Transformação dos herbicidas por Fungos de Papagaio Branco

Está bem documentado que uma grande variedade de poluentes, incluindo pesticidas, são transformados e degradados pela WRF: pentaclorofenóis, isoproturão, derivado de isoxaflutol, atrazina, simazina, propazina, lindano, atrazina, diurão, terbutilazina, metalaxil, DDT, dieldrina, aldrina, heptacloro, clordano, etc. . Esta lista pode ser expandida dada a forte evidência do potencial de degradação do WRF para diferentes classes de poluentes. Os dados sobre a degradação de herbicidas por WRF estão resumidos parcialmente na Tabela 2. Deve ser mencionado que um grande número de trabalhos foi realizado usando condições estacionárias em meios líquidos e condições de fermentação de sistemas sólidos. Entretanto, existem dados contraditórios sobre o nível de degradação do herbicida, papel das enzimas ligninolíticas neste procedimento, e mecanismo de degradação também.

Fungoseveracionais, tais como Agrocybe semiorbicularis, Auricularia auricula, Coriolus versicolor, Dichomitus squalens, Flammulina velupites, Hypholoma fasciculare, Pleurotus ostreatus, Phanerochaete velutina, e Stereum hirsutum mostraram a capacidade de degradar vários herbicidas como atrazina, diuron e terbuthylazine com diferentes eficiências . Coriolus versicolor, Hypholoma fasciculare e Stereum hirsutum degradaram mais de 86% de diuron, atrazina e terbuthylazine em 6 semanas. Eles também foram os mais ativos na produção de enzimas ligninolíticas. Entretanto, a capacidade da WRF de degradar herbicidas aromáticos, diurônio, atrazina e terbutilazina, não se correlacionou com sua atividade ligninolítica determinada no teste de descoloração Poly R-478 (que é usado como um indicador da atividade ligninolítica). A possível explicação destes resultados foi a diferença nos padrões de LME produzidos por fungos em culturas líquidas. Interessante que sob ensaios de campo a estirpe S. hirsutum mais eficaz foi inativa na degradação herbicida e as outras estirpes C. versicolor e H. fasciculare demonstraram 30% de degradação do cloropirifos em 6 semanas .

Fanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor converteram até 35-40% de diketonitrilo (um produto de transformação do solo do herbicida isoxaflutol) em ácido benzóico analógico inativo após 15 dias sob condições estacionárias em meio líquido . O nível de enzimas ligninolíticas, como as lacas, produzidas durante a fermentação pareciam estar correlacionadas com a degradação do herbicida, confirmando o papel dessas enzimas nos processos de degradação. Entretanto, os autores sublinharam que a indução da produção de laccase seis vezes via adição de 2,5-xilidina não levou a qualquer aumento significativo da clivagem do diketonitrilo.

Foi demonstrado que o Coriolus hirsutus, Cerrena maxima, Coriolopsis fulvocinerea e Coriolus hirsutus/Cerrena maxima co-cultivados podem degradar a atrazina sob cultivo submerso; a remoção do herbicida foi de 77-91% após 40 dias de cultivo. É interessante mencionar que quantidades insignificantes de atrazina foram absorvidas pelo micélio. A atividade da laccase foi bastante elevada, permitindo a proposta de participação da laccase na degradação da atrazina por estes fungos. Esta hipótese foi apoiada pelo estudo da degradação da atrazina na presença de indutores de laccase (guayacol e syringaldezine) em cultivo submerso. A eficiência da degradação do herbicida foi maior em culturas induzidas em 78-98% e o maior nível de remoção de atrazina foi alcançado para Coriolopsis fulvocinerea usando guaiacol como indutor.

