Cavalos. 378 amostras de soro foram obtidas de cavalos domesticados saudáveis de poucos ranchos localizados em quatro distritos. As amostras de soro também foram obtidas de cavalos de corrida (Figura 1).

Humano. Amostras de soro provenientes de 42 pacientes (17 homens e 25 mulheres) do Departamento de Doenças Infecciosas e Neuroinfecções da Universidade Médica de Bialystok. Os pacientes apresentaram sintomas neurológicos característicos de meningite, meningite linfocítica e encefalite transmitida por carrapatos. Eles foram hospitalizados entre maio e setembro de 2010. Todos os pacientes foram testados para anticorpos contra o vírus da encefalite transmitida por carrapatos por Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus, Siemens . As amostras foram preservadas a -20°C.

Todas as amostras examinadas foram duplamente verificadas e testadas sob condições de biossegurança de nível 3+.

ELISA-1. O estudo serológico foi realizado com a competição ELISA ID Screen West Nile Competition (Innovative Diagnostics, Montpelier, França), para detecção de anticorpos do vírus do Nilo Ocidental contra as proteínas pr-E e pr-M envelope contendo um epitópo comum ao vírus da encefalite japonesa, de acordo com o protocolo do fabricante. Todas as amostras foram examinadas duas vezes. As microplacas foram lidas a 450 nm. O ELISA validou quando as rações de ligação residual (S/N%) foram calculadas. As amostras de soro com rações S/N iguais ou inferiores a 40% foram consideradas positivas; as amostras com rações superiores a 50% foram consideradas negativas. Valores de S/N entre 40% e 50% foram duvidosos.

ELISA-2 foi realizado utilizando a Captura de IgM da Tela de Identificação do Nilo Ocidental (Diagnóstico Inovador, Montpelier, França). Os poços foram revestidos com anticorpo policlonal IgM. Quando os resultados positivos foram obtidos, a presença de anticorpos apareceu como solução azul e após a adição a solução de paragem ficou amarela. Na ausência de anticorpos, não apareceu qualquer coloração. As placas foram lidas a 450 nm.

ELISA-3 foi realizado utilizando o ensaio enzimático Ingezim WNV Compac (Ingenasa, Espanha) baseado no ELISA bloqueador, no qual foi utilizado um anticorpo monoclonal (MAb) específico para a proteína E do WNV. Se estavam presentes anticorpos em amostras de soro, estes estavam ligados ao antígeno. Quando a MAb específica da proteína E foi adicionada, ligou-se ao antigénio que não foi bloqueado por anticorpos da amostra sérica. No caso de anticorpos bloqueando o antígeno, o conjugado não o ligou. O ensaio foi lido por uma reacção colorimétrica após a adição do substrato. As amostras foram consideradas como positivas quando os valores de DO eram iguais ou inferiores aos das amostras de soros-controlo positivo. As amostras foram consideradas como negativas quando o valor de DO era igual ou superior ao valor de corte negativo. As amostras com valor de DO no intervalo de ambos os valores foram consideradas duvidosas.

Teste de Micronutralização do Vírus. O teste de microneutralização de vírus com amostras positivas ELISA de aves selvagens foi realizado no Laboratório Europeu de Referência, ANSES, França. Foram utilizadas células Vero e vírus do Nilo Ocidental, estirpe IS-98-ST1, no teste. O teste foi baseado no procedimento padrão da OIE .

3. Resultados

Distritos da Polônia e áreas onde as amostras foram coletadas são mostradas na Figura 1.

A maior parte das amostras foram coletadas das aves durante a designação e os tratamentos veterinários. Algumas das aves estavam no centro de reabilitação após alguns acidentes. As aves não manifestaram quaisquer sintomas de doenças neurológicas e quaisquer sinais de infecções neurológicas. Cada ave foi fornecida pela organização que enviou as amostras com as informações sobre o local, sexo, idade e quando foi possível, sobre o histórico de viagem.

Os exames das amostras de soro revelaram anticorpos específicos de WNV em 63 amostras de aves selvagens: 62 de cegonhas brancas e uma de tentilhão comum. Uma amostra positiva de soro foi obtida de égua.

Amostras de soro humano, 14 das 42 foram positivas e uma foi duvidosa. Todos os pacientes tinham histórico de picadas de mosquitos e carrapatos. A encefalite transmitida por carraças foi diagnosticada em 16 pacientes .

Para confirmar os resultados, ELISA-2 foi realizado para detectar anticorpos séricos específicos de WNV IgM como uma primeira linha de resposta imunitária. Os resultados foram negativos e portanto não confirmaram a presença de anticorpos IgM ou qualquer evidência de infecção recente dos animais.

