Efeitos Medidos do Wnt3a na Proliferação de Células HEK293T Dependem do Ensaio Aplicado
Abstract
O caminho de sinalização Wnt tem sido associado a muitos processos celulares essenciais. Este estudo visa examinar os efeitos da sinalização de Wnt na proliferação de células HEK293T cultivadas. As células foram incubadas com Wnt3a, e a ativação da via de Wnt foi seguida pela análise do nível da proteína β-catenin e dos níveis de expressão dos genes alvo MYC e CCND1. O nível da proteína β-catenin aumentou até quatro vezes. Enquanto os níveis de mRNA de c-Myc e ciclina D1 aumentaram ligeiramente, os níveis de proteína aumentaram até um fator de 1,5. Notavelmente, os ensaios MTT e BrdU mostraram resultados diferentes ao medir a taxa de proliferação de células HEK293T estimuladas pelo Wnt3a. Nos ensaios de BrdU pôde ser detectado um aumento da taxa de proliferação, que se correlacionou com a concentração de Wnt3a aplicada. Ao contrário, esta correlação não pôde ser mostrada nos ensaios de MTT. Os resultados do MTT, que são baseados na atividade mitocondrial, foram confirmados pela análise do complexo succinato desidrogenase por imunofluorescência e por blotting ocidental. Em conjunto, nosso estudo mostra que o Wnt3a ativa a proliferação de células HEK293. Estes efeitos podem ser detectados através da medição da síntese de ADN e não através da medição das alterações da actividade mitocondrial.
1. Introdução
A via de sinalização de Wnt é conhecida por desempenhar um papel chave na regulação da diferenciação celular, proliferação, sobrevivência e apoptose. As proteínas Wnt são uma família altamente conservada de glicoproteínas modificadas por lipídios secretados que ativam as cascatas de sinalização dentro da célula, ligando-se a um membro da família Frizzled (Fz) de receptores acoplados à proteína G na matriz extracelular. Há 19 membros de Wnts vertebrados , que podem ser agrupados em duas classes principais com base em sua capacidade de estabilizar citosólico β-catenin: via canônica e não-canônica . Trabalhos recentes também mostraram que certos ligandos Wnt, como o Wnt5a, são capazes de ativar mais de uma via de sinalização Wnt , por isso a classificação estritamente binária está se tornando cada vez mais ultrapassada. O mau funcionamento da via de sinalização de Wnt está relacionado a várias doenças como osteoporose , doença de Crohn , doença de Alzheimer , esquizofrenia , e especialmente câncer .
O ligando Wnt3a pertence a β-catenin dependente (canônico) sinalização de Wnt, que se liga a receptores transmembrana frisados. Subsequentemente, o complexo receptor da proteína 5 (LRP5) ou LRP6 de baixa densidade, activa as proteínas citoplasmáticas desembrulhadas, o que desencadeia a inibição da glicogénio sintetase quinase 3β (GSK-3β). A protooncoproteína β-catenin acumula-se no citoplasma como consequência da desmontagem do complexo de destruição que é formado pela adenomatose polipose coli (APC), AXIN, e GSK-3β. Assim, a β-catenin pode ser translocada para o núcleo onde ativa a transcrição dos genes alvo mediados pelo fator de transcrição específico da célula T (TCF)/fator de realce de linfóides (LEF) . Estes genes são responsáveis por regular processos fisiológicos essenciais no desenvolvimento embrionário e adulto, tais como proliferação celular, diferenciação, morfogênese e adesão celular .
Com a indicação de proliferação, há uma complexa interação entre a sinalização canônica de Wnt e o ciclo celular. A via de sinalização de Wnt/β-catenin é significativa para estimular a progressão da fase G1, inibindo a GSK-3β, que regula os agentes efetores do ciclo celular e reguladores de crescimento .
Um gene alvo direto da via de sinalização de Wnt/β-catenin é o protooncogene MYC, que foi identificado como um alvo Wnt nas células cancerosas do cólon . O regulador de transcrição c-Myc controla muitas funções celulares, especialmente a regulação da progressão do ciclo celular . O gene codificador da ciclina D1 CCND1 é também um gene alvo da via Wnt/β-catenin, que foi descrita nas células cancerígenas do cólon . A ciclina D1 como ativador da quinase dependente da ciclina (cdk) 4 ou cdk 6 impulsiona a transição de fase G1/S .
