PAPELORIGINAL

Estudo bioquímico e farmacológico do veneno da aranha lobo Lycosa singoriensis

Liu ZHI; Qian WII; Li JI; Zhang YI; Liang SI

>

Clube de Ciências da Vida, Universidade Normal de Hunan, Changsha, China
II Centro Administrativo de Pesquisa Básica, Ministério da Ciência e Tecnologia, China

Correspondência a

ABSTRACT

>

A aranha lobo Lycosa singoriensis é uma aranha grande e venenosa distribuída pelo noroeste da China. Como outros venenos de aranha, o veneno da aranha-lobo é um cocktail químico. O seu teor proteico é de 0,659 mg de proteína/mg de veneno bruto, conforme determinado pelo método Lowry. A análise MALDI-TOF revelou que os peptídeos venenosos são altamente diversificados e podem ser divididos em três grupos caracterizados por três faixas moleculares independentes: 2.000 a 2.500 Da, 4.800 a 5.500 Da e 7.000 a 8.000 Da, respectivamente. Esta distribuição molecular difere substancialmente das da maioria dos venenos de aranha estudados até agora. Este veneno de aranha lobo tem baixa ação neurotóxica em ratos, mas pode induzir hemólise de eritrócitos humanos. Além disso, o veneno mostra atividade antimicrobiana contra células procarióticas e eucarióticas.

Palavras-chave: aranha, Lycosa singoriensis, veneno bruto, MALDI-TOF, atividade antimicrobiana.

INTRODUÇÃO

Existem cerca de 39.000 espécies de aranha descritas, com um número ainda maior aguardando caracterização. Quase todas as aranhas são predadoras e possuem glândulas venenosas. A principal proposta dos venenos das aranhas é matar ou paralisar as presas. Os venenos de aranha são coquetéis químicos complexos nos quais os peptídeos são os principais constituintes da maioria dos venenos de aranha, exceto os das aranhas viúvas negras que contêm uma proporção elevada, superior a 100 kD de proteínas (1-3). Os peptídeos de veneno de aranha são produzidos de forma combinatória, o que leva a um total estimado de cerca de 1,5 milhões de peptídeos de veneno de aranha. Consequentemente, os venenos de aranha são uma rica fonte de novos compostos farmacologicamente e agroquimicamente interessantes que têm recebido maior atenção de farmacologistas e bioquímicos nos últimos anos. No entanto, durante as últimas décadas, apenas alguns poucos venenos de aranha foram estudados com detalhes suficientes, e portanto menos de 0,01% dos peptídeos de veneno de aranha foram identificados até agora (4-7).

A aranha lobo Lycosa singoriensis é uma grande aranha distribuída pelo noroeste da China. A aranha fêmea adulta tem um comprimento corporal de 28 a 40 mm (35±6 mm) e um peso corporal de 2,6 a 7 g (Figura 1). Esta aranha peluda vive em buracos subterrâneos. A sua toca, forrada com um tubo de seda, tem um diâmetro de 2 a 4 cm e um comprimento de 30 a 60 cm, e a entrada da toca é muitas vezes coberta com rede de seda. A aranha passa o dia amontoada no fundo do buraco, enquanto sobe o tubo da seda e se esconde perto da entrada da toca, esperando a presa à noite. Depois de conseguir apanhar as vítimas, a aranha leva-as para o buraco. Em muitos casos, resíduos de pequenos insetos são encontrados no fundo da toca. A aranha lobo Lycosa singoriensis é também uma aranha venenosa e agressiva. Em 2000, foi relatado que houve picadas de aranha-lobo para humanos e outros animais na área norte da província de Xinjiang. Segundo registros clínicos, a maioria das picadas de aranha causou efeitos aparentes, incluindo marcas vermelhas e dor ao redor dos locais da mordida (8, 9).

Neste estudo, relatamos as propriedades bioquímicas e farmacológicas do veneno da aranha lobo Lycosa singoriensis. Comparado com muitos outros venenos de aranha estudados até agora, este veneno de aranha tem algumas propriedades distintas, o que o torna uma fonte útil para o rastreamento de chumbo de drogas e para o estudo da biodiversidade dos peptídeos de veneno de aranha.

