Global bla KPC-E. As cepas de coli são diversas, mesmo dentro da ST mais prevalente, ST131, com evidências de transmissão local

45 isolados foram obtidos de 21 cidades em 11 países de quatro continentes (2010-2013; resultados de tipagem laboratorial anteriores resumidos na Tabela S1). Um isolado foi bla KPC-negativo no sequenciamento do genoma inteiro (WGS; ecol_252), potencialmente tendo perdido bla KPC durante o armazenamento ou subcultura no período de tempo entre a tipagem original e a subseqüente extração e preparação do DNA para o WGS. Para um isolado, os dados do WGS foram inconsistentes com os resultados da tipagem do laboratório (ecol_451), provavelmente representando uma mistura de laboratório; o ecol_252 e o ecol_451 foram, portanto, excluídos das análises subsequentes. Os outros 43 isolados foram sequenciados com sucesso (para métricas de qualidade ver Quadro S1). Entre estes 43 isolados, foram representados 21 E. coli ST diferentes (Tabela 1; previstos em silico da WGS), incluindo: ST131 , ST410 , ST38 , ST10, ST69 (isolados restantes STs de um só botão).

De 16.053 quadros de leitura abertos anotados (ORFs) identificados em todos os isolados KPC-E. coli, apenas 2.950 (18,4%) foram compartilhados em todos os isolados (“core”), e 222 (1,4%) em 95- < 100% dos isolados (“soft core “27). Ao nível dos nucleotídeos, havia 213.352 variantes de nucleotídeos simples (SNVs) no genoma do núcleo, consistentes com a diversidade de espécies anteriormente observada28. Os perfis genéticos de resistência também variaram marcadamente entre estirpes, com algumas abrigando vários mecanismos de resistência beta-lactam, aminoglicosídeo, tetraciclina e fluoroquinolona (por exemplo, ecol_224) e outras contendo apenas bla KPC (por exemplo, ecol_584; Fig. 1). Para as 16 cepas KPC-ST131, 4.071/7.910 (51%) ORFs foram o núcleo, com 6.778 SNVs através do genoma central destes isolados, novamente consistente com estudos globais anteriores de diversidade ST13123, 24 (Figura S1). Genomas acessórios foram altamente concordantes para alguns (ex. ecol_356/ecol_276/ecol_875), mas não todos (ex. ecol_AZ159/ecol_244) isolados que estavam intimamente relacionados em seus genomas centrais, suportando dinâmicas evolutivas altamente variáveis entre genomas centrais e acessórios (Fig. 1). A distribuição geográfica dos isolados estreitamente relacionados tanto no núcleo como nos genomas acessórios suporta a transmissão local (ex. ecol_AZ166, ecol_AZ167 ) de estirpes particulares de KPC-E. coli. A homologia dos motivos genéticos de flanking em torno dos genes bla KPC nestes pares de isolados estreitamente relacionados também seria consistente com esta hipótese, e menos consistente com múltiplos eventos de aquisição de bla KPC dentro da mesma base genética, especialmente dada a diversidade de seqüências de flanking de bla KPC observadas no resto do conjunto de dados (ver abaixo).

Filogênese da KPC-Escherichia coli identificada a partir de esquemas globais de vigilância da resistência ao carbapenem, 2008-2013. Os painéis à direita da filogenia representam mecanismos genéticos de resistência comuns (detalhes completos da tipagem do gene de resistência na Tabela S2), componentes do núcleo e do genoma acessório. Para o painel do genoma acessório, azul representa regiões anotadas que estão presentes, e branco aquelas que estão ausentes.

genes bla KPC parecem restritos a contextos plasmídeos em E. coli no presente, mas podem existir em múltiplas cópias em estruturas plasmídicas simples ou em plasmídeos de alto número de cópias

Trinta e quatro isolados (80%) continham bla KPC-2, e nove isolados (20%) bla KPC-3. A integração cromossômica do bla KPC tem sido descrita em outras Enterobacteriaceae, Pseudomonas e Acinetobacter spp. mas permanece rara5, 29, 30. Não houve evidências de integração cromossômica do bla KPC nas 18 estruturas cromossômicas reconstruídas a partir de sequenciamento de leitura prolongada, ou com base na revisão das anotações nos contigs contendo bla KPC (derivados das montagens de Illumina de novo) para os outros 25 isolados. Os alelos bla KPC não foram segregados por ST.

