7.2 Testicular Architecture

Lue et al. (2005, 2010a) relataram que ratos adultos 41,XXY tinham testículos pequenos e firmes contendo túbulos de SCO de diâmetro diminuído com aumento do número de células de Leydig no interstício. Estes achados são idênticos aos do modelo alternativo KS, o rato 41,XXY* (Lewejohann et al., 2009a; Wistuba et al., 2010, Fig. 24.2) e assemelham-se perfeitamente ao fenótipo testicular visto na grande maioria dos homens KS adultos (Fig. 24.3). Adicionalmente 41,XXY ratos apresentaram um padrão aberrante de expressão do receptor androgênico (RA), não observado até agora em KS (Lue et al., 2005).

Figure 24.2. Fenótipo testicular do modelo 41,XXY* de rato KS.

(A) Hibridação in situ da fluorescência (FISH) de cromossomas sexuais em núcleos interfásicos obtidos a partir de amostras de sangue periférico de ratos da estirpe B6Ei.Lt-Y*. Lado esquerdo: núcleos leucocitários de 40,XY*, lado direito: núcleos leucocitários de 41,XXY* ratos machos. (a) Cromossomos Y* (pontas de seta) detectados por sonda específica verde fluorescente de rato; (b) Cromossomos X (setas) detectados por sonda específica vermelha fluorescente de rato; (c) Mancha nuclear DAPI; (d) Sobreposição de a-c. Observe os dois sinais cromossômicos X em 41,XXY* leucócitos. Um cromossoma X está sempre situado em estreita associação com o sinal Y*. A sobreposição parcial destes cromossomas pode ser detectada pela cor amarelada. (B) Comparação dos pesos particulares das mordidas entre adultos 41,XXY* machos (n = 98) e seus 40,XY* controles de ninhada (n = 91). A perda de células germinativas em machos com um cromossomo X supranumerário resultou em uma redução significativa do tamanho dos testículos. Os valores são média ± SEM. (C e D) Micrográficos representativos da histologia testicular do epitélio seminífero. (C) 40,XY* mouse de controle exibindo espermatogênese completa. (D) 41,XXY* testículo de camundongo. Todas as células germinativas foram esvaziadas do epitélio seminífero deixando apenas a síndrome de células de Sertoli. As células de Sertoli mostram o início da vacuolização. (E e F) Micrografias representativas da histologia testicular do espaço intersticial. (E) Nos ratos de controle 40,XY* as células de Leydig estão normalmente dispostas nos espaços intersticiais entre as paredes tubulares. (F) Em contraste, nos 41,XXY* ratos, o número de células de Leydig é aumentado, formando uma hiperplasia. As barras representam 20 μm. Símbolos: X, células de Sertoli; *, células germinativas diferenciadas; #, células de Leydig. Coloração: Hematoxilina-Eosina.

Figure 24.3. Histologia do tecido testicular humano: Comparação da espermatogênese normal e síndrome SCO tipicamente observada em pacientes de Klinefelter.

(A, C, e E) Micrografias representativas da histologia testicular humana normal exibindo espermatogênese completa. (B, D e F) Micrografias representativas da histologia testicular de um paciente de KS com síndrome de SCO. (A e B) visão geral dos cortes transversais tubulares: enquanto o tecido de controle mostra distribuição normal das áreas intersticiais e tubulares, a situação de SCO exibe perda completa de células germinativas e paredes tubulares hialinizadas. Os túbulos seminíferos contêm apenas células de Sertoli. (C e D) Detalhe do epitélio seminífero: No controle, todos os estágios das células germinativas até os espermatozóides maduros estão presentes. Tipicamente para homens KS adultos, todas as células germinativas estão ausentes. As células do sertoli mostram o início da vacuolização. (E e F) Detalhe do espaço intersticial. Nos testículos de controle, as células de Leydig estão normalmente dispostas nos espaços intersticiais entre as paredes tubulares. Em contraste no tecido obtido de um paciente KS, o número de células de Leydig é elevado mostrando hiperplasia típica. As barras representam 20 μm. Símbolos: X, células de Sertoli; *, células germinativas diferenciadas; #, células de Leydig. Coloração: Hematoxilina-Eosina.

