Desenho do estudo e dos participantes

Leveiamos a cabo um estudo prospectivo de precisão diagnóstica do Ultra tanto no FNA como na biópsia do tecido de gânglios linfáticos em doentes com suspeita de adenite por tuberculose. O estudo foi realizado no Groote Schuur Hospital, um centro académico de referência terciária na Cidade do Cabo, África do Sul. Os participantes elegíveis do estudo foram adultos (≥18 anos), tanto dentro como fora do hospital, encaminhados com gânglios linfáticos aumentados de >20 mm no maior diâmetro localizado na região cervical, axilar ou inguinal. Pacientes em terapia de tuberculose foram inscritos, desde que isto tenha sido dado por <1 mês (sub-análises foram feitas em pacientes em terapia de tuberculose por <24 h). Pacientes com contra-indicações para biópsia das agulhas (plaquetas baixas, outras coagulopatias e risco de sangramento, clinicamente instável, local da biópsia inseguro) foram excluídos. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. O Comitê de Ética em Pesquisa em Humanos da Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Cidade do Cabo, aprovou o estudo.

Patientes vieram de dentro da Groote Schuur e de hospitais de nível secundário e clínicas de dia na área de referência. Foram registados os resultados de investigações anteriores de tuberculose (sputum Xpert ou cultura de tuberculose de qualquer local dentro de 3 meses após o encaminhamento, ou lipoarabinomannan de urina (LAM)). Detalhes do status de HIV, tratamento de tuberculose e ART foram obtidos.

Recolha de dados

Informações demográficas, sintomas, duração dos sintomas, resultado do teste de HIV, e outras investigações de TB realizadas foram registradas na inscrição. O status de desempenho foi classificado de acordo com o Grupo Cooperativo da Europa Oriental (ECOG). O local da biópsia foi registrado, juntamente com outros locais de linfadenopatia. A presença e duração dos sintomas constitucionais (tosse, perda de peso, suores nocturnos) foram especificamente questionados, assim como a duração que o paciente tinha notado a linfadenopatia. O sangue foi coletado para um hemograma completo com diferencial, desidrogenase láctica e estado de HIV e, se positivo, uma contagem de CD4 e uma carga viral para aqueles em ART.

Procedimentos de estudo e coleta de amostras

FNA foi realizado usando uma agulha 22G e seringa de 5 mL; procedimentos de estudo adicional foram determinados pelo volume da amostra aspirada obtida como mostrado na Fig. 1. A biópsia da agulha de núcleo só foi realizada quando < 0,5 mL de material caseoso foi obtido pelo aspirado, devido ao risco de causar um seio drenante. Inicialmente, quando tanto o FNA quanto a biópsia foram realizados em um participante, o Ultra foi realizado apenas no tecido, mas houve uma mudança de protocolo após 25 pacientes e o Ultra foi realizado tanto no FNA quanto no tecido do mesmo paciente. Quando um paciente fez uma biópsia com FNA e uma biópsia com agulha de núcleo, a cultura da tuberculose foi realizada apenas na amostra de tecido. Para o Ultra no FNA, a agulha e a seringa foram enxaguadas num recipiente esterilizado contendo 2 mL de soro fisiológico. Um esfregaço seco ao ar para AFBs foi feito à beira do leito a partir de um segundo FNA. Para a cultura do FNA, o aspirado foi enxaguado dirigido para um meio de cultura de micobactérias (meio de caldo Middlebrook 7H9). A biópsia da agulha do núcleo foi realizada por uma pistola de biópsia automática (BARD Magnum™, CR Bard Inc., Covington, GA, EUA) com uma agulha 14G. Se o gânglio linfático não era obviamente palpável, a biópsia foi realizada sob orientação de ultra-som. Dois ou três núcleos foram enviados em formalina para histologia (10-15 mm de comprimento), um núcleo adicional foi cortado em dois com uma lâmina estéril e enviado para cultura e Ultra, ambos em 2 ml de 0,9% de soro fisiológico. Se todos os exames realizados fossem inconclusivos, a paciente foi submetida a uma biópsia de repetição da agulha do núcleo ou a uma biópsia de excisão a critério do médico tratante.

