Isolamento, Cultura, e Caracterização Funcional das Células-Tronco Embrionárias Humanas: Tendências atuais e desafios
Abstract
Células-tronco embrionárias humanas (HESCs) possuem grande potencial para o tratamento de várias doenças degenerativas. Os hESCs pluripotentes têm uma grande capacidade de auto-renovação ilimitada em cultura e de se diferenciarem em todos os tipos de células do corpo. A jornada da pesquisa dos hESC não é tão tranquila, pois tem enfrentado vários desafios que se limitam não só à formação de tumores e imunorejeção, mas também a aspectos sociais, éticos e políticos. O isolamento dos hESCs do embrião humano é considerado altamente censurável, pois requer a destruição do embrião humano. O assunto foi debatido e discutido tanto em plataformas públicas quanto governamentais, o que levou à proibição da pesquisa dos hESC em muitos países ao redor do mundo. A proibição tem afetado negativamente o progresso da pesquisa hESC, uma vez que muitos governos federais em todo o mundo suspenderam o financiamento da pesquisa. Posteriormente, alguns países levantaram a proibição e permitiram o financiamento da pesquisa hESC, mas o dano já foi feito no progresso da pesquisa. Sob estas condições desfavoráveis, ainda se fez algum progresso para isolar, cultivar e caracterizar os hESCs usando diferentes estratégias. Nesta revisão, nós resumimos várias estratégias utilizadas para isolar, cultivar e caracterizar com sucesso os hESCs. Finalmente, os hESCs têm uma grande promessa para aplicações clínicas com estratégias adequadas para minimizar a formação de teratomas e imunorejeção e melhores estratégias de transplante de células.
1. Células-Tronco embrionárias: Procedimento de Descoberta Precoce e Isolamento
Células-tronco embrionárias (ESCs) foram isoladas pela primeira vez de embriões de camundongo em 1981, e a palavra “célula-tronco embrionária” foi cunhada pela primeira vez por Gail R. Martin. No entanto, o mundo conheceu as ESCs com a descoberta revolucionária em 1998, onde Thomson e sua equipe mostraram pela primeira vez uma técnica para isolar hESCs de embriões humanos. Posteriormente, pesquisadores demonstraram que os hESCs têm a capacidade de se diferenciar em todas as células do corpo, incluindo as células beta das ilhotas de Langerhans, células neurais, cardiomiócitos e células semelhantes a hepatócitos. As capacidades pluripotentes dos hESCs têm dado esperança a milhões de pacientes que sofrem de diabetes, doença de Parkinson, doenças cardiovasculares e doenças hepáticas. Considerando que os hESCs têm um grande potencial terapêutico, várias linhas de hESCs foram geradas em todo o mundo. Um dos desafios dos hESCs foi o método de isolamento das células-tronco do embrião humano, pois os hESCs só podem ser obtidos a partir da massa celular interna (MCI) dos embriões humanos. Pesquisadores relataram que a MCI pode ser obtida a partir de embriões humanos frescos ou congelados . Posteriormente, foram desenvolvidos vários métodos para isolar a MCI de um único embrião humano, que incluem a dissecção mecânica, onde a MCI é isolada por pressão mecânica . A MI também pode ser isolada por dissecção a laser e por procedimentos de imuno-cirurgia . Existem vários benefícios de se utilizar um procedimento de imuno-cirurgia para isolar a MI, mas isso também traz algumas desvantagens. Por exemplo, o procedimento de imuno-cirurgia requer os meios de cultura que contêm soro de cobaia; portanto, o uso de soro animal torna a técnica de imuno-cirurgia inadequada para a geração de linhas hESC de grau clínico . Em outro método, as linhas hESC podem ser isoladas da MCI por microdissecção de blastocistos humanos usando agulhas finas. A biópsia assistida por laser é também a técnica mais promissora para o isolamento da MCI sem xenos. Após o isolamento da MCI, as células do caule são cultivadas para gerar os ESC usando camadas alimentadoras, matrizes extracelulares, proteínas, peptídeos e polímeros sintéticos. As vantagens e desvantagens de vários métodos de isolamento da MI estão resumidas na Tabela 1.