Estimados do número de cópias bla KPC por cromossoma bacteriano variaram entre <1 (ecol_879, ecol_881) e 55 (ecol_AZ152). Em nove casos esta estimativa foi ≥10 cópias de bla KPC por cromossoma bacteriano (ecol_276, ecol_356, ecol_867, ecol_869, ecol_870, ecol_875, ecol_AZ150, ecol_AZ152, ecol_AZ159, tabela S2). Seis destes isolados continham bla KPC em um contexto de plasmídeo tipo col, em dois casos o tipo de plasmídeo rep era desconhecido, e em um caso era uma réplica IncN. O número de cópias plasmídicas está associado a níveis mais elevados de resistência aos antibióticos se o gene relevante estiver localizado em uma unidade de alta cópia. Curiosamente, os plasmídeos de alto número de cópias são postulados para ter maiores chances de fixação em células descendentes, pois distribuem mais adequadamente por acaso e sem a necessidade de sistemas de partição31, e de serem transferidos em qualquer evento de conjugação, seja direta ou indiretamente32,33,34.

populações de plasmídeos KPC bla e KPC não-bla através das cepas globais de KPC-E. coli são extremamente diversas

A digitação de Plasmid Inc revelou a presença de uma mediana de quatro tipos de replicon plasmídeo por isolado (intervalo: 1-6; IQR: 3-5), representando uma grande diversidade (Tabela 1). Entretanto, as réplicas IncN, col, IncFIA e IncI1 foram desproporcionalmente sobre-representadas em certos STs (p < 0,05; Tabela 1). Entre os 18 isolados que foram submetidos ao seqüenciamento do PacBio, identificamos 53 plasmídeos KPC fechados, não-bla, variando de 1.459 bp a 289.903 bp (Tabela S1; pelo menos quatro estruturas plasmidais adicionais, parcialmente completas, estavam presentes). Destes plasmídeos KPC não-bla, 10 (tamanho: 2.571-150.994 bp) tinham <70% de similaridade (definida pela porcentagem de identidade da seqüência multiplicada pela proporção do comprimento da consulta demonstrando homologia) com outras seqüências disponíveis no GenBank, destacando que uma proporção do “plasmidoma” no KPC-E. coli permanece incompletamente caracterizada. Para os outros 43 plasmídeos, a combinação superior no GenBank foi um plasmídeo de E. coli em 35 casos, K. pneumoniae em 5 casos, e Citrobacter freundii, Shigella sonnei, Salmonella enterica em 1 caso cada (Tabela S3).

Vinte e duas estruturas plasmídicas de KPC foram totalmente resolvidas (17 apenas dos dados do Pacbio, quatro apenas dos dados do Illumina, 1 dos dados do PacBio e Illumina), variando de 14.029 bp a 287.067 bp (mediana = 55.590 bp; IQR: 23.499-82.765 bp). Estes plasmídeos contendo bla KPC, e seis casos adicionais onde bla KPC foi identificado em um contigente contendo réplicas, foram altamente diversificados com base na digitação Inc (Tabela S1). IncN foi o tipo mais comum (n = 8/28 estruturas tipo bla KPC; 29%), seguido por plasmídeos pequenos, semelhantes a col (n = 6/28 ; 21%). Outros tipos menos comuns foram: A/C2, FII(k), U (todos n = 2); e L/M, P, Q1 e R (todos n = 1). Quatro (14%) plasmídeos bla KPC foram construções multi-replicadas, a saber: col/repA, FIB/FII, FIA/FII, e FIA/FII/R.

Os plasmídeos comuns da IncN se dispersaram globalmente dentro de E. coli

Do GenBank, selecionamos todas as seqüências de plasmídeos IncN-bla KPC (Tabela S4) únicas e totalmente sequenciadas para comparação, datando já de 2005, por volta da época dos primeiros relatórios de E. coli produtora de KPC. Os backbones plasmídeos e as sequências de flanco em torno do bla KPC nestas 16 referências plasmídicas e um subconjunto de 12 sequências de estudo (ver “Métodos”) foram consistentes com múltiplas aquisições de dois complexos KPC IncN-Tn4401-bla conhecidos em E. coli STs divergentes: em primeiro lugar, dentro de um fundo semelhante ao Plasmid-9 (FJ223607, 2005, EUA) e, em segundo lugar, dentro de um elemento semelhante ao Tn2/3 em um fundo semelhante ao Plasmid-12 (FJ223605, 2005, EUA).

