Estabelecimento de um Modelo de Xenogrupo de Câncer Gástrico Humano em Ratos Imunocompetentes Usando o Microcarrier-6
Abstract
Câncer gástrico está entre os tumores malignos mais comuns do trato digestivo. O estabelecimento de um modelo animal robusto e confiável é a base para o estudo da patogênese do câncer. O presente estudo estabeleceu um modelo de carcinoma gástrico em camundongos através da inoculação de células MKN45 imunocompetentes em camundongos com microtransportador. Sessenta camundongos C57BL/6 machos foram divididos aleatoriamente em três grupos: um grupo 2D, um grupo portador vazio e um grupo 3D, de acordo com o sistema de cocultura do MKN45 e o microtransportador. Os modelos de ratos foram estabelecidos por injeção hipodérmica. O tempo de desenvolvimento do tumor, a taxa de formação do tumor e as características patológicas foram observados em cada grupo. No grupo 3D, o tempo de tumorigenese foi curto, enquanto a taxa de formação tumoral foi alta (75%). Não houve formação tumoral detectável nem no grupo 2D nem no grupo portador vazio. Tanto a H&E quanto a coloração imunohistoquímica do xenoenxerto tumoral mostraram evidência característica de neoplasias gástricas humanas. O presente estudo estabeleceu com sucesso um modelo de carcinoma gástrico humano em camundongos imunocompetentes, que fornece um novo e valioso modelo animal para a pesquisa e desenvolvimento de drogas anticâncer.
1. Introdução
Com aproximadamente um milhão de casos recentemente diagnosticados anualmente, o câncer gástrico representa uma séria ameaça à saúde e à vida de pessoas em todo o mundo . Entretanto, a patogênese e os mecanismos da metástase do câncer gástrico ainda não foram completamente esclarecidos. Os modelos in vivo do câncer gástrico são ferramentas essenciais para a exploração das características biológicas deste câncer e das potenciais novas opções de tratamento. Foram estabelecidos modelos de xenoenxertos de câncer gástricos derivados do homem em ratos imunodeficientes, como ratos nus e camundongos com imunodeficiência combinada grave. No entanto, os ratos imunodeficientes não são facilmente criados e são caros. É importante salientar que os ratos imunodeficientes não reflectem os papéis importantes do sistema imunitário no desenvolvimento e progressão do tumor. Assim, o estabelecimento de um novo modelo de xenoenxerto de câncer gástrico humano em camundongos com um sistema imunológico normal é de grande importância. No presente estudo, o MKN45, células cancerígenas gástricas humanas e o microcarrier foram coculurados, e ratos imunocompetentes foram subsequentemente inoculados com a suspensão, estabelecendo com sucesso um novo xenoenxerto derivado do câncer gástrico humano.
2. Materiais e Métodos
2.1. Materiais
Roswell Park Memorial Institute- (RPMI-) 1640 meio de cultura, tripsina, soro fetal bovino e penicilina foram adquiridos de Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Antigénio de carboidrato de coelho anti-humano 199 (CA199), citoceratina 7 (CK-7) e homeobox 2 (CDX-2) monoclonal tipo caudal foram comprados à Abcam (Cambridge, UK). O microcarrier-6 foi comprado da Elyon Biotechnologies LLC (Gaithersburg, MD, EUA).
2.2. Experimental Animals
Sixty 6-8 semanas- macho C57BL/6 ratos de 22-25 g foram comprados à Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. (número de licença: SCXK 20140007, Província de Shandong, China) e alojados num centro animal específico sem patógenos no Hospital Afiliado da Faculdade de Medicina de Jining (Província de Shandong, China). Todas as experiências com animais foram realizadas com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Afiliado da Universidade Médica de Jining e realizadas de acordo com as diretrizes aprovadas.
2.3. Linhas Celulares
A linha de células MKN45 de câncer gástrico humano foi adquirida do Banco de Células da Academia Chinesa de Ciências (Shanghai, China) e cultivada em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal bovino e 100 U/mL de penicilina a 37°C com 5% de CO2. O meio de cultura foi trocado a cada 24 h, e as células colhidas por digestão com 0,25% de tripsina.