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O isolamento da MI exige a destruição de embriões humanos, o que tem levantado sérias preocupações éticas . Para satisfazer a questão ética, os pesquisadores demonstraram uma abordagem alternativa para isolar hESCs de um único blastômero sem matar ou destruir o embrião humano. Por exemplo, durante os testes genéticos pré-implantação, a biópsia de embriões portadores de um único blastômero pode ser obtida de pacientes (; Klimanskaya et al., 2009). Tem sido relatado que 5 linhas hESC foram obtidas com sucesso de uma única biópsia de blastômeros. O sucesso da obtenção de hESCs de boa qualidade depende da qualidade dos blastocistos, dos procedimentos de isolamento e das condições de cultura. Foi relatado que 2 linhas hESC foram obtidas de 4 blastocistos, enquanto apenas 3 linhas hESC puderam ser isoladas de 13 blastocistos e, em alguns casos, apenas 3 linhas hESC puderam ser isoladas de 58 blastocistos . Estas diferenças no isolamento de linhas hESC a partir de diferentes blastocistos são principalmente devidas à qualidade dos embriões e dependem também do método de isolamento embrionário e dos protocolos de cultura. Por exemplo, se um embrião é obtido através de um método de fertilização in vitro, há uma grande possibilidade de que os embriões tenham uma alta incidência de anomalias cromossômicas pós-enzigóticas que podem eventualmente dar uma má qualidade de hESCs .
Em ratos, as células-tronco pluripotentes também podem ser derivadas do epiblasto de embriões pós-implantação, comumente conhecidos como células-tronco epiblasto. Estas células estaminais pluripotentes apresentam características primas e são altamente dependentes da activação de FGF e de vias de sinalização de activação para a sua auto-renovação. Consequentemente, três condições pluripotentes distintas, nomeadamente, condições de pluripotência ingénuas, primas e moídas, foram definidas em ratos .
2. Culturas de hESCs com ou sem Células Alimentadoras
Após a recolha do blastômero, este é normalmente coculurado com o embrião da biópsia parental no meio contendo fibronectina e laminina. A adição de lamina no meio de cultura é importante para a formação de células-tronco embrionárias (ESC-), como agregados. Além disso, há relatos que sugerem que a adição de meios livres de soro e fatores de crescimento de fibroblastos aumenta a proliferação de células-tronco e evita que as células-tronco embrionárias sofram diferenciação. Descrevemos brevemente várias condições de cultura que têm sido utilizadas para melhorar tanto a qualidade como a quantidade da geração de HESCs.
2,1. Células Alimentadoras de Rato para Cultivar hESCs
Células de fibroblasto embrionário de rato (MEF) ou células alimentadoras de rato são consideradas os elementos mais importantes para os hESCs porque o MEF fornece condição favorável para o crescimento e expansão dos hESCs (Figura 1). Tem sido relatado que os MEFs são muito importantes para a geração bem sucedida de linhas de hESCs. Além disso, todas as primeiras linhas de hESC foram cultivadas nos meios contendo fatores de crescimento e citocinas secretadas por células MEF, e estes fatores de crescimento e citocinas são necessários para manter a pluripotência das células-tronco. Como o MEF foi derivado de uma fonte de camundongos, ele tem colocado sérios problemas éticos ou de saúde para os hESCs. Além disso, o uso de células baseadas em animais pode transmitir patógenos infecciosos derivados de animais para os hESCs e torná-los inadequados para a utilização humana. Tem sido relatado que células MEF contêm partículas virais que são capazes de infectar os hESCs durante a cultura. Além disso, alguns pesquisadores têm usado soro bovino para a cultura de hESCs, mas o uso de soro derivado de animais pode transmitir priões e vírus de animais em cultura de células-tronco embrionárias. Tem sido relatado que as células e soro de origem animal podem transmitir vírus e outros patógenos em células estaminais embrionárias através da interação célula célula/célula durante a cultura in vitro . Além disso, estas moléculas patogénicas podem contaminar toda a cultura de hESC. Caso os hESCs sejam contaminados com tais patógenos, a questão da contaminação pode persistir, mesmo que os hESCs sejam posteriormente transferidos para uma condição de cultura sem animais. Outro problema com as células de alimentação de ratos e soro/proteínas derivadas de animais é que elas também contêm ácido siálico não-humano (Neu5GC), o que também pode representar um grave problema de contaminação para os hESCs. Por exemplo, foi relatado que o ácido siálico derivado de animais entrou metabolicamente na superfície celular dos hESCs e das células estaminais embrionárias contaminadas.
