Introdução

Uma técnica de microscópio onde toda a amostra é exposta à luz é conhecida como imagem de ‘widefield’. A contrapartida ao widefield é confocal, onde são usados pinholes para bloquear a maior parte da luz de e para a amostra. Este artigo irá discutir as imagens de widefield e as técnicas de widefield mais utilizadas em microscopia.

Microscópios de widefield

Em widefield, a amostra inteira é iluminada por uma fonte de luz de lâmpada, seja de baixo (um microscópio vertical) ou de cima (um microscópio invertido). Os microscópios verticais são frequentemente utilizados com amostras fixas como células ou tecidos que foram tratados e montados em lâminas de microscópio, enquanto que os microscópios invertidos são frequentemente melhores para a imagem de uma amostra imersa em líquido, uma vez que normalmente afundaria até ao fundo e seria mais fácil de ver de baixo com as lentes do microscópio. Isto permite o imageamento de células em suspensão, uma vez que as células estudadas nas ciências da vida são tipicamente aderentes (crescem presas a uma superfície) ou crescem em suspensão (células suspensas em líquido). Exemplos de um microscópio vertical e invertido podem ser vistos na Fig.1.

Microscópios de grande rendimento usam tipicamente uma fonte de luz branca (como uma lâmpada) é suficiente com alguns filtros para o trabalho de fluorescência. Isso também torna a imagem mais simples e os tamanhos dos arquivos de imagem menores, facilitando o trabalho com aplicações como documentação celular.

Técnicas de amplo campo

Exemplos de técnicas de microscopia de amplo campo são brightfield, contraste de interferência diferencial (DIC), contraste de fase e fluorescência de amplo campo.

Microscopia de campo brilhante é uma forma acessível de microscopia, onde uma amostra inteira é iluminada por uma luz brilhante. Esta abordagem envolve pouca preparação de amostras e pode ser usada para verificar rápida e facilmente as células vivas ou para produzir dados suplementares. No entanto, o uso de um agente de contraste é altamente recomendado, pois a maioria das amostras de células é transparente e será difícil de resolver sem uma mancha ou corante. As células são em sua maioria água e quando imitadas em vidro ou plástico transparente, pode ser difícil escolher estruturas menores sem algum contraste adicional.

Para contraste de interferência diferencial (DIC), a amostra é iluminada pela luz dividida em dois feixes de luz polarizados, quando esses feixes recombinam as diferenças no deslocamento de fase aparecem como contraste na imagem final. Da mesma forma que o contraste de fase, esta técnica não é adequada para amostras mais espessas e requer uma configuração mais técnica do que outras técnicas.

Microscopia de contraste de fase fornece melhor contraste do que o campo brilhante, usando luz dispersa da amostra. Ao iluminar a amostra com um anel de luz e tendo outro anel em frente ao visor do microscópio, partes da amostra que dispersam a luz de forma diferente aparecem como mais escuras ou mais claras na imagem, dando-lhe mais contraste do que a microscopia padrão de campo brilhante. Este contraste melhorado não é visto em amostras mais espessas, pois produz artefatos, mas funciona bem com culturas celulares. Um exemplo destes anéis pode ser visto na Fig.2.

Microscopia de fluorescência de grande rendimento é semelhante ao campo brilhante mas são utilizados comprimentos de onda de luz específicos para excitar moléculas fluorescentes com as quais a amostra foi pré-tratada (embora algumas amostras sejam naturalmente autofluorescentes). As amostras podem ser coradas com marcadores fluorescentes para proteínas ou componentes celulares específicos, e então a luz de emissão de fluorescência desses marcadores forma uma imagem. O sinal de fluorescência significa que há melhor contraste em comparação com outras técnicas, uma vez que ao usar comprimentos de onda de luz específicos apenas as moléculas fluorescentes estão a emitir luz, ao contrário de toda a imagem a ser iluminada. Entretanto, como toda a amostra é iluminada usando esta luz, os sinais fluorescentes de fora da área de visualização podem causar fluorescência de fundo e imagens desfocadas.

Out-Of-Focus Light

A principal desvantagem é que, como toda a amostra é iluminada, enquanto o plano focal recebe luz e pode gerar uma imagem, os planos acima e abaixo do plano focal também recebem luz, resultando em luz desfocada causando degradação da imagem. Especialmente para a excitação da fluorescência, a resolução de um sistema de campo amplo é limitada à fluorescência de fundo também sendo captada pela câmera e diminuindo a relação sinal/ruído.

Determinadas técnicas de campo amplo evitam este problema, como a microscopia de iluminação estruturada (SIM), que utiliza padrões de luz para gerar um padrão complexo, a imagem baseada na interferência do padrão permite níveis de super-resolução de detalhes, resolvendo objetos tão pequenos quanto 200 nm. Mais sobre o SIM pode ser lido na nota SIM em nosso site.

Sumário

As imagens de amplo rendimento são a base da maioria dos estudos celulares, permitindo que os pesquisadores possam rápida e facilmente imaginar amostras com baixos níveis de preparação de amostras ou conhecimentos técnicos necessários. Desde imagens de campo brilhante até fluorescência, a widefield é uma técnica poderosa e variada com a qual muitos pesquisadores estão familiarizados. Embora a técnica possa não ter resolução quando comparada a aplicações confocais ou outras aplicações avançadas de microscopia, a imagem de campo amplo tem um lugar firme na pesquisa e continuará a se desenvolver ao longo do tempo.