WWWOX está localizado no braço longo do cromossomo 16 em um local reconhecidamente frágil. É composto de nove exons e tem tamanho >1 Mb.1 A transcrição canônica (ENST00000566780.5, NM_016373.3) codifica uma proteína ubíqua de 414-aminoácidos (aa) altamente expressa na próstata, gônadas, mama, pulmão, tecidos endócrinos e cérebro.21,22 A emenda alternativa do WWOX durante o processamento do RNA do mensageiro precursor (pré-MRNA) gera oito transcrições que foram observadas apenas em cancros; se cada mRNA aberrante do WWOX é traduzido em proteína é desconhecido.23 A oxidoreductase contendo domínio WW é a única proteína que une dois domínios distintos com altas homologias com a família de domínios WW e a superfamília SRD. O WWOX abriga dois domínios WW no amino terminal, um sinal de localização nuclear (NLS) e um domínio de cadeia curta desidrogenase redutase (SDR) terminal C (Fig. 1b). Um motivo de sequência mitocondrial de alvo (MTS) também foi mapeado dentro do domínio SDR entre aa 209 e aa 273 (ref. 24). O WWOX também contém uma coenzima, NAD(H) ou NADP(h) (GANSGIG, aa 131-137), e um potencial local de ligação do substrato (YNRSK, aa 293-297) (ref. 1). O domínio C-terminal da WWOX (aa 125-414) é semelhante a uma região de interação MAPT (http://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZC7).

WWOX variantes germinativas patogênicas identificadas em pacientes com desordens constitucionais relacionadas à WWOX (SCAR12, síndrome WOREE, e DSD). a Variações do número de cópias (n = 12). Distúrbio DSD do desenvolvimento sexual, IF in frame, OOF out of frame, encefalopatia epiléptica relacionada a WOREE WWOX. b Variações de um único nucleotídeo (n = 23). MTS mitocondrial targeting sequence, NLS nuclear localization signal, SRD shortchain dehydrogenase reductase.

WWOX is tolerant to missense variations with a missense constraint metric Z = -3.19 (Exome Aggregation Consortium).20 Muitos CNVs heterozigotos que afetam todo ou parte deste gene são observados em amostras de controle saudáveis (Database of Genomic Variants).O alto número de variações patogênicas/probavelmente patogênicas em bancos de dados públicos não é surpreendente considerando um modo autossômico recessivo de herança para a encefalopatia relacionada à WWOX.

WWWOX é expresso no desenvolvimento do sistema nervoso do rato, incluindo o córtex cerebral e o cerebelo desde o estágio in utero até a idade adulta.26 Modelos animais demonstraram epilepsia e ataxia causada pela perda de WWOX,3,27 sugerindo um processo neurodegenerativo. Em uma revisão detalhada da literatura, Aldaz e colaboradores demonstraram claramente que WWOX está no cruzamento de câncer, síndrome metabólica e encefalopatia.28

Dados clínicos e moleculares para todos os pacientes da literatura com fenótipos SCAR12 ou WOREE estão descritos na Tabela Suplementar 3 (ref. 3,4,5,6,7,8,29,30). Dois pacientes adicionais, irmãs de uma família árabe consanguínea com uma variante homozigoto WWOX (c.1228G>T; p.Gly410Cys), também foram relatados por Alkhateeb et al. em 2016 (ref. 9), mas há dúvidas quanto à patogenicidade da variante identificada nesses casos. Ambos apresentaram fala atrasada e um teve epilepsia a partir dos 2 anos de idade. A apresentação clínica nesta família é muito leve em comparação com a síndrome de WOREE observada em pacientes com variantes patogênicas da linha germinal bialleica na WWOX. Esta mudança de glicina para cisteína na posição 410 afeta um aminoácido no final do lado carboxil terminal da proteína. Além disso, esta mudança de aminoácidos está presente na forma homozigotos em dois indivíduos do conjunto de dados da gnomAD. Embora em silico as previsões sejam a favor da patogenicidade desta variante patogénica missense (possivelmente danificada pela PolyPhen-2), o seu papel causal é questionável nesta família. Portanto, decidimos excluir estes pacientes de nossa revisão de literatura.