2.2. Células Alimentadoras Não Animais para Cultivar hESCs
Para evitar produtos de origem animal e contaminações entre espécies, os pesquisadores desenvolveram meios de cultura que não contêm componentes animais e ao mesmo tempo apoiaram o crescimento e expansão de células-tronco embrionárias. Tem sido relatado que células humanas podem ser usadas para cultura de hESC; por exemplo, células da trompa de falópio humano, prepúcio fetal, músculo e pele fetal, células transgênicas do estroma do fígado fetal, medula óssea, cordão umbilical, células placentárias e células endometriais têm sido relatadas para apoiar a cultura e expansão de células-tronco. Dentre essas células humanas, as células do estroma umbilical humano oferecem uma melhor fonte de células de alimentação que também podem ser coletadas usando um método não-invasivo, enquanto o uso de prepúcio, fetal ou de camadas de células de alimentação derivadas da medula óssea levanta algumas preocupações éticas.
Células de alimentação cesídicas, as linhas de células humanas também oferecem uma alternativa às células de alimentação de camundongos. Recentemente, várias linhas hESC foram derivadas e propagadas usando uma linha de fibroblasto de prepúcio humano disponível comercialmente. As células endometriais também provaram ser eficazes para a cultura in vitro de células estaminais . Outra forma de eliminar o risco de contaminação por patógenos animais é a utilização de camadas de alimento derivadas da linha de células estaminais humanas . O fator de crescimento básico do fibroblasto (bFGF) demonstrou ser produzido endogenamente por células alimentadoras humanas utilizadas na cultura hESC (; Liu et al., 2014). Estas células alimentadoras também secretam TGFβ e activina A que estão envolvidas na manutenção da pluripotência da MCI . Apesar de ter vários benefícios, a cultura de hESC dependente de células de alimentação tem muitas limitações; por exemplo, a manutenção das camadas de alimentação é trabalhosa, com demasiadas variações entre as populações de células de alimentação. Esta disparidade pode afetar negativamente a alegação do hESC para aplicação humana.
2.3. Cultura Sem Alimentadores para Cultivo de hESCs
As células de alimentação animal e humana têm limitações, os pesquisadores exploraram e desenharam com sucesso meios de cultura quimicamente definidos para cultivar hESCs, e a melhor coisa sobre os meios definidos é que eles não contêm nenhuma célula alimentadora. Uma das primeiras abordagens tentadas para meios de crescimento livres de alimento foi a utilização de proteínas de matriz extracelular juntamente com factores de crescimento para criar uma condição de cultura in vitro para a proliferação e renovação das células estaminais (Figura 2). Entre estas proteínas, o Matrigel foi utilizado principalmente em combinação com factores de crescimento ou meios condicionados para cultura de hESCs . Apesar de vários benefícios, a Matrigel encontrou muitas variações na sua composição que colocaram problemas à cultura de hESCs. O uso do Matrigel também levanta problemas clínicos, já que poucos lotes de Matrigel foram relatados como contaminados com o vírus de RNA de camundongo de cadeia única, o RNA vírus desidrogenase elevadora. Além do Matrigel, fibronectina, lamina e colágeno tipo IV também têm sido bons candidatos para a cultura de hESC livre de xeno, e as células podem crescer até 20 passagens. Referência relatou que a MCI derivada da placenta humana foi usada para a cultura de hESCs, e eles encontraram forte estabilidade genética para 40 passagens. Além disso, os hESCs também foram cultivados em meios de cultura sem xenos até 80 passagens .