2,4. Estabelecimento de um modelo tridimensional (3D) de cultura de células tumorais
O microcarrier-6 foi embebido em etanol 75% por 24 h, lavado três vezes com 1x tampão fosfato salino e incubado em meio RPMI-1640 por 24 h. Posteriormente, o microcarrier-6 foi modificado através de uma incubação de 3 h com fator alfa derivado de células estromais-1 (SDF-1α) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), ambos a uma concentração de 100 ng/mL. As células na fase de crescimento logarítmico foram contadas após a coloração azul-tripano e ajustadas a uma concentração de quando a viabilidade foi >95%. A suspensão celular MKN45 foi misturada com o microcarrier-6 modificado e incubada a 37°C com 5% de CO2 por mais 24 h para saturar as células com o microcarrier, como observado por microscopia (Figuras 1(c) e 1(d)).
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2.5. Agrupamento Animal
Os 60 ratos C57BL/6 foram divididos aleatoriamente em três grupos (20 ratos por grupo): o grupo bidimensional (2D) (animais inoculados com contendo ), o grupo portador vazio (animais inoculados com contendo 30 μg microcarrier-6), e o grupo 3D (animais inoculados com contendo e 30 μg microcarrier-6).
2.6. Animal Model Generation
O modelo 3D de cultura de células tumorais foi estabelecido no primeiro dia do experimento e incubado por 24 h. No segundo dia, os complexos de cultura de células-microcarrier foram lavados três vezes e suavemente misturados para ajustar a concentração às células e 300 μg microcarrier-6 por 1 mL de suspensão, e colocados em gelo para uso posterior. As células MKN45 na fase de crescimento logarítmico foram colhidas, tripsinizadas, lavadas três vezes com , e ressuspendidas em uma concentração de , que foi colocada em gelo para uso posterior. O microcarrier-6 modificado foi lavado três vezes com , ressuspenso em uma concentração de 300 μg/mL, e colocado em gelo para uso posterior. Cada rato dos três grupos experimentais foi inoculado com 100 μL da solução correspondente sob a crista axilar direita.
2.7. Detecção de Indicadores e Exame Patológico
Inoculação subsequente, os ratos foram alojados separadamente por grupo, e o apetite, as actividades e o peso diários foram monitorizados. O tempo de formação e volume tumoral local em cada rato foi registrado. Uma vez que os tumores eram visíveis, o diâmetro longo (a) e curto (b) de cada tumor era medido diariamente, e o volume do tumor era calculado de acordo com a fórmula de volume tumoral : . Os ratos portadores de tumores foram sacrificados em três lotes: 10, 20 e 30 dias de pós-intinoculação. Os tecidos tumorais foram completamente removidos de cada rato, e a qualidade, textura e grau de infiltração e necrose tumoral foram registrados. Os tecidos tumorais foram posteriormente fixados em formaldeído neutro tamponado a 4% e corados com hematoxilina e eosina (H&E). A técnica de coloração EnVision em duas etapas foi utilizada para imuno-histoquímica. Os resultados da coloração foram determinados com base na coloração citoplasmática granular positiva do tumor. A coloração negativa (-ve) foi definida como <5% de células coradas positivamente, e a coloração positiva (+ve) foi definida como ≥5% de células coradas positivamente.
2,8. Análise estatística
O software SPSS 13.0 (IBM SPSS, Chicago, IL, EUA) foi usado para análise estatística. Os dados de medição são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). As diferenças entre os valores médios de cada grupo foram comparadas utilizando a análise de variância unidirecional (ANOVA) ou o teste de Kruskal-Wallis, conforme apropriado. é considerada uma diferença estatisticamente significativa.