MATERIAIS E MÉTODOS

Aranhas e coleta de veneno

Aranhas Lycosa singoriensis fêmeas adultas foram coletadas na província de Xinjiang, China, mantidas em baldes plásticos que eram cobertos com redes plásticas e recebia água diariamente. Fígados de porco cortados e vermes foram usados para alimentar os animais. Como muitas outras aranhas grandes (10, 7), Lycosa singoriensis tornam-se rapidamente agressivas quando provocadas por um pedaço de tubo de plástico. Elas agarram bem o tubo e depois as suas presas de veneno perfuram o tubo e injectam veneno no seu interior. Isto evita a necessidade de estimulação eléctrica, que pode contaminar o veneno com enzimas tanto da saliva como dos fluidos digestivos. O uso deste método poderia produzir cerca de 50 mg de veneno de aproximadamente 300 aranhas Lycosa singoriensis, permitindo assim a exploração das propriedades bioquímicas e farmacológicas deste veneno de aranha. O veneno bruto é um líquido claro e incolor, facilmente solúvel em água e foi coletado a cada duas semanas. O veneno bruto liofilizado foi armazenado a -20°C antes da análise.

SDS-PAGE Análise do veneno bruto

Electroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) no veneno coletado foi realizada sob condições desnaturadas em um gel de laje de poliacrilamida a 10%. Cem microgramas de veneno liofilizado foram usados para eletroforese, e as proteínas separadas no gel foram visualizadas por coloração G250.

MALDI-TOF Análise do veneno bruto

A impressão digital do veneno bruto foi determinada usando uma matriz de dessorção/ionização de laser assistida por espectrometria de massa MALDI-TOF (Voyager-DE STR Biospectometry® workstation, Applied Biosystems, EUA). A ionização foi obtida por irradiação com laser de nitrogênio (337 nm) a uma tensão de aceleração de 20kV; α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (CCA) foi empregado como matriz.

O efeito do veneno bruto sobre as preparações isoladas de nervos-synapse

Três tipos de preparações isoladas de nervos-synapse – diafragma frênico do nervo do rato, vaso do rato deferente e coração do sapo – foram usadas para investigar a atividade farmacológica do veneno bruto. Os experimentos de preparação do nervo-diafragma frênico do rato foram realizados de acordo com Bülbring (11). Os ensaios de Vas deferens e coração de sapo foram realizados de acordo com Liang et al. (12).

Ensaio hemolítico

Atividade hemolítica do veneno cru foi testada com heparinização dos glóbulos vermelhos humanos, enxaguados três vezes em 5 mL de fosfato salino tamponado (PBS – 50 mM NaH2PO4 e 150 mM NaCl, pH 7,2) e centrifugado por 5 minutos a 3.000 rpm. Os eritrócitos foram então incubados à temperatura ambiente durante 1 hora em água desionizada (controle positivo), em PBS (branco), ou com venenos a várias concentrações (3,1 a 20 mg/mL) em PBS. As amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante foi separado do sedimento, e sua absorvância foi medida a 570 nm.

Atividade antimicrobiana do veneno cru

Bactériasix (Bacillus cereus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus albus e E. coli DH5) e dois fungos (Saccaromyces cerevisae e Candida albicans) foram cultivados respectivamente no meio de cultura até atingir a fase exponencial com uma absorvância a 600 nm de 0,3 a 0,8. Cinquenta microlitros do meio de cultura foram espalhados uniformemente em três placas de ágar solidificado. As placas foram completadas com 1,5% de agarose/médio deitado em placas de Petri estéreis de 100 × 20 mm. Um papel filtro de 6 mm de diâmetro cobriu as placas. Cinco microlitros de solução venenosa, em soro fisiológico normal, em várias concentrações, foram colocados sobre o papel filtro. Após incubação a 37°C durante a noite, os efeitos do veneno bruto foram registrados como círculos claros no gramado bacteriano no papel de filtro.

Por isso, neste bioensaio, soluções de veneno bruto em várias concentrações (3 mg/mL, 6 mg/mL e 12 mg/mL) foram lançadas no papel de filtro, e um círculo claro foi detectável no papel se o veneno nessa concentração tivesse inibido o crescimento microbiano.