Sem dúvida, o uso de meios quimicamente definidos juntamente com proteínas melhorou significativamente a cultura de hESCs. Além disso, diferentes proteínas e proteínas recombinantes também foram utilizadas para melhorar a cultura de hESCs em condições livres de xeno. Entre elas estavam E-cadherina, E-cadherina/laminina 521, e inibidores de cinase juntamente com bFGF, que são conhecidos por causar uma forte proliferação de células-tronco em condições livres de xeno. A superfície de leito projetada sinteticamente também foi utilizada para estimular a cultura de células-tronco (Melkoumian et al., 2010); por exemplo, Corning Synthemax Surface, uma superfície de acrilato sintético conjugado com vitronectina, mostrou aumentar não apenas as colônias de hESC, mas também a expansão das células-tronco (Kawase et al., 2014). Wu et al. descreveram recentemente o uso de novo material sintético isolado de proteínas de seda de aranha como um substrato adequado para estimular o cultivo de hESC (Wu et al., 2014). Numerosas superfícies sintéticas à base de polímeros também foram relatadas para apoiar o crescimento e expansão das linhas hESC (Melkoumian et al., 2010; Brafman et al., 2010; Villa-Diazet al., 2013). A lista de diferentes produtos químicos utilizados para melhorar a cultura de hESCs é mostrada na Tabela 2.
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3. Potencial Multilineativo dos hESCs
Uma das características mais importantes dos hESCs é diferenciar em todas as três linhagens ectoderme, mesoderme e endoderme (Figura 3). Como os hESCs são células-tronco pluripotentes, eles têm capacidades únicas para se diferenciar em todos os tipos de células do corpo; por exemplo, os hESCs podem ser diferenciados em neurônios, células cardíacas, hepatócitos e células musculares. Tem sido relatado que os hESCs formam primeiro corpos embrionários que são basicamente estruturados com três camadas germinativas. Esses corpos embrionários são formados por hESCs pluripotentes cultivados em cultura tridimensional (3D) e marcadores genéticos expressos para as três camadas germinativas. Os hESCs pluripotentes têm uma tremenda capacidade de diferenciação (Tabela 3) em células adrenais e queratinócitos, células produtoras de insulina, células neuronais, células cardíacas, células hepáticas e organóides semelhantes a ilhotas. Certos fatores de crescimento como ácido retinóico e fatores de crescimento nervoso estão sendo usados para induzir os HESCs a se diferenciarem em neurônios funcionais. Além disso, alguns fatores de crescimento específicos da linhagem estão sendo usados para a diferenciação em cardiomiócitos, hepatócitos, músculos esqueléticos, células pancreáticas e células renais. Essas células diferenciadas também estão sendo testadas para examinar sua funcionalidade tanto em condições in vitro quanto in vivo. Este potencial multilinear dos HESCs provou ser vital para a terapia baseada em células para tratar diferentes doenças degenerativas. Embora seja fácil diferenciar diferentes tipos de células dos hESCs, é difícil obter um grande número de células maduras diferenciadas para aplicações terapêuticas. Para obter células grandes, maduras e funcionais diferenciadas, os meios de cultura devem conter fatores de crescimento específicos da linhagem. Também é importante gerar grandes quantidades de células a partir dos hESCs, pois elas são necessárias para o transplante de células, e isso pode ser conseguido através da cultura de hESCs e células diferenciadas em um biorreator sob condição de controle .
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4. Teste de hESCs usando modelos In Vitro e In Vivo
Após uma diferenciação bem sucedida dos hESCs em vários tipos de células, o próximo passo lógico é examinar se as células diferenciadas derivadas têm alguma funcionalidade ou não. A funcionalidade das células-tronco e células precursoras diferenciadas ou células maduras foi examinada extensivamente tanto em condições in vitro como in vivo. A funcionalidade de neurônios diferenciados, cardiomiócitos, hepatócitos e outros tipos de células foi testada em vários modelos animais. Foi descoberto que o transplante de neurônios no modelo animal da doença de Parkinson causou uma recuperação parcial da função . O transplante de hESCs e suas células diferenciadas foi testado nos modelos animais de doença cardiovascular, acidente vascular cerebral, diabetes e lesão medular. Entre os animais, pequenos roedores como ratos e camundongos têm sido uma espécie de escolha para o estudo do transplante de células. Além disso, os pequenos roedores são acessíveis sem esforço e podem ser facilmente manipulados tanto cirurgicamente como geneticamente. Apesar dos vários benefícios dos pequenos roedores, a capacidade dos experimentos com camundongos/ratos para prever a eficácia da terapia baseada em células-tronco permanece controversa, já que muitos modelos de camundongos/ratos não representam fenótipos de doenças humanas. Para ultrapassar esta questão, os investigadores começaram a trabalhar nos grandes animais que estão próximos da anatomia e fisiologia humanas. Entre os grandes animais, cães, caprinos, ovinos e primatas não humanos são considerados melhores modelos do que ratos/ratos para os testes com células-tronco. Uma das principais vantagens do uso de animais de grande porte é seu maior tempo de vida, e muitos parâmetros anatômicos e fisiológicos estão muito mais próximos dos humanos. Embora estes modelos animais demonstrem o fornecimento eficaz de células estaminais nos tecidos do hospedeiro, a recuperação funcional e comportamental completa ainda não é alcançada. É necessária mais investigação para desenvolver modelos animais que estejam próximos da doença humana.