Em primeira instância, foram identificadas semelhanças genéticas entre Plasmid-9, pKPC-FCF/3SP, pKPC-FCF13/05, pCF8698, pKP1433 (representando um híbrido IncN), e bla KPC plasmídeos dos isolados ecol_516, ecol_517, ecol_656, e ecol_736 (este estudo). Plasmid-9 contém elementos Tn4401b duplicados em orientação inversa com quatro diferentes sequências de flanco de 5 bp em um arranjo atípico dentro de um intron35 do grupo II. As estruturas de espinha dorsal dos outros plasmídeos deste grupo são consistentes com um evento de aquisição separado de um elemento Tn4401b entre as regiões pld e traG dentro de uma versão ancestral da estrutura Plasmid-9, com a geração de uma duplicação do local alvo TTCAG de flanco (TSD) (rotulado como Plasmid 9-like plasmid (hipotético), Fig. 2). A propagação internacional seguida pela evolução local tanto dentro das espécies como entre elas seria responsável pelas diferenças entre os plasmídeos, inclusive: (i) variação do nível de nucleotídeos (observada em todos os plasmídeos); (ii) pequenos eventos de inserção/deleção (observados em todos os plasmídeos); (iii) eventos de inserção/deleção maiores mediados por elementos transponíveis (por exemplo, pCF8698_KPC_2); e (iv) provável recombinação homóloga, resultando em variação agrupada dentro de uma espinha dorsal plasmídea semelhante (por exemplo ecol_656/ecol_736), bem como rearranjos mais distintos, incluindo a formação de plasmídeos “híbridos” (p.ex. pKP1433)(Fig. 2).

Esquema de comparação de plasmídeos tipo FJ223607 (Plasmid 9-like) IncN (disponível ao público; este estudo), e a sua origem geográfica/datas de isolamento. Os nomes de seqüência plasmídica em vermelho são aqueles deste estudo, derivados de dados PacBio e fechados (ecol_517, ecol_656) ou estruturas plasmídicas incompletas (ecol_516, ecol_736) derivados de dados Illumina. As barras alinhadas adjacentes aos nomes dos plasmídeos representam sequências de plasmídeos: cinza claro denota regiões com 100% de identidade de sequências; preto representa diversidade de nucleotídeos entre sequências; e linhas finas representam indels. As sequências de codificação são representadas por setas de gordura abaixo das barras de sequência individuais e são codificadas por cores, de acordo com a chave de cores. O esquema do inset que descreve a variação genética entre sequências representa exemplos de eventos evolutivos identificados: (a) mudança de nível de nucleotídeos simples, (b) indels pequenos (≤100 bp), (c) indels grandes (>100 bp), (d) eventos de recombinação.

Em Plasmid-12 (FJ223605), Tn4401b foi inserido em um elemento híbrido do tipo Tn2-Tn3 (com genes associados de resistência a drogas incluindo bla TEM-1, bla OXA-9, e vários genes de resistência a aminoglicosídeos), embora na ausência de duplicação da sequência alvo, possivelmente como resultado de um evento de transposição intra-molecular, replicante, gerando seqüências de locais alvo não correspondentes (L TSS = TATTA); R TSS = GTTCT). Este complexo está por sua vez localizado entre dois elementos do tipo IS15DIV (IS15Δ)/IS26 ladeados por 8 bp de repetições invertidas e localizados entre o traI (891 bp do final de 3′) e pld loci (~28 Kb; Fig. 3A). Os componentes da espinha dorsal do IncN Plasmid-12 são consistentes com aqueles observados em um surto de NIH5 e em uma versão rearranjada em um surto da Universidade da Virgínia (CAV1043; 2008)6. Deste estudo, plasmídeos de ecol_224, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_422 e andaimes de ecol_AZ151, ecol_744, ecol_AZ150 compartilham todos estruturas quase idênticas ao Plasmid-12, com variação do nível de nucleotídeos agrupados presentes nos genes do traJ-traI, consistente com um evento de recombinação homólogo que afeta esta região, e evidência de eventos de inserção/deleção esporádicos (Fig. 3A). Entretanto, as estruturas bla KPC-Tn4401 nestes isolados estão quase totalmente degradadas pela presença de outros elementos genéticos móveis (MGEs), incluindo elementos do tipo Tn2/Tn3, ISKpn8/27 e Tn1721. No ecol_224, o bla KPC-2 foi inserido no backbone do IncN como parte de duas estruturas tipo Tn3 invertidas de repetição, ladeadas por um TSD TTGCT, e mais próximas do traI (136 bp do final de 3′) do que o complexo IS15DIV (IS15Δ)/IS26 mencionado anteriormente em Plasmid-12 (Fig. 3B). Embora não seja possível traçar com precisão a história evolutiva desta região genómica dados disponíveis, a presença de assinaturas partilhadas desta estrutura em ecol_422, ecol_744, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_AZ150 e ecol_AZ151 sugerem uma aquisição comum, e múltiplos rearranjos subsequentes mediados pela presença do grande número de MGEs flanqueadas bla KPC-2.