Procedimentos de estudo

Testes laboratoriais

FNA e amostras de tecidos foram transportadas dentro de 2 h após a coleta para um laboratório centralizado e processadas individualmente usando protocolos padronizados por pessoal de laboratório treinado. A lâmina de esfregaço feita na beira do leito foi examinada por Ziehl-Neelsen (ZN) para AFBs. O tecido obtido pela biópsia da agulha do núcleo foi esmagado com pilão e argamassa. Uma pequena porção foi esfregada em uma lâmina e examinada com uma coloração de ZN para os BAFs. A cultura de micobactérias foi realizada usando um sistema automático de cultura de micobactérias líquidas (BACTEC™ MGIT™ 960; Becton, Dickinson and Company, New Jersey, EUA). Os linfonodos são considerados um local estéril e a descontaminação não foi realizada antes da biópsia líquida. Se o MGIT deu positivo, uma gota foi inoculada em 2% de ágar sangue e incubada durante 24 h para verificar o crescimento bacteriano. Se não houve crescimento bacteriano, o MGIT foi relatado como positivo para micobactérias, a amostra foi descontaminada com hidróxido de sódio (1%) e N-acetil-L-cisteína e, em seguida, repetiu-se a realização do MGIT. Isolados positivos dos meios de cultura foram identificados por coloração ácido-rápida seguida pelo teste MRTBDRplus (Hain LifeScience, Hehren, Alemanha) para confirmar a presença de M. tuberculosis e rifampicina e sensibilidade isoniazida.

Para o Ultra, 1,4 mL de reagente da amostra foi adicionado a 0,7 mL de amostra de tecido aspirado ou triturado. Os resultados foram relatados como: inválido (sem controle de ensaio interno detectado); não detectado; ou detectado (com semi-quantitação: traço, muito baixo, baixo, médio ou alto) e resistência à rifampicina (detectado, não detectado, ou indeterminado). A equipe que realizou o Ultra foi cega aos resultados clínicos e outros resultados microbiológicos.

A revisão histológica foi realizada por um patologista anatômico qualificado que foi cego aos resultados do ULTRA e não teve acesso à cultura, mas teria sido capaz de ver os resultados do AFBs em microscopia. Se granulomas fossem identificados, uma coloração ZN separada era realizada pelo patologista e uma coloração PAS para fungos.

Definições de casos e análise estatística

Atribuímos os participantes a uma das três categorias diagnósticas com base em investigações clínicas, histológicas e microbiológicas. Tuberculose definida (cultura positiva em FNA/ tecido para M. tuberculosis OU AFBs identificados em FNA/tecido) Tuberculose provável (nenhum outro diagnóstico que explicaria a linfadenopatia com um ou mais de: caseação macroscópica em FNA/tecido OU tuberculose confirmada microbiologicamente em um local diferente do gânglio linfático (por exemplo, pulmonar) OU granulomas em FNA/tecido). A terceira categoria não era a tuberculose (não preenchia os critérios para as outras duas categorias). A precisão diagnóstica Ultra também foi relatada separadamente usando cultura positiva apenas como padrão de referência.

A estimativa do tamanho da amostra nos estudos de precisão diagnóstica depende da prevalência da doença . Esperávamos uma alta prevalência de tuberculose com base em um estudo piloto que realizamos de biópsia de agulha do núcleo em pacientes HIV positivos, 92% dos quais tinham linfadenite tuberculosa, mas a proporção de pacientes com tuberculose em nosso estudo foi menor do que o esperado (40%) em uma fase piloto de nosso estudo. Estimamos que a sensibilidade e especificidade do Ultra seria de cerca de 90% com base na meta-análise da Cochrane. Com uma prevalência de 40% de tuberculose, é necessário um tamanho de amostra de 87 para 95% de largura de IC de 10% e com sensibilidade e especificidade de 90% . Inflamos o tamanho da amostra para 100 por causa das incertezas sobre a precisão diagnóstica do Ultra.

Calculamos sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo (VNP), valor preditivo positivo (VPP) e rações de probabilidade definindo verdadeiros ou falsos positivos e verdadeiros ou falsos negativos em relação ao padrão de referência composto de tuberculose provável ou definitiva para nossa análise primária. Como análises secundárias também determinamos a precisão do Ultra usando apenas a cultura micobacteriana como padrão de referência. Os dados foram introduzidos numa base de dados REDCap® e analisados utilizando o pacote de software STATAv14 (StataCorp, College Station, Texas, EUA). As características clínicas de base foram comparadas usando o teste de qui-quadrado ou o teste exato de Fisher para variáveis categóricas e o teste de Kruskal-Wallis para variáveis contínuas. Contamos os testes inválidos (ou seja, Ultra-error) como resultados negativos. Este estudo é relatado de acordo com as Normas para Relato de Estudos de Precisão Diagnóstica Diretrizes .