Embora este progresso na investigação de hESC, um importante desafio da terapia celular baseada em hESC é a rejeição imunológica alogénica das células derivadas de hESC pelos receptores . Descobriu-se que dentro de uma semana, todas as células estaminais transplantadas morreram devido à forte resposta imunológica do hospedeiro gerada nos animais. Para impedir a morte das células estaminais transplantadas, os animais foram injectados com imunossupressores para suprimir a imunidade desencadeada pelo transplante de células estaminais. Surpreendentemente, quando os animais receberam imunossupressores ou drogas como tacrolimus e sirolimus, os hESCs conseguiram sobreviver apenas durante 28 dias e começaram a morrer depois disso. Embora não saibamos a razão para isso, a falta de compreensão da interação célula-células pode ser uma das razões. É importante testar os hESCs ou células diferenciadas em condições in vitro antes dos testes em animais. Modelos in vitro oferecem melhores oportunidades para estudar a interação célula-célula, migração celular, ou integração celular com uma grande forma detalhada, o que talvez seja muito difícil de estudar nos animais. Este problema poderia ser mitigado por um recente avanço na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através da reprogramação nuclear de células somáticas específicas do paciente com fatores definidos, que poderiam se tornar uma fonte renovável de células autólogas para terapia celular. Uma das principais vantagens dos iPSC para a terapia com células humanas é que os iPSC específicos do paciente são autólogos e, portanto, presumiu-se que as células derivadas deles podem ser transplantadas para o mesmo paciente sem preocupações com a rejeição imunológica. Entretanto, estudos recentes revelando a epigenética anormal, estabilidade genômica e imunogenicidade dos iPSC têm levantado preocupações sobre a segurança da terapia baseada em iPSC .
5. Aplicações terapêuticas dos hESCs
As hESCs contêm muitas promessas para os pacientes que sofrem de doenças degenerativas, várias tentativas têm sido feitas para explorar o potencial terapêutico em humanos. O principal objectivo da terapia baseada em células estaminais é restaurar ou reparar as células ou tecidos do corpo perdidos ou danificados. Para tornar os HESC adequados para aplicações clínicas, as células estaminais derivadas devem ser fabricadas de acordo com a Food Drug Administration (USFDA) dos Estados Unidos, as Current Good Manufacturing Practices (cGMP) e as Guidelines for the Clinical Transplantation of Stem Cells, respectivamente. Os produtos químicos, reagentes, células e máquinas e instrumentos utilizados na cultura de células-tronco devem ser submetidos a controles de segurança e saúde, e todos os processos de fabricação devem ser monitorados e documentados de acordo com as diretrizes do cGMP. Se analisarmos quantas linhas hESC atualmente utilizadas estão de acordo com as diretrizes cGMP, você verá que muitas das linhas hESC falharão em cumprir as diretrizes cGMP, porque muitos hESCs estão expostos a componentes imunogênicos ou patogênicos de animais durante seus estágios de isolamento e propagação. Outra razão para não cumprir as diretrizes do cGMP é que a maioria dos trabalhos de cultura hESC foi realizada em laboratórios de uma universidade, onde muitos desses laboratórios de pesquisa não cumprem as diretrizes do cGMP. Até hoje, apenas alguns poucos pesquisadores puderam produzir linhas de hESC conforme as diretrizes do cGMP .