Esquema comparativo de plasmídeos tipo FJ223605 (tipo Plasmid-12) IncN KPC deste estudo. Painel 3A. Origem geográfica, datas de isolamento e alinhamento geral das estruturas plasmídicas/contig. Os nomes de sequência plasmídica em vermelho são os deste estudo, derivados dos dados PacBio e fechados (ecol_224, ecol_422, ecol_881, ecol_AZ159) ou estruturas plasmídicas incompletas (ecol_744, ecol_AZ151, ecol_AZ150) derivados dos dados Illumina. Barras alinhadas adjacentes a nomes de plasmídeos representam seqüências de plasmídeos: cinza claro denota regiões com 100% de homologia de seqüências; preto representa diversidade de nucleotídeos entre seqüências; e linhas finas representam indels. As sequências de codificação são representadas por setas de gordura abaixo das barras de sequência individuais e são codificadas por cores de acordo com a chave de cores. O esquema do inset que descreve a variação genética entre sequências representa exemplos de eventos evolutivos identificados: (a) mudança de nível de nucleotídeos simples, (b) indels pequenos (≤100 bp), (c) indels grandes (>100 bp), (d) eventos de recombinação. Painel 3B. Grande plano da região entre traI e pld contendo bla KPC-2 apenas nos isolados em estudo. As sequências de codificação são codificadas por cores como na Fig. 3A; as regiões de sequência referidas no texto são anotadas.

Plásticos semelhantes a cores podem representar um importante vector de transmissão para bla KPC em E. coli

Os pequenos plasmídeos semelhantes a col foram o segundo tipo mais comum de plasmídeos portadores de bla KPC em E. coli (n = 5 ), mas três destes foram idênticos (bla KPC-2, 16.559 bp), todos isolados em Pittsburgh, EUA, a partir de ST131 isolados durante um período de dois anos (ecol_276 , ecol_356 , ecol_875 ). Estes três isolados adicionalmente continham réplicas de FIA, FIB, FII, X3 e X4, sugerindo persistência estável de uma estirpe clonal + plasmídeos ao longo do tempo, consistente com a análise do genoma SNV/core e acessório (Fig. 1, Figura S1).

Os outros dois plasmídeos semelhantes a col representam efetivamente pequenos trechos de DNA codificando diferentes genes de mobilização (mbeA/mbeC/mbeD) aproveitados para os módulos Tn4401/bla KPC. As sequências de 5 bp de flanco Tn4401 foram consistentes com a transposição directa e intermolecular em ambos os casos (ecol_870: TGTTT-TGTTT; ecol_867: TGTGA-TGTGA). Um plasmídeo co-integrado col/repA também foi observado neste conjunto de dados (ecol_AZ161), no qual o Tn4401b foi inserido entre sequências de assinatura colE3 e um elemento Tn3 (Tn4401 TSS: AGATA-GTTTCT). A formação de tais estruturas plasmídicas co-integradas em E. coli também foi previamente descrita36, incluindo a de uma estrutura plasmídica tipo col/pKpQIL fundido (pKpQIL sendo historicamente associado ao bla KPC)37.

Plasmídeos tipo col foram associados a produtores de KPC em outros estudos menores, regionais21, 38. É preocupante que esses pequenos vetores tenham se mostrado responsáveis pela difusão interespécies dos genes qnr mediadores da resistência à fluoroquinolona, mesmo na ausência de qualquer pressão óbvia de seleção antimicrobiana39. A associação significativa de plasmídeos semelhantes a coliformes com determinados E. coli STs (predominantemente ST131) neste estudo poderia ser uma explicação para a representação desproporcional do bla KPC nesta linhagem.