RESULTA E DISCUSSÃO

Bioquímica Caracterização do Veneno Bruto

Foi encontrado que cada miligrama de veneno bruto contém cerca de 0,659 mg de proteína/peptídeos. Como mostrado na Figura 2, as proteínas de alta massa molecular do veneno bruto estão distribuídas principalmente entre massas moleculares variando de 14 a 31.000 Da, com uma banda proteica espessa próxima a 20.000 Da e outra banda evidente próxima a 14.000 Da. Uma banda grossa também é visível no topo do painel do gel SDS-PAGE que consiste nos peptídeos com massas moleculares inferiores a 10.000 Da. As proteínas/peptídeos distribuídos nas duas ligações espessas são os componentes mais abundantes do veneno bruto, que correspondem a 80% do componente proteico do veneno bruto.

>>

Recentemente, a espectrometria de massa MALDI-TOF foi aplicada para elucidar a complexidade dos peptídeos do veneno. Além disso, com o rápido desenvolvimento da espectrometria de massa, esta tecnologia tem sido amplamente utilizada na pesquisa de venenos (5, 13). Por exemplo, Pierre Escoubas et al. (5) pintaram um quadro de veneno para conceituar a complexidade dos venenos de aranha da teia de funil australiana utilizando uma abordagem combinada de cDNA e espectrometria de massa. Seus estudos demonstram que os venenos dessas aranhas contêm muitas centenas de peptídeos que seguem uma distribuição bimodal, com a maioria dos peptídeos na faixa de 3.000 a 5.000 Da mass, e um segundo grupo menos pronunciado na faixa de 6.500 a 8.500 Da. Esta distribuição de massas moleculares é análoga à observada anteriormente para um grande número de venenos de tarântula (4). Resultados similares também foram encontrados em nossos estudos anteriores com venenos das aranhas de tarântula chinesa Ornithoctonus huwena, Ornithoctonus hainana e Chilobrachys jingzhao (14-16).

Como apresentado na Figura 3, a análise por espectrometria MALDI-TOF do veneno bruto de Lycosa singoriensis demonstra que a distribuição de massa molecular é analogamente observada na faixa de 1.000 a 10.000 Da. No entanto, ao contrário das espécies acima mencionadas, o veneno de Lycosa singoriensis pode ser dividido em três grupos por suas massas. O primeiro grupo compreende peptídeos que possuem massas moleculares entre 2.000 e 2.500 Da, o que indica que eles possuem cerca de 20 resíduos de aminoácidos. Esta faixa de massa molecular raramente tem sido observada na maioria dos venenos de aranha estudados até o momento. O segundo grupo inclui principalmente peptídeos com massas moleculares na faixa de 4.800 a 5.500 Da, sugerindo que eles são compostos de cerca de 50 resíduos de aminoácidos. O terceiro grupo consiste em peptídeos com massa entre 7.000 e 8.000 Da, o que corresponde a mais de 60 resíduos de aminoácidos. Estima-se que os peptídeos distribuídos nos dois últimos grupos são a maioria dos peptídeos venenosos.

Interessantemente, poucos peptídeos possuem massas moleculares entre 3.000 e 5.000 Da. Paradoxalmente, os peptídeos nesta faixa de massa são o componente mais abundante em muitos outros venenos de aranha. Estudos adicionais seriam necessários para elucidar essas discrepâncias, o que pode contribuir para a compreensão do mecanismo evolutivo dos peptídeos do veneno da aranha. O estudo atual contribui para provar que os peptídeos de Lycosa singoriensis são altamente diversos.

Análise das bibliotecas de cDNA de células venenosas produziu mais de 200 sequências de peptídeos semelhantes a toxinas. A distribuição em massa destes peptídeos derivados de sequências de cDNA é consistente com a observada pela espectrometria de MALDI-TOF. Além disso, a análise das sequências revelou que os peptídeos do primeiro grupo não possuem resíduos de cisteína e os do segundo grupo contêm 4 ou 5 ligações de dissulfeto, enquanto que os do último grupo possuem mais de 5 ligações de dissulfeto (dados não publicados). A maioria das toxinas do peptídeo aranha identificadas até agora geralmente tem 3 ou 4 ligações de dissulfeto, e suas estruturas 3D adotam o clássico motivo inibidor do nó de cistina. Consequentemente, há razões para acreditar que alguns peptídeos do veneno de Lycosa singoriensis possuiriam um novo tema estrutural.