Relatamos aqui a maior coorte de indivíduos com um fenótipo WOREE consistindo de 20 pacientes adicionais com variantes patogênicas bialleicas na WWOX herdadas de pais saudáveis (Tabela Suplementar 1). Os diagnósticos moleculares foram obtidos por uma combinação de diferentes técnicas (array-CGH, qPCR/MLPA, seqüenciamento Sanger direcionado, ES e WGS). Ao agregar nossos pacientes com todos os casos relatados até o momento na literatura, são conhecidos 37 pacientes de 27 famílias com síndrome de WOREE e variantes patogênicas do WWOX bialleico. Um total de 29 diferentes alelos patogênicos/prováveis (10 CNV e 19 SNV) foram identificados (Fig. 1a, b). Os Introns 5 e 8 do gene WWOX são muito grandes com um tamanho de 220 e 780 Kb, respectivamente. Cobrem 90% da sequência genómica da WWOX e contêm pontos de quebra de translocação para mieloma múltiplo,28 de acordo com o facto de as grandes regiões intrónicas serem frequentemente recombinogénicas e propensas a pontos de quebra cromossómicos. Por conseguinte, a duplicação (um alelo) e a eliminação (cinco alelos), abrangendo os exons 6 a 8, são os CNVs patogénicos mais frequentes observados em doentes com doenças relacionadas com WWOX (Tabelas Suplementares 1 e 3). Todos os pacientes de famílias consanguíneas (10/27; 37%) foram encontrados como homozigotos para o mesmo alelo deletério, uma ocorrência comum em distúrbios autossômicos recessivos com baixa prevalência. A alta proporção de famílias com um genótipo compreendendo um ou dois CNVs patogênicos (14/27; 52%) destaca a necessidade de uma abordagem quantitativa para triagem do locus WWOX em pacientes com distúrbios graves do sistema nervoso central. Em pacientes heterozigotos para um CNV que afeta vários exônios, é importante buscar (1) um possível genótipo composto heterozigoto para dois pequenos CNVs e a necessidade de uma segunda análise quantitativa por MLPA ou qPCR em ambos os pais e (2) um SNV no segundo alelo por seqüenciamento Sanger direcionado. Da mesma forma, quando o ES ou sequenciamento de painel genético alvo é realizado como uma investigação de primeira linha, a busca por CNVs é essencial neste grande gene propenso a deleções e duplicações, envolvendo todas ou parte de suas seqüências de codificação.