Células de Sertoli estão situadas nos túbulos seminíferos onde suportam a diferenciação espermatogénica, fornecendo nutrição e mediação da sinalização endócrina (Wistuba et al., 2007). Como tal, quaisquer alterações nestas células essenciais influenciam profundamente a função testicular. Foram encontradas evidências de apoptose precoce de células de Sertoli em KS, levando à proposição de que a perda de suporte e comunicação entre as células de Sertoli e as células germinativas pode estar relacionada com a depleção de células germinativas observada na síndrome (Aksglaede et al., 2006; Wistuba et al., 2010). As células de Sertoli expressam o receptor de androgênio (RA) e produzem proteína de ligação ao androgênio e inibição. Qualquer perturbação das células, portanto, pode influenciar a quantidade de ITT nos espaços intersticiais e, como consequência, afectar o feedback endócrino ao longo do eixo hipotálamo-hipófisise-gonadal. Nenhuma evidência empiricamente robusta sobre a presença, desenvolvimento e/ou função celular de Sertoli alterada pôde ser obtida até que os primeiros achados sistemáticos dos modelos experimentais se tornassem disponíveis. Os achados dos primeiros estudos (Lue et al., 2005) foram de particular interesse e importância, pois mostraram que a RA foi expressa nas células de Sertoli de camundongos adultos controle XY, mas não nos camundongos XXY. Isto apesar de ambos os animais terem um padrão similar até o 20º dia pós-parto (pp), indicando que a perda de expressão da RA nos ratos XXY ocorre em torno da puberdade e sugere que nestes animais, a maturação das células de Sertoli pode ser alterada indicando que elas podem influenciar ou ser influenciadas pelo desenvolvimento anormal das células germinativas. Alguma credibilidade a esta noção foi dada por uma avaliação histológica dos testículos do modelo 41,XXY*, que encontrou o número de células de Sertoli a serem reduzidas em comparação com os controles.

As investigações realizadas até o momento fornecem evidências suficientes para supor que as células de Sertoli estão alteradas em machos com um cromossomo X supranumerário. Para compreender os fundamentos da interação das células germinativas de Sertoli, apoptose, maturação e diferenciação de células de Sertoli, são necessárias avaliações mais profundas; estudos que requerem quantidades substanciais de material e a cronicidade da proliferação, diferenciação e maturação ao longo de um extenso período de tempo. Essas investigações são impossíveis de serem realizadas em humanos. Somente com o auxílio dos modelos de camundongos pode ser realizada qualquer exploração significativa das alterações nesta célula somática testicular crucial.

Foi relatado que durante a degeneração testicular observada em KS também as células de Sertoli degeneram-se ao longo do tempo (Aksglaede e Juul, 2013; Aksglaede et al., 2006), uma observação que está de acordo com os dados do nosso modelo de camundongos demonstrando que os números de células de Sertoli são alterados durante o desenvolvimento pós-natal (Werler et al., 2014). Em conjunto, a fisiologia celular de Sertoli alterada necessita de análises mais detalhadas deste tipo de células somáticas já durante o desenvolvimento pré-natal. A propagação e diferenciação da linha germinal é particularmente afectada pelas consequências da aberração cromossomática. Assim, os principais pontos de controlo e consequentemente os processos que ocorrem especificamente na linha germinal podem ser alterados pelo desequilíbrio cromossómico, ou seja, pelo desenvolvimento do sistema de células estaminais primordiais e espermatogónias (PGC, SSC). Como mencionado anteriormente, estudos in vitro mostraram que células germinais aneuploides indiferenciadas morreram quando isoladas de gônadas embrionárias e apenas aquelas com um cariótipo aleatoriamente corrigido sobreviveram em cultura (Hunt et al., 1998; Mroz et al., 1999). Assim, os CSCs com um cariótipo aberrante devem ter entrado em uma via padrão durante a fase intra-uterina, mas o mais tardar no período perinatal. Quando apenas células germinativas com um cariótipo corrigido sobrevivem in vitro após terem sido isoladas da gônada embrionária, enquanto células germinativas aberrantes morrem com o tempo, surge a questão, por que – na vivo- a perda de células germinativas progride pos-natal como mostrado recentemente (Werler et al., 2014). Mesmo que algumas células germinativas aberrantes ainda estejam presentes no testículo perinatal, uma certa proporção das presentes no momento do nascimento deve ser de cariótipo correto e a população de células espermatogoniais deve pelo menos permanecer estável se não se propagar. A partir desta observação em parte contraditória e aceitando a hipótese mais plausível de que a correcção por propulsão aleatória explica a sobrevivência de uma população reduzida de células germinais primordiais (PGCs; Mroz et al., 1999; Sciurano et al., 2009) e subsequentemente gonócitos no período pós-natal, alguns destes sobreviventes podem perder as suas propriedades de células estaminais já antes do nascimento. Aparentemente, perdem-se durante a diferenciação peripuberal, enquanto muito poucos conseguem sobreviver ocasionalmente, exprimem correctamente todos os marcadores relevantes e conduzem focos de espermatogénese. A avaliação sistemática das alterações fenotípicas durante o desenvolvimento no útero é per se possível apenas num modelo de rato.