Caracterização Farmacológica do Veneno Bruto

O veneno bruto, em uma dose alta de 200 µg/mL, não poderia bloquear a contração estimulada eletricamente da preparação do diafragma do nervo frênico do rato (n = 5). Também mostrou baixo efeito sobre a resposta de contração do vaso do rato deferente. A concentração de 200 µg/mL de veneno bruto só poderia inibir parcialmente a resposta de contração por 20 minutos (n = 5) (Figura 4 – A). Em contraste, o veneno cru da aranha O. huwena, na mesma concentração, foi capaz de bloquear rapidamente a resposta de torção da mesma preparação do nervo-diafragma ou vaso de rato deferente (dados não mostrados). No entanto, o veneno bruto de Lycosa singoriensis teve efeito significativo na contração do coração do sapo. Na presença de 100 µg/mL de veneno cru, a freqüência e magnitude do batimento cardíaco foram potentemente aumentadas (n = 5) (Figura 4 – B). Isto sugere que o veneno cru contém alguns compostos que são cardiotônicos.

Correntemente, os agentes cardiotônicos são classificados em três classes baseadas em seus mecanismos de ação subcelular, ou seja, agentes que agem através de mecanismos a montante (mobilizadores Ca2+), bem como mecanismos centrais e a jusante (sensibilizadores Ca2+). Estes agentes induzem um efeito inotrópico positivo ao elevarem a concentração intracelular de íons Ca2+ (17). Até o momento, não há relato de um efeito cardiotônico dos venenos de aranha-lobo, enquanto nenhum composto cardiotônico ainda foi purificado e caracterizado a partir destes venenos. Portanto, é importante investigar os compostos cardiotônicos do veneno de Lycosa singoriensis.

A atividade hemolítica do veneno bruto foi determinada pelo uso de eritrócitos humanos frescos. Como mostrado na Figura 5 (A), o veneno bruto perturbou os eritrócitos humanos de uma maneira dose-dependente. Sua concentração efetiva de inibição de 50% (EC50) é de 1,25 mg/mL.

Como relatado por Budnik et al. (18), o veneno bruto de Lycosa singoriensis contém peptídeos antimicrobianos (denominados licocitinas 1, 2 e 3) que podem inibir o crescimento de bactérias e fungos gram-positivos e gram-negativos em concentrações micromolares. Portanto, nós testamos a atividade antimicrobiana do veneno bruto contra células procarióticas e eucarióticas através do ensaio de inibição do crescimento de placas. Sob nossas condições de bioensaio, as cepas celulares mais sensíveis ao veneno bruto foram, especificamente, Bacillus subtilis e Staphylococcus sp, nos quais o crescimento foi potentemente inibido a 3 mg/mL. O veneno também agiu fortemente contra Corynebacterium glutamicum e Micrococcus luteus mas fracamente contra uma das estirpes de fungos (Candida albicans). Entretanto, o veneno bruto não teve efeito detectável em E. coli e Saccaromyces cerevisae mesmo na alta concentração de 12 mg/mL (Figura 5 – B).

Durante os últimos dez anos, muitos peptídeos antimicrobianos foram identificados a partir de venenos de aranha. As lincotoxinas I e II foram identificadas a partir do veneno da aranha-lobo Lycosa carolinensis. Ambas são peptídeos antimicrobianos lineares que demonstram o caráter anfíptico α-helix típico dos peptídeos formadores de poros. Seu mecanismo de formação de poros foi ainda verificado por seu efluxo promotor de íons de cálcio de sinaptosomas (19). Posteriormente às licotoxinas, também se constatou que as cupienninas (20-22) e as oxiopininas (23, 24), provenientes do veneno das aranhas lobo Cupiennus salei e Oxyopes kitabensis, respectivamente, tinham atividades antimicrobianas. Mais recentemente, sete novos peptídeos lineares antimicrobianos e citolíticos chamados latarcinas foram purificados a partir do veneno da aranha Lachesana tarabaevi. Além disso, cinco novos peptídeos que compartilham similaridade estrutural considerável com as latarcinas purificadas foram preditos a partir da base de dados da etiqueta sequencial expressa para a glândula do veneno da aranha (25).