Neste estudo relatamos oito novas variantes patogênicas de falso-senso (Tabela Complementar 2). Entre os resultados de sequenciamento de alto rendimento do exoma e do painel genético alvo, as variantes de falha do WWOX são numerosas. A sua patogenicidade é difícil de estabelecer porque o WWOX tem numerosas funções e parceiros proteicos. Seguimos as diretrizes do American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)31 para interpretar e anotar as variações do erro nos dados do WWOX para classificá-los como patogênicos, provavelmente patogênicos, variantes de significância desconhecida (VUS), provavelmente benignos, ou benignos. Para auxiliar nosso processo de interpretação de variantes, usamos uma ferramenta online disponível abertamente (http://www.medschool.umaryland.edu/Genetic_Variant_Interpretation_Tool1.html/) para classificar eficientemente variantes com base nas categorias de evidência delineadas pelas diretrizes do ACMG.31 Quatro alterações aa (p., p., p., p.) estão associadas em trans com variantes nulas em um gene onde a perda de função é um mecanismo conhecido da doença. Todas as variantes errôneas identificadas em indivíduos com encefalopatia relacionada à WWOX (11 mudanças aa em 12 famílias, Tabela Suplementar 2) estão previstas como causadoras de doença por uma combinação de softwares baseados na web. Mais importante, nenhuma está presente em estado homozigoto no gnomAD.20 Todas as variantes de missens são classificadas como patogênicas ou provavelmente patogênicas de acordo com as recomendações do ACMG. Um paciente (P19) é portador de três variantes patogênicas de missens diferentes: p.; (Tabela Suplementar 1). A p.(Lys200Glu) e a p.(Thr358Ile) estão localizadas em cis; ambas as mudanças de aminoácidos são previstas como provavelmente patogênicas, embora a treonina na posição 358 não esteja localizada em um domínio funcional conhecido. Não é possível determinar se uma ou ambas as variantes são a variante causadora da doença em P19. Na maioria dos casos aqui relatados e publicados na literatura médica, as variações da seqüência WWOX são descritas no nível básico de DNA. Todas as variantes patogênicas de missense, exceto uma (P3; p.), são interpretadas com base em estudos silicológicos sem evidências experimentais (sem análise de RNA ou seqüência proteica). Em P3, a análise do RNA total por sequenciamento Sanger de produtos PCR de transcrição reversa (RT-PCR) não detectou qualquer anomalia de emenda nos leucócitos. Os estudos de RNA não foram realizados para outros pacientes porque não estavam disponíveis amostras de sangue apropriadas no momento do diagnóstico molecular. Os SNVs exônicos podem afetar os locais de aceitação fisiológica/doadores de emendas, mas também o emendador de emendas exônicas (ESE) e o silenciador de emendas exônicas (ESS). Além disso, a ativação de locais de emenda críptica por SNVs é um mecanismo patológico bem compreendido em muitas doenças genéticas; um bom exemplo disso é a síndrome de Hutchinson-Gilford progeria.32 Variantes de Missense também podem ter impacto na estabilidade do mRNA.33 Até 10% das variantes de Missense associadas a doenças conhecidas, mas apenas 3% dos SNPs comuns, alteram a emenda pré-MRNA.33 É provável que uma fração das variantes de Missense previstas identificadas em pacientes com encefalopatia relacionada à WWOX resulte em perda de expressão devido à emenda anormal. Isto é ainda mais provável para um gene com alelos patogênicos de perda de função. Para as variantes patogênicas de falta de sentido no domínio da SRD, a ausência de substratos identificados torna difícil avaliar seu impacto sobre a atividade catalítica da WWOX. A caracterização de modelos animais de efeito indirecto, como o zebrafish, daria pistas sobre a patogenicidade das variantes de falso WWOX.

Num paciente não incluído neste estudo, suspeitou-se inicialmente de um diagnóstico molecular de encefalopatia relacionada com a WWOX em frente a um genótipo bialélico constituído por dois SNV em trans: um disparate (ENST00000566780.5:p.Gln72*) e uma variante de falso (ENST00000402655:c.600T>A, p.Ser200Arg). A aa mudança na posição 200 afeta apenas uma proteína não-RefSeq WWOX de 311 resíduos. Até agora, todas as mudanças de aa patogênicas foram descritas de acordo com a proteína WWOX canônica (414 aa), que resulta da tradução de uma transcrição 9-exon (ENST00000566780.5, isoforma 1). Não se sabe se a isoforma da proteína WWOX, composta por 311 resíduos, é relevante para as doenças relacionadas com a WWOX. Além disso, o fenótipo neste paciente era leve em comparação com a síndrome de WOREE. Por estas razões, decidimos não considerar este genótipo como causador da encefalopatia neste paciente.

WWOX, cancro e doença pulmonar?