Hiratsuka et al. relataram que Coriolus versicolor IFO 30340 degradou 30% de cloronitrofeno (CNP) e 80% de nitrofeno (NIP) após 12 dias de cultivo sob condições estacionárias em meio líquido. A taxa de degradação do herbicida dependia da concentração de nitrogênio na mídia e era maior sob condições de baixo nitrogênio, sugerindo que o sistema degradante da lignina era responsável pela degradação do herbicida. Entretanto, LiP, MnP e laccase, bem como o filtrado de cultura não oxidaram os herbicidas. Nem o cloronitrofeno nem o nitrofeno foram oxidados pela laccase – sistema redox-mediador usando HBT, que é um conhecido redox-mediador da laccase. Estes resultados permitem concluir que as enzimas ligninolíticas extracelulares não foram envolvidas na etapa inicial da degradação do CNP ou NIP pelo Coriolus versicolor IFO 30340. A identificação sequencial dos produtos formados durante o metabolismo do CNP e seus intermediários por C. versicolor permitiu aos autores propor quatro diferentes caminhos para a degradação do CNP: hidroxilação aromática, descloração oxidativa, descloração redutora e redução do grupo nitroglicerina a amina. A hidroxilação aromática para formar o éter 2,4,6-tricloro-3-hidroxi-4′-nitrodifenílico e a descloração oxidativa para formar o éter 2,4-dicloro-6-hidroxi-4′-nitrodifenílico foram assumidas como catalisadoras pela(s) enzima(s) do tipo citocromo P450, pois esses caminhos foram eficientemente fechados pela adição exógena de butoxido piperonílico, um inibidor do P450. A conversão de CNP para NIP por Coriolus versicolor IFO 30340 deve ser uma descloração redutora. Reacções de descloração redutivas foram envolvidas na degradação do pentaclorofenol por P. chrysosporium . O CNP também foi convertido em 2,4,6-tricloro-4′-aminodifenil éter por C. versicolor. As reações redutoras de descloração e de nitro-redução também foram encontradas como reações iniciais na degradação do CNP, que foram aumentadas com a adição do inibidor de citocromo P450. A hidroxilação aromática e a descloração oxidativa também foram observadas durante a conversão fúngica do NIP; porém, os produtos formados não foram identificados – assumiram ser 2, 4-dicloro-3-hidroxi-4′-nitrodifenil éter ou 2, 4-dicloro-6-hidroxi-4′-nitrodifenil éter e 2-cloro-4-hidroxi-4′-nitrodifenil éter ou 2-hidroxi-4-cloro-4′-nitrodifenil éter, respectivamente. A conversão fúngica do NIP também foi efetivamente inibida pelo butoxide piperonílico.

Baseado no resultado obtido, os autores assumiram que o citocromo P450 teve um papel importante na redução do potencial de ionização dos aromáticos ambientalmente persistentes e no fornecimento de substratos adequados para enzimas ligninolíticas oxidantes de um elétron para degradação efetiva. Quando éter difenílico, éter 4-clorodifenílico e éter 4-nitrodifenílico foram adicionados à cultura fúngica, o éter 4-hidroxidifenílico, o éter 4-cloro-4′-hidroxidifenílico e o éter 4-nitro-4′-hidroxidifenílico foram identificados como os principais produtos, respectivamente. 4-clorofenol e 4-nitrofenol foram detectados em quantidades vestigiais de éter 4-clorodifenílico e éter 4-nitrodifenílico, respectivamente, mas a contraparte hidroquinona não foi observada. Estes dados sugerem que a formação de produtos fenólicos a partir do anel A ou B do CNP pode ser derivada por um caminho diferente, e que a clivagem direta do éter pode não ter ocorrido. Estes achados deram evidência de que fungos degradaram herbicidas por diferentes vias usando seus múltiplos sistemas metabólicos.

