células fotorreceptoras são compostas por um segmento externo que contém discos de membrana de pigmento visual. O segmento interno é o corpo celular polarizado do fotorreceptor, onde o núcleo reside basicamente e o cório se origina apicalmente e se estende até ao SO. O terminal sináptico forma conexões sinápticas com os interneurônios da retina, retransmitem a entrada visual.161,188

Telas genéticas em zebrafish iluminam as bases moleculares destas funções celulares através do isolamento de mutantes nos quais o desenvolvimento e/ou manutenção do fotorreceptor são defeituosos.24,192,193 Um desses olhos mutantes, o mosaico (moe), foi encontrado contendo características apicais expandidas nos fotorreceptores.20,21 O moe locus codifica um domínio FERM contendo proteína que forma um complexo com proteínas Crumbs, as quais por sua vez se mostraram críticas para a polaridade apical-basal em Drosophila, bem como vertebrados.194-196 Curiosamente, mutações no ortologue humano de Crumbs, CRB1, estão associadas a distrofias fotoreceptoras retinianas como RP 12197 e a amaurose congênita de Leber (LCA1; Ref. 198.199). Outros mutantes zebrafish, tais como nagie oko (nok) e heart and soul (has) não só fenocopy o fenótipo mutante moe, mas as proteínas que codificam (Pals1 e PKCi, respectivamente) também interagem bioquimicamente com Moe.20 Além disso, a derrubada morfolino de crb2b, um paralog de zebrafish Crumbs, resulta na redução do tamanho de SI.14 Estes estudos começaram, portanto, a descobrir o papel do complexo Crumbs no desenvolvimento e doença dos fotorreceptores vertebrados.

A formação da polaridade apical-basal correta depende não apenas da função adequada dos determinantes da polaridade celular, mas também do seu transporte e localização. Os fotorreceptores na retina mutante ale oko (ako) acumulam os determinantes apicais Pals1 e PKCλ em seus corpos celulares e exibem extensa morte fotorreceptora tardia no desenvolvimento.19 O ako locus codifica a subunidade p50 do complexo dinactino, que desempenha um papel importante no transporte de carga ao longo dos microtubos como parte do complexo motor da tina.200 Em outro mutante, o mikre oko (mok), que possui uma mutação na dinactina-1, a degeneração da retina é devida, pelo menos parcialmente, à localização incorreta dos núcleos fotorreceptores. Surpreendentemente, ao contrário dos mutantes ako, determinantes apicais como Crumbs e aPKCλ não são deslocalizados, sugerindo que a degeneração nestes mutantes não é devida à perda de polaridade celular. A deslocalização experimental do núcleo pela superexpressão do motor da disneína resultou na morte da célula fotorreceptora, apoiando o papel da posição nuclear na sobrevivência da fotorreceptora.201 Enquanto os defeitos de posicionamento nuclear nos fotorreceptores mok parecem ter um papel celular autônomo, outros componentes autônomos não-celulares parecem desempenhar um papel na degeneração mok. Análises em mosaico revelaram que os fotorreceptores mutantes apresentam um aumento de 2,5 vezes na sobrevivência quando colocados em um ambiente selvagem.17 Esta descoberta sugere que a saúde e sobrevivência dos fotorreceptores depende de sinais ambientais das células circundantes. Estes achados são consistentes com defeitos associados a algumas degenerações humanas, tais como RP, onde um defeito inicial na rodopsina específica da haste acaba resultando na perda tanto das hastes quanto dos cones.202

Transporte do corpo celular para o SO também é importante para substituir componentes do SO que são perdidos devido à fagocitose contínua do SO fotoreceptor pelo RPE sobrejacente.203 Em fotorreceptores, como em cílios, o transporte ocorre por um processo conhecido como Transporte Intraflagelar (IFT) e mutações nos genes componentes do IFT, tais como ift57, ift80, ift88 e ift172 resultam em atrofia dos SO e/ou perda completa dos SO em zebrafish.24-26 Mutações no gene elipsa, que codifica uma proteína que se pensa facilitar o IFT,35 resultam em perda precoce do fotorreceptor,22 enquanto o morfolino derrubou múltiplas subunidades da dienina 2 retrógrada do IFT motor dynein-2 destacou a importância do IFT no alongamento adequado do SO e na função visual.204 Degenerações fotoreceptoras relacionadas a IFT defeituosas são alguns dos muitos fenótipos relacionados a cílios associados à Síndrome de Bardet-Biedl (BBS)205 e o estudo mais aprofundado da função dos componentes do IFT no zebrafish pode ser fundamental para se obter uma melhor compreensão das causas moleculares subjacentes às patologias oculares relacionadas à BBS.