WWOX é um gene supressor do tumor envolvido na modulação das vias relacionadas com o cancro através das interacções proteína-proteína entre os domínios WW e várias proteínas oncogénicas. A perda da proteína WWOX foi encontrada em múltiplas neoplasias.23 Osteosarcomas e carcinomas pulmonares são observados em ratos Wwox-/-22 e a tumorigenese é uma das consequências de um genótipo hipomórfico Wwox.34 Uma perda funcional da cópia CNV (67048) na WWOX foi significativamente associada a um risco aumentado de câncer em populações chinesas.35,36,37 Mais recentemente, a perda da expressão da WWOX no pulmão de ratos demonstrou causar inflamação neutrófila.38 Surpreendentemente, o aumento de casos de câncer nunca foi relatado em pacientes com variantes germinativas bialleicas da WWOX ou em seus pais heterozigotos. A gravidade da síndrome WOREE com uma alta frequência de morte prematura nos primeiros anos de vida poderia explicar a ausência de qualquer câncer. Esta não é uma explicação convincente para pacientes heterozigotos para um alelo nulo da WWOX. A ablação de Wwox não é tumorigênica em todos os modelos animais nocturnos; este supressor tumoral putativo é mais relevante na progressão tumoral do que na iniciação durante a oncogênese. Este estudo confirma que as alterações da linha germinativa WWOX não são variantes patogênicas condutoras importantes para a iniciação e/ou progressão do câncer.

WWOX e DSD

WWOX é altamente expressa em tecidos hormonalmente regulados como a hipófise, testículos e ovário, e presume-se que desempenhe um papel na gonadotropina ou na biossíntese de esteróides sexuais.1,39 Pensa-se que o domínio enzimático SRD na WWOX tem um papel no metabolismo de esteróides com substratos ainda não identificados. Estas observações e a descrição de dois modelos diferentes de ratos knockout WWOX com anomalias gonadais34,39 apoiam claramente um papel para WWOX no desenvolvimento das gônadas.

O primeiro rearranjo da linha germinal da WWOX em humanos foi associado a um 46, XY DSD.2 O paciente tinha tecido gonadal indiferenciado bilateral e testes imaturos. Ele era heterozigoto para uma deleção de exons 6 a 8 herdados de sua mãe, que tinha uma história pessoal de menarca tardia. Prevê-se que esse CNV resulte em uma deleção no quadro, causando a diminuição do produto com o domínio SRD em grande parte ausente. Mais recentemente, três VUS heterozigotos no gene WWOX foram identificados pelo ES em pacientes com DSD (Fig. 1) (ref. 40). Tanto quanto sabemos, o DSD não foi relatado em pais heterozigotos de pacientes com síndrome de WOREE e acreditamos que a implicação de SNV/CNV heterozigotos na etiologia molecular do DSD é questionável. Atrofia testicular, redução da fertilidade, anormalidades gonadais, disfunção das células de Leydig e comprometimento do desenvolvimento mamário são parte dos fenótipos observados em vários modelos animais de ablação WWOX.28 Ao nosso conhecimento, a DSD não é relatada em modelos animais heterozigotos nocturnos. Entretanto, existe a possibilidade de que um fenótipo mais leve possa ser identificado após avaliação cuidadosa do desenvolvimento sexual e função gonadal em pacientes heterozigotos para uma variante patogênica da WWOX.

fenótipo SCAR12

Em 2014, variantes patogênicas homozigotas de falta de sentido na WWOX foram identificadas pelo ES em seis pacientes de duas famílias consanguíneas com ataxia espinocerebelar autossômica recessiva (SCAR12). Até o momento, essa associação não foi confirmada em outras famílias. Os pacientes afetados apresentaram ataxia cerebelar na infância, epilepsia tônico-clônica generalizada, incapacidade intelectual e espasticidade proeminente.3 Comparados aos pacientes com síndrome de WOREE, os pacientes com fenótipo SCAR12 apresentam um atraso de desenvolvimento menos grave: todos foram capazes de andar (4/4; 100%), 3 de 4 foram capazes de falar, e não foi relatado nenhum óbito prematuro. Quando realizada, a RM do cérebro mostrou hipoplasia cerebelar leve (2/2; 100%) nos pacientes afetados, uma característica não observada em nossa coorte. Embora a epilepsia fosse uma característica constante em pacientes com SCAR12, as convulsões eram mais freqüentemente responsivas a drogas antiepilépticas (2/4; 50%). O envolvimento ocular também estava presente com nistagmo relatado em quatro pacientes. Essa forma de ataxia cerebelar recessiva autossômica relacionada à WWOX parece ser uma condição genética rara. A gravidade do fenótipo WOREE e a morte prematura em uma proporção de pacientes podem esconder problemas de equilíbrio relacionados à disfunção cerebelar. Casos adicionais de ataxia cerebelar relacionada à WWOX são necessários para confirmar sua implicação nesta desordem neurológica.