3. Resultados
3,1. Estabelecimento do Sistema de Cultura de Tumor In Vitro MKN45 3D Usando o Microcarrier-6
O microcarrier-6 é um novo microcarrier composto de polímeros orgânicos positivamente eletrizáveis com uma estrutura porosa de várias camadas. O tamanho dos poros, a densidade da carga superficial positiva e o tamanho do microcarrier-6 podem ser ajustados por síntese química. O microcarrier-6 tipo C, pequeno volume, tamanho do poro grande e muitas vezes dobrado no espaço, é usado principalmente para experimentos de cultura celular 3D e sensibilidade a drogas (Figuras 2(a) e 2(b)). O microcarrier-6 tipo M, de grande volume, tamanho pequeno dos poros e baixo tempo de dobra interna, é usado principalmente para pesquisa de engenharia de tecidos (Figuras 2(c) e 2(d)). O microcarrier-6 do tipo C foi utilizado em nosso estudo. O microcarrier-6 é um composto orgânico puro que não é propenso a contaminação, não tem impurezas, é baixo em imunogenicidade e metabolismo e é altamente biocompatível, proporcionando um microambiente estável para o crescimento celular (Figuras 2(a)-2(d)). Além disso, o microcarrier-6 está diretamente embutido na pele dos ratos, induzindo o crescimento dos vasos sanguíneos (Figuras 2(e) e 2(f)), o que pode fornecer suprimento de sangue suficiente para o crescimento de células tumorais. As células MKN45 aderiram rapidamente no ambiente 2D, e a morfologia celular observada por microscopia após 24 h de cultura mostrou uma forma de polígono irregular (Figura 1(a)). O microcarrier-6 exibiu uma forma de fuso irregular ou longo e uma textura solta (Figura 1(b)). Seguindo uma cocultura de 24 h de MKN45 e o microcarrier-6 modificado, as células MKN45 aderiram bem ao microcarrier e alcançaram a confluência. Além disso, foram observados grupos irregulares de células ao redor das células MKN45 aderidas ao microtransportador-6 (Figura 1(c)). Os complexos MKN45 foram corados com solução de 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), revelando um grande número de células MKN45 aderidas ao microtransportador-6 (Figura 1(d)). Estrutura porosa multicamadas de microcarriers pode ser observada sob microscópio eletrônico de varredura (Figura 1(e)). As células MKN45 aderiram aos microcarriers, e as células aderiram aos aglomerados de células formadas na superfície (Figura 1(f)).
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3.2. Sobrevivência do rato e formação do tumor
Nenhuma alteração significativa no apetite, pêlo ou peso corporal foi notada entre os grupos durante o experimento (Tabela 1). Os ratos do grupo 3D mostraram uma ligeira diminuição na atividade uma semana após atinoculação. Nenhum animal morreu em nenhum grupo, e nenhuma formação tumoral foi encontrada nos grupos portadores vazios ou 2D durante o experimento de 30 dias. Massas subcutâneas em 15 dos 20 ratos do grupo 3D foram identificadas via palpação 7-10 dias após a inoculação, sugerindo uma taxa de formação tumoral de 75% (Tabela 1). O xenoenxerto tumoral cresceu rapidamente e foram observadas massas subcutâneas aproximadamente 10 dias após a inoculação (Figura 3(a), Suplemento da Figura 3). O xenoenxerto tumoral cresceu para 0,5-1,0 cm3 de tamanho de 2 a 3 semanas após a inoculação. Os tecidos do xenoenxerto tumoral foram facilmente separados dos tecidos adjacentes e apresentavam-se com formas relativamente regulares, na sua maioria redondas ou ovais, de cor branca acinzentada ou vermelha acinzentada e com abundante suprimento de sangue periférico (Figuras 3(b) e 3(c) e Suplemento Figura 3). Houve alterações histológicas do local da injeção no grupo portador vazio, mas sem alterações no grupo 2D (Figuras 3(d) e 3(e)). Pequenas massas subcutâneas foram observadas com cor amarela no grupo portador vazio (Figura 3(d)).
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3.3. H&E Coloração
Histomorfologia, vista por microscopia leve, mostrou um grande número de células desordenadas e atípicas no xenoenxerto tumoral de ratos no grupo 3D (Figuras 4(a)-4(c)). Um grande número de células heterotípicas, microtransmissores residuais e vasos sanguíneos abundantes foram observados, 10 dias após atinoculação (Figura 4(a)). Um pequeno número de microcarriers residuais (Figura 4(b)) e um grande número de lesões necróticas (Figura 4(d)) foram observados, 20 dias após atinoculação. Entretanto, os microcarriers foram substancialmente eliminados 30 dias após atinoculação (Figura 4(c)). Um grande número de microcarriers e um pequeno número de células inflamatórias foi observado no grupo portador vazio, mas não foram encontradas células tumorais (Figura 4(e)).