Ganoderma lucidum mostrou ser resistente aos herbicidas diurônio e bentazônio: os limites superiores foram de 80 µM e 20 mM, respectivamente. Este achado pode ser explicado pela maior toxicidade dos metabólitos formados durante a transformação do diurão. Foi relatado anteriormente que alguns dos metabólitos resultantes da transformação fúngica do diurão podem ser ainda mais tóxicos do que o composto pai. G. lucidum foi capaz de remover eficazmente 55% do diurão e 88% do bentazão após 10 dias de cultivo em culturas líquidas. Ambos bentazon e diuron melhoraram fortemente a produção de laccase pelo fungo induzindo uma das duas isoformas do laccase. A análise PAGE nativa das enzimas extracelulares revelou que a melhora na atividade da laccase em resposta aos herbicidas não foi devida à expressão de uma nova laccase, mas que foi devido à superprodução de uma isoforma já existente nas culturas não induzidas. Resultados similares foram obtidos com Trametes versicolor e Abortiporus biennis , onde suas lacas constitutivas foram produzidas em excesso na presença do paraquat, um herbicida de nitrogênio quaternário. A análise eletroforética das enzimas extracelulares de G. lucidum mostrou que laccase1 era a enzima dominante sob condições não induzidas. Curiosamente, os herbicidas induziram apenas a isoforma laccase2 enquanto o laccase1 foi suprimido nessas culturas. Tais resultados sugerem que o laccase2 é, provavelmente, a isoforma mais intensamente envolvida no sistema de defesa do fungo, considerando que ambos os herbicidas inibiram fortemente o crescimento do fungo. Estas observações mostram que estes tipos de enzimas têm, pelo menos em parte, um papel importante na degradação de poluentes sob condições in vivo.

O estudo comparativo da degradação do herbicida bentazon por Ganoderma lucidum em culturas líquidas e em estado sólido usando espiga de milho como substrato tem sido realizado. O fungo foi mais resistente ao herbicida e mais eficiente na sua degradação em culturas de estado sólido em comparação com culturas de estado líquido: 50 mM contra 20 mM e 90% contra 55%, respectivamente. Os autores propuseram duas possíveis explicações, não mutuamente exclusivas: uma menor disponibilidade do herbicida devido à sua adsorção ao substrato insolúvel espiga de milho para esta observação e as maiores atividades tanto do laccase quanto da peroxidase de Mn em culturas em estado sólido, em comparação com as culturas em estado líquido, onde foi detectada a alta atividade do laccase. No entanto, não foram encontrados produtos metabólicos nos extratos aquosos e metanólicos combinados. O G. Os filtrados brutos de lucidum contendo laccase e Mn peroxidase mostraram degradar o bentazon in vitro. Os experimentos com adição de Mn2+, ABTS, Tween 80 e H2O2 a filtrados crus demonstraram sinergismos na degradação do bentazon, sugerindo que ambos laccase e Mn peroxidase estavam envolvidos na sua degradação. É bem conhecido que o ABTS medeia a oxidação de compostos não-fenólicos de lignina e a presença de ácidos graxos insaturados (Tween 80) melhora o processo de oxidação catalisado pelas peroxidase de Mn e lacas devido à produção de peroxil lipídico ou radicais alkoxyl . O mecanismo hipotético de degradação do bentazônio pode ser os seguintes radicais Mn peroxidase e laccase gerado peroxil lipídico ou alkoxyl; na presença destes radicais Mn peroxidase oxida Mn2+ a Mn3+, que por sua vez oxida bentazon, enquanto laccase usa ABTS como redox-mediador para a oxidação do bentazon. Entretanto, nenhuma degradação do picloram G. lucidum e Trametes sp. foi observada em culturas líquidas, talvez devido a sua alta substituição do anel aromático . Este herbicida aumentou a produção de laccase por Trametes sp., enquanto que a produção de enzimas por G. lucidum foi suprimida. Os autores assumiram que a inibição da produção enzimática poderia estar ocorrendo ao nível do mRNA após o piclorame ter entrado na célula ou por modificação enzimática antes ou depois da secreção . A exposição de G. lucidum e Trametes sp. a picloram revelou um mecanismo peculiar de bioacumulação transitória do herbicida por ambos os fungos.