Fenótipo WOREE

Logo após a descrição do fenótipo SCAR12, a WWOX foi implicada em uma forma recessiva de encefalopatia epiléptica infantil em 17 pacientes de 9 famílias.4,5,6,7,8,9,30 Estamos mais do que duplicando o número de casos com 20 pacientes afetados em 18 famílias adicionais. O fenótipo dos nossos pacientes é consistente com o dos relatos anteriores. Observamos uma menor taxa de consanguinidade em nossa coorte, de acordo com a maior proporção de genótipos heterozigotos compostos descritos neste estudo. Esses genótipos podem ter sido perdidos anteriormente quando o array-CGH ou o sequenciamento de alto rendimento foram realizados de forma independente. A implementação da predição de CNV a partir de dados de sequência exoma facilita a identificação de pacientes com genótipos WWOX compostos tanto de SNV como de CNV.

Um feto com anomalias cerebrais e possíveis convulsões intra-uterinas foi relatado em 2015 (ref. 7). Diminuição dos movimentos fetais foram ocasionalmente relatados em nossa série (3/20), enquanto o aumento da translucência nucal foi o sinal mais freqüente durante a gravidez em relatórios anteriores (4/17). As contraturas das mãos e pés foram relatadas em 5 pacientes da nossa coorte e em 3 pacientes da literatura4,5,6, no período pré-natal ou neonatal. Diminuição dos movimentos fetais, aumento da translucência nucal e anomalias nas mãos ou pés poderiam ser sinais pré-natais da doença, mas não são características clínicas específicas ou freqüentes.

Em contraste com a literatura, retardo de crescimento (6%) e microcefalia (20%) não foram características proeminentes em nossos pacientes que apresentavam estatura média baixa normal (-1,1 DP) e média OFC (-1,4 DP). Dismorfismo foi relatado em mais da metade dos pacientes. As características mais marcantes foram uma face redonda com bochechas cheias, pescoço curto e aparência facial hipotônica (Fig. 2). Nos pacientes P15 e P16, na idade avançada, a hipotonia facial ainda estava presente, mas a face tornou-se mais triangular. Problemas médicos adicionais foram escoliose ou cifose de início precoce (65%), o que poderia orientar o diagnóstico, bem como problemas de alimentação com tubo de alimentação em 70% dos pacientes e problemas respiratórios (40%), como visto em outras encefalopatias infantis.

Todos os pacientes apresentavam grande atraso no desenvolvimento. Nenhum deles era capaz de sentar, falar ou andar. O exame neurológico mostrou hipotonia axial e hipertonia distal na maioria dos pacientes. Movimentos distalistas foram ocasionalmente observados. Como relatado na literatura, todos os pacientes tiveram epilepsia precoce (100%) com convulsões diárias e resistência às drogas observadas na maioria dos casos (95%). Não houve maior suscetibilidade a convulsões febris. A síndrome de West caracterizada por espasmos e hipersarritmia registrada no EEG foi relatada em 26% dos pacientes. Foram observadas convulsões focais, generalizadas e combinadas. Foram descritas convulsões tônicas, clônicas, tônico-clônicas e mioclônicas, assim como espasmos e ausências infantis. Assim, a epilepsia foi muito severa, de início precoce e com crises convulsivas variáveis. Como descrito anteriormente, o comprometimento visual parece ser parte do espectro clínico da síndrome de WOREE. A maioria dos pacientes afetados não teve contato visual (75%). Cerca da metade deles apresentava alteração do fundo ocular (47%) e/ou testes de eletrodiagnóstico (45%) sugestivos de atrofia óptica e/ou distrofia da retina. O exame oftalmológico precoce pode, portanto, dar pistas diagnósticas em pacientes com convulsões precoces e atraso no desenvolvimento. A RM do cérebro (Fig. 3) foi anormal em 80% dos pacientes com hipoplasia do corpo caloso (75%) e atrofia cerebral (55%). Confirmamos em nossa coorte que a morte prematura é uma característica da síndrome de WOREE ocorrendo em oito pacientes (40%) com idade média de 40 meses de morte. A gravidade da epilepsia e o comprometimento neurológico podem estar ligados à morte precoce em pacientes afetados.