Diversos Tn4401 5 bp seqüências de sítio alvo (SSTs) suportam alta mobilidade de transposição

Isoformas isoformas completas Tn4401 de flanco bla KPC-2 ou bla KPC-3 foram observadas em apenas 24/43 (56%) isolados, incluindo Tn4401a/a-like (n = 10; um isolado com uma ruptura contigente a montante de bla KPC), Tn4401b (n = 12), e Tn4401d (n = 2) variantes. Foram identificados onze pares diferentes de 5 bp de sequência de sítio alvo (SST), dos quais 7 (64%) não foram observados em nenhum plasmídeo de comparação baixado do GenBank (Tabela S5). Tn4401a tinha três diferentes TSSs de 5 bp diferentes, Tn4401b sete, e Tn4401d um. A maioria dos TSDs representados, mas em três casos diferentes TSSs de 5 bp foram Tn4401, consistentes tanto com eventos de transposição intra-molecular direta quanto replicativa.

Do conjunto completo de plasmídeos do GenBank e experimentos de transposição in vitro realizados por outros, 30 tipos diferentes de TSSs de 5 bp foram caracterizados, sete apenas no ambiente experimental40. Os plasmídeos descarregados provêm de diversas espécies e pontos de tempo (2005-2014), embora possam representar uma diversidade de locais de inserção Tn4401 mais ampla, como resultado de enviesamentos de amostragem. Nossos dados, entretanto, seriam consistentes com a mobilidade significativa de Tn4401 dentro de E. coli após a aquisição de diversas isoformas Tn4401 e/ou representam múltiplos eventos de importação para E. coli de outras espécies.

A associação tradicional do bla KPC com Tn4401 foi significativamente corroída nos plasmídeos KPC na E. coli

Notavelmente, nos outros 19/43 (44%) isolados a estrutura Tn4401 foi degradada através da substituição por MGEs, apenas alguns dos quais foram previamente descritos41, 42. Dois isolados tinham novas estruturas Tn4401Δb (truncamentos a montante por IS26 ou IS26-ΔIS5075 ). Uma estrutura tipo Tn4401e- (eliminação de 255 bp a montante do bla KPC) estava presente em três isolados (ecol_227, ecol_316, ecol_583): isto foi ainda caracterizado em um conjunto completo de plasmídeos PacBio (ecol_316) e representou um rearranjo no local do L TSS do elemento ISKpn7. Neste plasmídeo, um segundo elemento Tn4401 parcial estava presente sem bla KPC, o que seria consistente com um evento de transposição intra-molecular incompleto e replicativo (GGGAA = L TSS e R TSS nos dois elementos Tn4401b, em orientação inversa). Outros motivos de flanqueamento bla KPC incluídos: elementos híbridos Tn2/Tn3-ISKpn8/27-bla KPC (n = 1; ecol_224); IS26-ΔtnpR(Tn3)-ISKpn8/27- bla KPC-ΔTn1721-IS26 (n = 5; ecol_AZ153-AZ155, ecol_AZ166, ecol_AZ167); ISApu2-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC- korC-klcA-ΔTn1721-IS26 (n = 1; ecol_542); IS26-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC-korC-IS26 (n = 1; ecol_545); elementos híbridos Tn2/Tn3 + ΔblaTEM-bla KPC-ΔTn1721 (n = 2; ecol_744, ecol_422), elementos Tn3-Δbla TEM-bla KPC- ΔTn1721 (n = 4; ecol_881, ecol_AZ151, ecol_AZ159, ecol_AZ150) e ΔTn3-Δ -ΔIS3000 (tipo Tn3) (n = 1; ecol_AZ152). Não conseguimos avaliar o contexto de flanco do bla KPC em ecol_452 devido a limitações do conjunto.

Esta aparente diversidade em MGEs adquiridas independentemente em torno do gene bla KPC estende os meios pelos quais o bla KPC pode ser mobilizado. Curiosamente, como observado anteriormente43, todas as sequências Tn4401 degradadas neste conjunto de dados foram associadas a trechos variáveis de sequências do tipo Tn2/3, sugerindo que a inserção de Tn4401 num contexto tipo Tn2/Tn3 pode ter permitido que este último atuasse como um hotspot para a inserção de outras MGEs6. Um achado particular é a associação com IS26, que tem sido ligada à disseminação de vários outros genes de resistência em E. coli, incluindo CTX-M ESBLs24, 44; é capaz de aumentar a expressão de genes de resistência estreitamente co-localizados45; participa da formação de co-integração e, portanto, do rearranjo plasmídeo46; e aumenta a ocorrência de outros eventos de transferência mediados por IS26 em plasmídeos que abrigam IS26 46,