A WRF mais estudada é P. chrysosporium, que se mostrou degradar uma ampla gama de herbicidas sob diferentes condições. MCPA e bentazon foram degradados pelo P. chrysosporium a 65% e 75%, respectivamente, em 20 dias . P. chysosporium degradou isoproturon pertencente aos grupos fenilureia , atrazina , e também diuron . No entanto, de acordo com a mesma, nenhuma degradação da atrazina foi observada por este fungo em culturas líquidas. A eficiência de degradação do P. chrysosporium foi maior em culturas de estado sólido em comparação com culturas líquidas. Dois mecanismos de degradação dos herbicidas foram propostos: a ação das enzimas ligninolíticas e a ação das enzimas intracelulares em particular o citocromo P450. Em , foi estudada a degradação do diurão por P. chrysosporium incluindo a identificação dos produtos formados e a avaliação do papel do citocromo P450. Dois achados foram de grande importância: as quantidades consideráveis de diurônio, DCPMU e DCPU encontradas em micélio fresco e a inibição da degradação do diurônio pelo ABT (1-aminobenzotriazol), um inibidor do citocromo P450. Estes resultados confirmaram o mecanismo intracelular desta degradação do herbicida resultando na desmetilação do N. Entretanto, após 5 dias as concentrações de DCPMU e DCPU foram maiores em filtrados culturais do que em extratos de micélio, sugerindo possível envolvimento de enzimas lignolíticas na degradação destes metabólitos. De acordo com da Silva Coelho-Moreira et al. , extratos crus enzimáticos fornecidos com combinações de álcool veratryl H2O2 e Mn2+ não degradaram o herbicida, é possível que a DCPMU e a DCPU possam ser posteriormente transformadas por MnP.

P. chrysosporium também é capaz de transformar atrazina, seu produto de transformação e outros herbicidas s-triazinas . O primeiro e principal passo no caminho de degradação da triazina clorada pelo fungo foi a mono-N-dealquilação. A hidroxiatrazina foi o principal produto de degradação encontrado em solos tratados com atrazina e em culturas líquidas. P. chrysosporium transformou activamente a hidroxiapatirazina num composto desconhecido que se acumulou no meio de cultura. Foi estabelecido que a presença de grupos alquilo e cloro na posição 2 é necessária para a mono N-dealquilação da atrazina por P. chrysosporium. Consequentemente, a formação de desetilidroxiatrazina em culturas líquidas deve resultar da hidrólise da desetilatrazina. Experiências com terbutilazina, atrazina e simazina também mostram que a remoção da cadeia lateral etílica é a reação preferencial, e pode depender da massa do segundo grupo alquilo. Em outras palavras, os compostos com um grupo de alta massa ligados a um amino substituto são esperados a sofrer uma maior N-dealquilação afetando a outra cadeia. Os compostos simétricos propazina e simazina também foram degradados a uma taxa mais lenta do que a atrazina. Nem os LiPs nem os MnPs transformaram a atrazina e seus metabólitos N-dealquilados. Foi demonstrado que a atrazina N-dealquilação diminuiu na presença do inibidor do citocromo P450. Além disso, a degradação do herbicida foi suportada pelo micélio. Portanto, o envolvimento do citocromo P450 na degradação da atrazina foi assumido. Estes dados estão de acordo com o estudo da degradação da atrazina pelo Pleurotus pulmonarius, que envolveu enzimas como lipoxigenase, peroxidase e citocromo P-450, previamente publicado. O Mn2+, que ativa essas enzimas, estimulou a transformação da atrazina em metabólitos N-dealquilados e propilidroxilados, enquanto os antioxidantes e inibidores da lipoxigenase e peroxidase (ácido nordihidroguaiarético), bem como o citocromo P-450 (buóxido de piperonilo) suprimiram a sua degradação.

Para analisar os dados apresentados na Tabela 2, a taxa de desaparecimento do herbicida foi calculada como a razão entre o desaparecimento (%) e a duração da degradação (dias), seguida por um cálculo de valor médio para cada herbicida (Fig. 1). Levando-se em consideração o efeito das condições de cultivo sobre a degradação dos herbicidas por fungos, apenas os dados sobre condições estacionárias em meios líquidos foram tratados desta forma.