Para verificar os resultados obtidos pelo ELISA-1, o ELISA-3 foi realizado, e a presença de anticorpos específicos de WNV foi confirmada nestes casos. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

Para confirmação dos resultados positivos, as amostras de soro positivo das aves foram testadas novamente através do teste de microneutralização do vírus. Todas as 63 amostras de soro de aves selvagens foram confirmadas e identificadas como positivas para anticorpos WNV com o título 10 em 60 amostras e o título 30 em três amostras. Em relação aos exames de outros membros do JECV, as amostras também foram negativas para o vírus Usutu. Não foram observadas reacções de reactividade cruzada.

Comparação dos resultados obtidos por diferentes métodos de diagnóstico (ELISAs e testes de microneutralização do vírus) é apresentada na Tabela 1.

4. Discussão

Durante os últimos anos, notou-se que o WNV se espalha nos países de clima moderado. mosquitos da família Culicidae são o vector mais comum de propagação do vírus e hoje em dia seis das espécies de mosquitos existem na zona climática polaca. Nos anos 90 do século passado, Juřicová et al. usando o ensaio de inibição da hemaglutinação confirmaram anticorpos contra o WNV em 12,1% dos pardais domésticos (Passer domesticus) e em 2,8% dos pardais de árvores eurasiáticas (Passer montanus) na área florestal de Campinas, na Polônia. Nos anos seguintes, anticorpos contra o WNV foram encontrados em três cegonhas, um corvo (Corvus corone cornix) e um cisne mudo (Cygnus olor) na outra parte da Polônia .

Realizamos três ELISAs diferentes para apresentar e então confirmar os resultados obtidos. O primeiro ELISA foi o Concurso Tela de Identificação do Nilo Ocidental, teste específico para WNV, mas também dá reações serológicas cruzadas entre os membros do JECV. Quando foram obtidos resultados positivos, foi realizado o teste ELISA-2 de Captura de IgM do Nilo Ocidental, que é específico apenas para WNV e permite excluir reações cruzadas, mas detecta apenas IgM. Isso significa que podemos identificar apenas infecções recentes e não podemos detectar anticorpos IgG. O ELISA-3 foi utilizado para confirmar os resultados obtidos pelo ELISA-1 e os resultados foram confirmados em 100% dos casos.

No nosso estudo, os resultados positivos com amostras de soro de aves selvagens obtidos pelo ELISAs foram confirmados pelo teste de microneutralização do vírus. Além disso, o ELISA mostrou anticorpos de WNV em 14 das 42 amostras séricas de pacientes com sintomas de meningite, meningite linfocítica e encefalite transmitida por carrapatos, mas não conseguimos verificar os resultados obtidos com o teste de neutralização de redução de placa (PRNT). A infecção por WNV em humanos e a identificação de WNV no líquido cefalorraquidiano foram geralmente confirmadas por RT-PCR, Nested PCR, ou em tecidos humanos fixados em formol e incluídos em parafina por RT-PCR. De acordo com o estudo de Czupryna et al. , todas as amostras de líquido cefalorraquidiano de 24 pacientes hospitalizados no Departamento de Doenças Infecciosas e Neuroinfecções, Universidade Médica de Bialystok, foram negativas para o RNA do VNI.

amostras de soro de humanos, aves e cavalos foram usadas como amostras adequadas para determinar anticorpos específicos para o VNI. Se confirmássemos os anticorpos específicos em amostras de soro, o animal ou humano era considerado como tendo contato com o vírus (na Polônia ou fora do país). Supõe-se que aves selvagens positivas poderiam ter contato com o vírus fora do país. Em relação às amostras positivas de humanos, 11 pacientes nunca deixaram o país; isso significa que tiveram de ter o contacto com o vírus já na Polónia. O mesmo ocorre com os cavalos, que, de acordo com seu histórico de viagem, nunca deixaram o país.

Na base da situação epidemiológica na Europa, o papel das aves silvestres na transmissão do WNV e os resultados de exames serológicos anteriores de humanos e aves indicam que a presença do WNV na Polônia pode ser possível. Na Polônia, anticorpos contra o WNV foram detectados em mulheres febris e em trabalhadores florestais saudáveis de regiões de Swietokrzyskie (28,85%) e Podlaskie (34,14%) . Nossos resultados serológicos podem sugerir que o vírus já está presente em nossa zona climática e em nosso ecossistema. A possibilidade da sua reacção cruzada com vírus de encefalite transmitida por carraças e doença endémica deve ser tomada em consideração.

Aprovação Ética

O estudo foi aprovado pela II Comissão de Ética local em Lublin (número 92/2010 de 16 de novembro de 2010) e obteve a permissão do Diretor Geral de Proteção Ambiental (número DOP-OZGŁZ. 6401.03.36.2011.dł).

Conflito de Interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

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Confirmações

Os autores gostariam de agradecer o apoio financeiro fornecido por um projecto de trabalho de enquadramento P/020, Free Living Water Birds as a Reservoir and the Vector during the Expansion of Viral Diseases, e pelo projecto de trabalho de enquadramento W/211, Development Diagnostic Methods and Risk Evaluation of the Occurrence of West Nile Infection in Birds in Poland (2014-2018).