Considerando os potenciais benefícios comerciais dos hESCs, poucas empresas de biotecnologia também estiveram envolvidas no financiamento da pesquisa com células-tronco com o único objetivo de comercializar produtos com células-tronco. Estas empresas começaram a fabricar hESCs sob condições de cGMP e começaram a testar células-tronco sob cenário clínico. Em 2009, a Geron Corporation (empresa de biotecnologia sediada na Califórnia) solicitou ao FDA o início de seus primeiros ensaios clínicos utilizando células derivadas de hESCs. O ensaio clínico foi iniciado em outubro de 2010, onde 3 pacientes que sofriam de lesão vertebral foram injetados com 1,5 milhões de células precursoras de oligodendrócitos derivadas de hESCs . O estudo foi inesperadamente interrompido e não sabemos o motivo, provavelmente porque os resultados preliminares do estudo mostraram que as células derivadas de hESCs não resultaram em nenhuma melhora notável na lesão vertebral. Além disso, a FDA também aprovou outro estudo para o uso de hESCs na doença de degeneração macular. Outra empresa, Advanced Cell Technology, localizada em Marlborough, Massachusetts, iniciou estudos clínicos usando hESCs. As células foram injetadas nos pacientes que sofriam de distrofia muscular da Stargardt e de degeneração macular seca relacionada à idade. Foram utilizadas as células epiteliais de pigmento retiniano (RPE) derivadas dos hESCs. No estudo, foram administradas células RPE nos pacientes, e após 4 meses de pós-transplante, verificou-se que os pacientes apresentaram pequenas melhorias na função visual sem qualquer indicação de rejeição imunológica ou qualquer sinal de formação de teratoma . As células-tronco também foram testadas em pacientes com diabetes tipo I, onde células precursoras do pâncreas foram administradas aos pacientes .
6. Resumo e Conclusão
Células-tronco embrionárias humanas têm grande potencial terapêutico para o tratamento de várias doenças como câncer, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e diabetes. Tanto estudos in vitro como in vivo sugerem que ainda há esperança de que as futuras células estaminais embrionárias forneçam curas para várias doenças. Mas o sucesso da terapia baseada em células estaminais depende da disponibilidade de células maduras e funcionais. Para obter células maduras e funcionais, seria melhor se as células estaminais fossem cultivadas sob condições de cultura tridimensional (3D). A maioria das linhas hESC são obtidas através de condições de cultura bidimensional (2D). Existem algumas limitações no uso da cultura 2D, já que os hESCs que cresceram em condição 2D não representam células humanas do corpo humano e a maioria dos hESCs de cultura 2D morrem imediatamente após o transplante de células; as células que sobreviveram ainda não conseguem reparar os tecidos do corpo. Esta questão pode ser resolvida, através do cultivo de hESCs em condições 3D, onde as células podem crescer em três direções e as chances de sobrevivência das células irão aumentar após o transplante celular. Outro ponto importante a considerar para o sucesso da terapia baseada em células estaminais é avaliar rigorosamente as células derivadas de células estaminais em modelos animais antes de as testar em humanos. A integração célula-célula, a comunicação célula-célula, a migração celular e a funcionalidade celular precisam de ser avaliadas exaustivamente em modelos animais, utilizando abordagens de ensaio tanto a curto como a longo prazo. A questão relacionada com a formação de trauma e imunorejecção também deve ser resolvida através do desenvolvimento de linhas de células estaminais que não causam imunorejecção e não formam tumor após o transplante. Isto pode ser conseguido silenciando as vias gene/moleculares que desencadeiam a formação do tumor e a imunorejecção, respectivamente. Além disso, a terapia baseada em células também exige muitas células maduras, e os esforços também devem ser direcionados para o isolamento de grande quantidade de células-tronco e seus precursores, trazendo uma nova abordagem e metodologia inovadora. Finalmente, as células estaminais embrionárias humanas ainda possuem uma grande promessa para o tratamento de várias doenças degenerativas assim como aplicações diagnósticas.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Contribuições dos autores
Este manuscrito é aprovado por todos os autores para submissão.
Agradecimentos
Os autores agradecem a toda a gerência do Instituto de Pesquisa e Consultas Médicas (IMRC), Imam Abdulrahman Bin Faisal University, Dammam, Reino da Arábia Saudita, pelo seu apoio e encorajamento.