Ressonância magnética cerebral (RM) de indivíduos com síndrome de encefalopatia epilética (WOREE) relacionada à WWOX. a-j Corpus callosum hipoplástico em planos sagitais. k-q Atrofia cerebral e espaços subaracnoidais aumentados em planos axiais (P4, P6, P14) e planos coronais (P3, P7, P17). r-t Hipersinal simétrico de matéria branca no plano axial T2. u-v Plagiocefalia e ventrículo lateral assimétrico no plano axial T2. w P19 Lesões circulares sagitais T1 sagitais (hipossinal) da parte medial do corpo caloso. m mês, P paciente, y ano de idade.

Principais sinais clínicos em pacientes com WOREE previamente publicados estão resumidos na Tabela Suplementar 4. Desta revisão podemos concluir que WOREE é uma encefalopatia epiléptica muito grave caracterizada por baixa mobilidade espontânea, ausência de desenvolvimento da linguagem e aquisição de marcha, convulsões precoces resistentes a drogas, envolvimento oftalmológico e alta probabilidade de morte prematura. Características dismórficas (face hipotônica redonda, bochechas completas e pescoço curto) e deformidade da coluna vertebral podem ser sinais associados precoces que podem apoiar o diagnóstico.

correlações fenótipo/genótipo

correlações fenótipo/genótipo foram recentemente sugeridas para distúrbios neurodenvolvimentais relacionados à WWOX5,7 com uma classificação dos genótipos WWOX em três grupos. De acordo com a classificação provisória, pacientes portadores de dois alelos nulos previstos eram mais propensos a apresentar o fenótipo WOREE mais grave, enquanto genótipos hipomórficos com duas variantes de missense resultariam em ataxia espinocerebelar (SCAR12). O fenótipo de pacientes portadores de um alelo nulo e uma variação patogênica de missensa seria intermediário.5 Nosso grande estudo fornece uma reavaliação dessas correlações preliminares.

A apresentação clínica mais grave parece estar associada a genótipos que consistem em códons de parada prematura precoce correspondentes à WWOX. Esses genótipos são observados em sete pacientes: deleção homozigotos do exon 1 a 4 no P10, códons de parada homozigotos p.(Arg54*) e p.(Trp44*),4,30 deleção homozigotos dos primeiros seis exons.7 Morte prematura antes de 2 anos ocorreu em 5/7 casos e anomalias cerebrais foram detectadas prenatalmente em uma família. Além disso, a morte prematura nunca foi descrita em pacientes com genótipo patogênico de falso-somente varietal (Tabelas Suplementares 1 e 3). A caracterização precisa das variantes de missense e dos CNVs a nível proteico com estudos funcionais pode dar algumas pistas sobre como os genótipos poderiam explicar diferentes apresentações clínicas, especialmente em relação aos fenótipos SCAR12/WOREE.

Em conclusão, as variantes germinativas patogénicas na WWOX estão claramente associadas a uma grave encefalopatia epiléptica precoce chamada síndrome de WOREE e relatamos aqui a maior coorte de indivíduos com este distúrbio neurológico. A implicação de variantes constitucionais da WWOX em DSD e SCA ainda precisa de estudos de replicação.