Embora os mutantes descritos até agora nesta seção tenham sido isolados em telas genéticas utilizando principalmente métodos histológicos para detectar defeitos fotorreceptores, outros foram isolados em telas comportamentais.15,82,206,207 Uma dessas telas tirou vantagem da capacidade do zebrafish de exibir um comportamento dependente da visão logo após 3 dpf (dias após a fertilização). Brockerhoff et al.15 usaram pela primeira vez o ensaio de resposta optocinética (OKR) em embriões mutagenizados para detectar defeitos na função visual. Um segundo ensaio envolveu o uso de gravações de electrooretinograma (ERG) para identificar se as mutações isoladas afectam a função da retina externa. A partir desta tela, 18 mutantes foram isolados que foram determinados como tendo função visual reduzida. Um deles, sem resposta optocinética a (noa), não possuía anormalidades fotorreceptoras brutas a 5 dpf (dias pós fertilização), mas foi encontrado cego, assim como letárgico, e morreu prematuramente. A análise da mutação do noa revelou uma deficiência em uma subunidade do complexo de piruvato desidrogenase (PDH), que regula a produção de energia nas células. A linha de noa mutante tem sido usada como modelo para o estudo da deficiência de PDH (OMIM 245348), um distúrbio humano que, como o modelo zebrafish, resulta em cegueira, defeitos neurológicos e morte precoce.16 Como os tratamentos atuais para a deficiência de PDH em humanos têm resultado em sucesso limitado, Taylor et al. utilizaram noa mutantes para testar uma dieta ketogênica que tem mostrado algum sucesso no alívio dos sintomas de deficiência de PDH em um número limitado de pacientes humanos. A administração desta dieta especial restaurou o comportamento normal em noa mutantes, destacando o potencial do estudo das terapias de deficiência de PDH na linha noa mutante.

Outra mutante, não foi encontrada resposta optocinética f (nof) que possuísse uma mutação na subunidade α de transducina de cone (Tcα), uma proteína G necessária para a fototransdução. Em pacientes humanos que sofrem de uma condição conhecida como acromatopsia (OMIM 139340), as mutações em Tcα estão subjacentes à perda da visão colorida. Em nof mutantes, o desenvolvimento do cone ocorre normalmente; no entanto, eles são até 1000× menos sensíveis à luz, como detectado por registros de fotorreceptores únicos. A análise extensiva das respostas à luz do cone revelou que a fototransdução residual é dependente da luz, mas independente da transducina. Ca+ 2 influxo, que é importante para a adaptação da luz do fotorreceptor e foi previamente pensado para ser controlado pela transducina, ainda era detectável em nof mutantes. Este estudo revelou, portanto, que alguns fluxos de Ca+ 2 em fotorreceptores de cone podem ser independentes da transducina.

Em uma tela separada, mutações dominantes que causam degeneração fotorreceptora em zebrafish adulto foram realizadas a fim de isolar mutantes genéticos que poderiam ser usados posteriormente para estudar a cegueira nocturna hereditária humana como a RP.37,38 No caso da RP, muitos loci genéticos estão subjacentes a este grupo de distúrbios. No entanto, apenas cerca de metade dos casos de RP dominante foram ligados a mutações específicas no momento em que o rastreio foi feito.38 Li et al. portanto rastrearam o zebrafish adulto mutagenizado utilizando uma conhecida resposta de fuga exibida pelos peixes. A falta dessa resposta a um sinal ameaçador foi interpretada como uma perda de visão, que mais tarde foi confirmada usando gravações de ERG. No total, sete mutantes heterozigotos foram isolados (cegueira nocturna a, b, c, d, e, e, e f), dos quais seis apresentaram degeneração fotoreceptor.38,39,208,209 Quatro dos seis foram encontrados como sendo letais embrionários como homozigotos, sugerindo que os genes mutantes subjacentes aos fenótipos fotoreceptor têm outras funções críticas durante o desenvolvimento embrionário. Este achado destaca a importância de tais telas para a identificação de mutações dominantes que podem não ser facilmente isoladas na triagem tradicional devido à letalidade embrionária precoce.