A perturbação do eixo HPG, que causa o hipergonadismo hipergonadotrópico comumente visto em pacientes KS juntamente com o aumento sugerido do número de células de Leydig nas biópsias testiculares levou à hipótese de que a função das células de Leydig e/ou a maturação podem ser afectadas pelo desequilíbrio cromossómico sexual. As células de Leydig são esteroidogênicas, sendo a fonte de testosterona essencial para o desenvolvimento do fenótipo masculino saudável e crucial para a continuidade e conclusão da espermatogênese normal.

Como nas outras facetas da KS, o fator restritivo para qualquer investigação em profundidade é o acesso limitado ao tecido testicular. Com a disponibilidade dos 41,XXY* ratos machos, estudos sobre células de Leydig de homens com um cromossomo X supranumerário tornaram-se viáveis para investigar. Usando este modelo, confirmamos a presença de hiperplasia de células de Leydig, determinada por microscopia estereológica, e também descobrimos que os níveis de ITT eram semelhantes aos dos ratos de controle (Wistuba et al., 2010). Isto foi surpreendente considerando os baixos níveis séricos de T observados em pacientes com KS e 41,XXY* ratos (Lanfranco et al., 2004; Smyth e Bremner, 1998; Wistuba, 2010). Em linha com os baixos níveis de T circulantes foi a descoberta de que, uma vez que as células de Leydig do modelo KS foram retiradas do ambiente testicular, cultivadas in vitro e normalizadas para o número de células, sua função foi de fato alterada. No entanto, não foi prejudicada, como seria de esperar, mas sim hiperactivada. Quando os perfis de expressão do mRNA dos genes marcadores Tsp2 (trombospondina 2: uma proteína matricelular de origem fetal que é predominantemente expressa em células juvenis de Leydig), Rlf (relaxin-like factor: marker of mature Leydig cells), Est (estrogênio sulfotransferase: marcador de células de Leydig maduras), e LHR (receptor LH: investigado para correlação com experimentos de estimulação celular de Leydig, ver mais adiante) foram determinados, as células isoladas XXY* de Leydig mostraram um perfil de expressão de mRNA maduro e atividade transcripcional significativamente maior em comparação com os controles (Wistuba et al., 2010; O’Shaughnessy et al., 2002). A análise da expressão gênica revelou um aumento geral na expressão de XXY* genes específicos de células Leydig com Est expresso aproximadamente 20 vezes, Rlf 8 vezes, Tsp2 5 vezes e LHR 3 vezes maior do que células Leydig do tipo selvagem. A estimulação das células de Leydig XXY* in vitro indicou um receptor de LH maduro que respondeu ainda mais forte à estimulação da Gonadotropina Coriônica humana (hCG, um substituto para LH) do que as células dos controles. Além disso, a atividade esteroidogênica das células de Leydig XXY* foi elevada, na medida em que mais T por célula foi produzido em resposta ao hCG.

Estes resultados empolgantes não só levam a um novo conceito sobre a origem do hipogonadismo hipergonadotrópico, mas também demonstram a validade do modelo do rato KS, com suas conseqüências translacionais diretas para nossa compreensão dos pacientes KS. Os resultados do modelo de camundongo indicam que a função celular de Leydig não é prejudicada per se, sugerindo que outros fatores no ambiente testicular são responsáveis pelo distúrbio da endocrinologia androgênica observada em pacientes KS. Em particular, como pudemos confirmar também em pacientes que os valores do ITT não foram diferentes dos controles (Tüttelmann et al., 2014). Possivelmente a arquitetura testicular alterada associada ao distúrbio pode dificultar o transporte endócrino para a circulação, uma proposta que foi apoiada pelos achados de que os pacientes KS também diminuíram o diâmetro dos vasos sanguíneos (Foresta et al., 2012). Levando isso em consideração, nos propusemos a encontrar uma possível explicação “vascular” para a falta de liberação de T na corrente sanguínea testicular. Nas biópsias de testículos de pacientes, a análise confiável dos vasos não é, no entanto, possível devido ao viés resultante da técnica de dissecção que requer evitar vasos sanguíneos maiores para evitar sangramento. Consequentemente, a constituição dos vasos sanguíneos foi avaliada em cortes de testículos inteiros de camundongos adultos do sexo masculino 41,XXY* e 40,XY*. De fato, a relação vaso sanguíneo/resistência superficial dos testes menores de camundongos XXY* foi significativamente menor nesses camundongos em comparação com os controles XY*. Em conclusão, a produção de T testiculares não parece estar prejudicada em homens com KS. Os dados do modelo do rato nos permitem especular que um suprimento vascular reduzido pode estar envolvido na menor liberação de T na corrente sanguínea.