Estes peptídeos de venenos de aranha pertencem ao catiônico linear α-epeptídeos antimicrobianos helicoidais. Esta classe de peptídeos antimicrobianos compartilha algumas características comuns, como inibir o crescimento microbiano em baixas concentrações micromolares e formar formação anfíptica e catiônica helicoidal em ambientes hidrofóbicos. Durante as últimas décadas, um grande número de peptídeos antimicrobianos, incluindo os catiônicos lineares α – peptídeos antimicrobianos catiônicos helicoidais – foram descobertos tanto em animais como em plantas. Esses peptídeos são tipicamente compostos de 12 a 45 aminoácidos e desempenham papéis importantes no sistema imunológico inato da maioria dos organismos vivos (26-28). A maioria deles pode matar microorganismos com as seguintes quatro características: toxicidade seletiva, matança rápida, amplo espectro antimicrobiano, e nenhum desenvolvimento de resistência (29-31).

Em resumo, relatamos novos achados bioquímicos e farmacológicos sobre o veneno da aranha lobo Lycosa singoriensis. As propriedades distintas dos peptídeos deste veneno fazem dele um modelo ideal para o estudo dos mecanismos evolutivos dos peptídeos do veneno da aranha. O estudo farmacológico deste veneno é útil para purificar e caracterizar os peptídeos bioactivos em estudos posteriores.

ACKNOWLEDGMENTS

Este trabalho foi apoiado pelos Projectos da Fundação Nacional da Ciência (30430170 e 30700127).

1. Corzo G, Escoubas P. Toxinas farmacologicamente ativas do peptídeo aranha. Cell Mol Life Sci. 2003;60(11):2409-26.

3. Rei GF. O maravilhoso mundo das aranhas: prefácio à edição especial do Toxicón sobre os venenos de aranha. Toxicón. 2004;43(5):471-5.

4. Escoubas P, Rash L. Tarântulas: farmacêuticos de oito patas e químicos combinatórios. Toxicodependentes. 2004;43(5):555-74.

5. Escoubas P, Sollod B, King GF. Venom landscapes: mineração da complexidade dos venenos de aranha através de uma abordagem combinada de cDNA e espectrometria de massa. Toxicónico. 2006;47(6):650-63.

6. Sollod BL, Wilson D, Zhaxybayeva O, Gogarten JP, Drinkwater R, King GF. Os aracnídeos foram os primeiros a usar bibliotecas de peptídeos combinatórios? Peptídeos. 2005;26(1):131-9.

7. Tedford HW, Sollod BL, Maggio F, King GF. Aranhas de teias de funil australianas: mestre químico de insecticidas. Toxicones. 2004;43(5):601-18.

8. Lu DL, Zhang DF. Dois tipos de aranhas venenosas em Xinjiang e prevenção e cura para a mordida da aranha. Chin J Zool. 2001;36(5):40-2.

8. Observação inicial sobre o hábito de vida de Lycosa singorensis. Chin J Zool. 2004;39:63-7.

10. Liu Z, Dai J, Dai L, Deng M, Hu Z, Hu W, Liang S. Função e estrutura da solução de huwentoxin-X, um bloqueador específico dos canais de cálcio tipo N, da aranha chinesa Ornithoctonus huwena. J Biol Chem. 2006;281(13):8628-35.

11. Bulbring E. Observações sobre a preparação isolada do diafragma do nervo frênico do rato. Br J Pharmacol Chemother. 1946;1(1):38-61.

12. Liang SP, Chen XD, Shu Q, Zhang Y, Peng K. A actividade pré-sináptica da huwentoxina-I, uma neurotoxina do veneno da aranha da ave chinesa Selenocosmia huwena. Toxicona. 2000;38(9):1237-46.

13. Guette C, Legros C, Tournois G,Goyffon M, Célérier ML. Perfil de peptídeos por dessorção laser assistida por matriz/tempo de ionização da espectrometria de massa da glândula de tarântula parahybana Lasiodora. Toxicone. 2006;47(6):640-9.

14. Liang S. Uma visão geral das toxinas peptídeas do veneno da aranha da ave chinesa Selenocosmia huwena Wang . Toxicona. 2004;43(5):575-85.

15. Liao Z, Cao J, Li S, Yan X, Hu W, He Q, Chen J, Tang J, Xie J, Liang S. Análise proteómica e peptidómica do veneno da tarântula chinesa Chilobrachys jingzhao. Proteómica. 2007;7(11):1892-907.