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3.4. Immunohistochemistry
Immunohistochemistry foi realizado em animais eutanizados 20 dias após o xenograft tumoral. Os tecidos do xenoenxerto tumoral apresentaram coloração positiva CA199, CK-7 e CDX-2 (Figuras 4(f)-4(h)), confirmando ainda que as células atípicas eram células tumorais de origem humana.
4. Discussão
Modelos animais têm sido amplamente utilizados para estudar a patogênese e os mecanismos metastáticos do câncer gástrico e desempenham um papel extremamente importante na avaliação da eficácia e toxicidade das drogas terapêuticas. Atualmente, os modelos animais do câncer gástrico incluem principalmente: o modelo de indução, o modelo de transplante e o modelo de engenharia genética . Dentre os três tipos de modelos, o modelo de transplante é facilmente operado e, portanto, amplamente utilizado. O tipo de animais experimentais, o xenoenxerto tumoral e o local e via de transplante têm sido considerados fatores que afetam o sucesso dos modelos de xenoenxerto. Ratos com defeitos na função imunológica, como ratos nus e ratos com imunodeficiência combinada grave (SCID), são comumente utilizados para os modelos de xenoenxertos. No entanto, devido ao custo comparativamente caro, curta vida útil e falta de resposta imunológica a tumores em camundongos com imunodeficiência, selecionamos camundongos imunocompetentes C57BL/6 para o modelo xenograft para evitar as deficiências dos camundongos com imunodeficiência. Geralmente acredita-se que a ocorrência de câncer gástrico não está relacionada com o nível de estrogênio, e a incidência de câncer gástrico nos homens é maior do que nas mulheres. Assim, utilizamos como modelos os ratos do sexo masculino. Além disso, o presente estudo utilizou células cancerígenas gástricas humanas MKN45 para estabelecer o modelo in vitro, principalmente devido às fortes características invasivas e metastáticas da linha celular. Além disso, a região subcutânea das axilas e o transplante ectópico foram selecionados como local e via de transplante de células tumorais, respectivamente, como resultado da abundante oferta de sangue e estrutura de tecido solto desta área, o que facilita o crescimento tumoral em ratos .
Como ponte entre o sistema de cultivo celular 2D e o modelo animal, o sistema de cultivo celular 3D simula melhor o microambiente de crescimento de células tumorais e tornou-se um tópico atrativo nas pesquisas atuais . A cultura 3D de células cancerígenas irá formar organóides tumorais, e modelos de xenoenxertos tumorais de camundongos baseados em organóides tumorais começaram a ser aplicados na triagem de medicamentos anticancerígenos . O presente estudo utilizou as novas células microcarrier-6 e MKN45 para os experimentos de cocultura para estabelecer com sucesso um modelo de crescimento em 3D. Nós inserimos diretamente o microcarrier-6 no tecido subcutâneo de ratos para permitir a entrada de vasos sanguíneos nos microcarriers, apresentando uma vantagem específica que não é alcançada com outros microcarriers. Estudos têm relatado imunossupressão leve de camundongos imunocompetentes para alcançar resistência a células tumorais humanas, estabelecendo com sucesso um modelo de camundongo portador de tumor; entretanto, até o momento, não há relatos de transplante ectópico bem sucedido de um tumor humano em camundongos normais sob condições não-imunossupressoras. Além disso, quando ajustamos a concentração de células MKN45 para e imediatamente injetamos 100 μL MKN45 suspensão celular subcutânea para cada camundongo, a formação estável do tumor não foi alcançada devido à forte depuração imunológica das células tumorais humanas transplantadas ectópicamente. O microcarrier-6 utilizado no presente estudo demonstrou baixa imunogenicidade e textura solta com numerosos poros no centro, facilitando o crescimento das células tumorais. O microcarrier-6 também atuou como uma barreira para bloquear as células imunológicas de matar diretamente as células tumorais. O microcarrier-6 modificado permitiu que vasos sanguíneos crescessem facilmente dentro do tumor, proporcionando condições adequadas para o rápido crescimento das células tumorais.