16. Yuan C, Jin Q, Tang X, Hu W, Cao R, Yang S, Xiong J, Xie C, Xie J, Liang S. Caracterização proteómica e peptidómica do veneno da aranha da ave chinesa, Ornithoctonus huwena Wang. J Proteome Res. 2007;6(7):2792-801.

17. Endoh M. A Na+ channel agonist: um potencial agente cardiotônico com um novo mecanismo? Br J Pharmacol. 2004;143(6):663-5.

18. Budnik BA, Olsen JV, Egorov TA, Anisimova VE, Galkina TG, Musolyamov AK, Grishin EV, Zubarev RA. De novo sequenciamento de peptídeos antimicrobianos isolados das glândulas venenosas da aranha-lobo Lycosa singoriensis. J Espectrómetro de massa. 2004;39(2):193-201.

19. Yan L, Adams ME. Lycotoxins, peptídeos antimicrobianos do veneno da aranha-lobo Lycosa carolinensis. J Biol Chem. 1998;273(4):2059-66.

20. Kuhn-Nentwig L, Dathe M, Walz A, Schaller J, Nentwig W. Cupiennin 1d: a atividade citolítica depende do N-terminus hidrofóbico e é modulada pelo C-terminus polar. FEBS Lett. 2002;527(1-3):193-8.

21. Kuhn-Nentwig L, Muller J, Schaller J, Walz A, Dathe M, Nentwig W. Cupiennin 1, uma nova família de peptídeos antimicrobianos altamente básicos no veneno da aranha Cupiennius salei (Ctenidae). J Biol Chem. 2002;277(13):11208-16.

22. Pukala TL, Doyle JR, Llewellyn LE, Kuhn-Nentwig L, Apponyi MA, Separovic F, Bowie JH. Cupiennin 1a, um peptídeo antimicrobiano do veneno da aranha neotropical errante Cupiennius salei, também inibe a formação de óxido nítrico por óxido nítrico sintetase neuronal. FEVS J. 2007;274(7):1778-84.

23. Corzo G, Villegas E, Gomez-Lagunas F, Possani LD, Belokoneva OS, Nakajima T. Oxyopinins, grandes peptídeos anfhipáticos isolados do veneno da aranha lobo Oxyopes kitabensis com propriedades citolíticas e cooperatividade inseticida positiva com neurotoxinas de aranha. J Biol Chem. 2002;277(26):23627-37.

24. Nomura K, Corzo G. O efeito da ligação de peptídeos antimicrobianos derivados de aranha, oxiopininas, sobre as membranas lipídicas. Biochim Biophys Acta. 2006;1758(9):1475-82.

25. Kozlov SA, Vassilevski AA, Feofanov AV, Surovoy AY, Karpunin DV, Grishin EV. Latarcinas, antimicrobianos e peptídeos citolíticos do veneno da aranha Lachesana tarabaevi (Zodariidae) que exemplificam a diversidade biomolecular. J Biol Chem. 2006;281(30):20983-92.

26. Brogden KA. Antimicrobianos peptídeos: formadores de poros ou inibidores metabólicos em bactérias? Nat Rev Microbiol. 2005;3(3):238-50.

27. Brown KL, Hancock RE. Peptídeos catiónicos de defesa do hospedeiro (antimicrobianos). Curr Opinião Immunol. 2006;18(1):24-30.

28. Zasloff M. Antimicrobianos peptídeos de organismos multicelulares. Natureza. 2002;415(6870):389-95.

29. Matsuzaki K. Por que e como as interações peptídeo-lípidos são utilizadas para autodefesa? Magaininas e taquipleinas como arquétipos. Biochim Biophys Acta. 1999;1462(1-2):1-10.

30. Mcphee JB, Hancock RE. Função e potencial terapêutico dos peptídeos de defesa do hospedeiro. J Pept Sci. 2005;11(11):677-87.

31. Mookherjee N, Hancock RE. Cationic host defence peptides: innate immune regulatory peptides as a new approach for treating infections. Cell Mol Life Sci. 2007;64(7-8):922-33.

Correspondência a:
Songpiing Liang
College of Life Sciences, Hunan Normal University
Changsha, Hunan, 410081, China.
Telefone: +86 731 8872556. Fax: +86 731 8861304.
Email: [email protected].