Imunidade celular é o principal exército contra o crescimento tumoral; as células envolvidas incluem principalmente células T, células assassinas naturais, macrófagos e células dendríticas. Devido à estrutura irregular do “labirinto” do microcarrier-6, ele pode agir como uma barreira de curto prazo e bloquear a morte direta de células tumorais por células imunes até certo ponto. Além disso, três horas antes da experiência, o microcarrier-6 foi modificado com SDF-1α e VEGF para acelerar a formação de vasos sanguíneos e fornecer um suprimento de sangue para o rápido crescimento do tumor, que superou o efeito imunológico antitumoral dos ratos. Simultaneamente, descobrimos que macrófagos no sangue periférico e tecidos esplênicos dos ratos foram significativamente diminuídos durante o estágio inicial da formação do tumor transplantado, em comparação com o grupo controle normal (Figura Suplementar 1). O número de macrófagos de medula óssea diminuiu gradualmente entre o grupo portador vazio, o grupo 2D, e o grupo 3D, mas não houve significância estatística (Figura Suplementar 2A, 2B). Em comparação com o grupo portador vazio, o número de linfócitos T do baço no grupo 2D foi reduzido, mas não houve significância estatística (Figura Complementar 2C). O número de linfócitos T do baço no grupo 3D foi significativamente inferior ao do grupo 2D (Figura Complementar 2C). Isto sugere que o crescimento do tumor inibiu o sistema imunológico, permitindo que o tumor crescesse rapidamente.
O presente estudo estabeleceu um modelo de crescimento 3D de células MKN45, estabelecendo com sucesso um modelo de xenoenxerto de câncer gástrico humano em ratos imunocompetentes no grupo 3D, enquanto que os ratos nos grupos 2D e portadores vazios não formaram nenhum tumor. Este modelo de xenoenxerto caracterizou-se pelo rápido crescimento dos tumores, que podiam ser palpados à mão 7-10 dias após atinoculação e atingiram um crescimento ideal de 10-15 dias após atinoculação; o volume do tumor foi de 0,5-1,0 cm3 aproximadamente 20 dias após a inoculação. Um grande número de células com atipias nucleares que se infiltraram nos tecidos muscular e adiposo foi detectado pela coloração de H&E. O microcarrier-6 residual foi cercado por células inflamatórias e formou granulomas com grande área de necrose no centro, que provavelmente foi causada por um suprimento de sangue insuficiente devido ao rápido crescimento do tumor. Estes fenômenos são consistentes com o desenvolvimento tumoral em humanos. Além disso, os capilares abundantes estavam localizados principalmente na periferia dos tumores. Atualmente, não existe um marcador tumoral específico para o câncer gástrico; entretanto, CA199, CK-7 e CDX-2 são comumente usados como marcadores de tumores gastrointestinais. Assim, escolhemos estes três marcadores para a etiquetagem e identificação de células cancerígenas do estômago de origem humana. A coloração imunoistoquímica de CA199, CK-7 e CDX-2 foi positiva, confirmando ainda que as células heteromórficas eram células cancerosas gástricas humanas.
5. Conclusões
Estabelecemos com sucesso um modelo de xenoenxerto de câncer gástrico humano em camundongos imunocompetentes. Este modelo pode refletir a interação entre o sistema imunológico do corpo e os tumores e tem amplas perspectivas de aplicação na pesquisa futura sobre imunidade tumoral, bem como pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos.
Dados disponíveis
Os dados utilizados para apoiar os resultados deste estudo estão disponíveis no autor correspondente mediante solicitação.
Conflitos de interesse
Os autores declaram não ter conflitos de interesse.
Contribuições dos autores
Yanzhen Bi, Quanyi Wang e Yonghong Yang contribuíram igualmente para este trabalho.
Confirmações
Este estudo foi apoiado por subsídios da National Natural Science Foundation of China (81170395 e 81570556), da Natural Science Foundation of Jilin Province (20180101137JC e 20180101130JC), e do Research Fund for Lin He’s Academician Workstation of New Medicine and Clinical Translation in Jining Medical University (JYHL2019FMS21).
Materiais Suplementares
As alterações de células inflamatórias e outros dados tumorigênicos. Figura suplementar 1: As alterações de células inflamatórias em camundongos portadores de tumores durante o estágio inicial da formação do tumor transplantado. Figura 2: As alterações de células inflamatórias em diferentes grupos durante o estágio inicial de formação do tumor transplantado. Figura 3: Camundongos portadores de tumores e tecidos tumorais transplantados. (Materiais Suplementares)