Existem várias formas de medir a proliferação celular induzida pela ciclina Wnt3a. Um método não radioativo é um imunoensaio baseado na incorporação de 5-bromo-2′-deoxiuridina (BrdU) no DNA para determinar a síntese de DNA, que se correlaciona com a transição de fase S e, portanto, com a proliferação celular. Outro método utiliza a medição da atividade mitocondrial de células viáveis. No ensaio MTT é produzido um produto de formazan azul insolúvel por desidrogenases mitocondriais por redução do MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazólio) .
Neste estudo investigamos a proliferação de células HEK293T sob a influência de ligandos Wnt3a usando o ensaio MTT assim como o ensaio de BrdU. Além disso, comparamos os resultados desses ensaios com a atividade mitocondrial das células tratadas com Wnt3a, medida pela imunoconstituição da proteína da cadeia de transporte de elétrons SDHA (succinate dehydrogenase complex subunit A).
2. Materiais e Métodos
2.1. Células e Cultivo Celular
As células renais embrionárias humanas, HEK293T, foram cultivadas no meio de Dulbecco modificado Eagle’s (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (PAN Biotech, Aidenbach, Alemanha), 1% de aminoácidos não essenciais, e 1% de penicilina/streptomicina (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) a 37°C em 5% de CO2.
2.2. Ensaios de Proliferação
MTT e BrdU foram realizados em placas de 96 poços. Dez mil células foram semeadas por poço e as células foram estimuladas com doses crescentes de Wnt3a (R&D Systems, Minneapolis, EUA), nomeadamente, 0, 10, 50, 100, 150, e 200 ng/mL, durante 24, 48, e 72 h. O MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) foi dissolvido em PBS a 5 mg/mL e 20 μL de solução de MTT foi adicionado a cada poço seguido por uma incubação de três horas a 37°C em 5% de CO2. Em seguida, o meio com MTT foi folheado e 200 μL DMSO foi adicionado. Para dissolver os cristais, as células foram agitadas durante 15 min à temperatura ambiente. As placas foram lidas por um leitor ELISA (Tecan Group Ltd., Männedorf, Suíça) a 590 nm. Para o ensaio BrdU foi utilizado um kit comercial “Cell Proliferation ELISA BrdU colorimetric” (Roche, Mannheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Após a adição da solução de rotulagem BrdU, as células foram incubadas durante três horas a 37°C em 5% de CO2. Após a etapa final de lavagem 100 μL/bebedura de solução de substrato foi adicionado às células e a reação foi interrompida após 15 minutos de incubação à temperatura ambiente, utilizando ácido sulfúrico. As placas foram lidas imediatamente por um leitor ELISA a 450 nm. Todos os ensaios foram feitos em triplicado (). Para as células de calibração foram semeadas em números diferentes (0,1 × 104 a 3 × 104).
2,3. Imunocitoquímica e microscopia de fluorescência
HEK293T células foram semeadas em placas de 24 poços e tratadas com 0-200 ng/mL Wnt3a a uma confluência de 30% e fixadas em formaldeído a 4% após 24, 48 e 72 h. O anticorpo SDHA (Abcam, Cambridge, UK) a uma diluição de 1 : 200 foi adicionado e as células foram incubadas durante uma hora. Os núcleos celulares foram rebatidos com DAPI durante 5 minutos. As células foram analisadas via microscopia de fluorescência (Observer. Z1 de Zeiss, Jena, Alemanha) e o software AxioVision 4.7.
2.4. Eletroforese em Gel de Proteína e Western Blot
Usando as concentrações de proteína Bradford-Assay em lisados de células inteiras foram determinadas. Quantidades iguais de proteína foram carregadas em géis de poliacrilamida SDS (NuPAGE, 4-12%, Life Technologies, Carlsbad, EUA). Os géis foram executados a 150 V durante 1 h e transferidos para as membranas de nitrocelulose através do sistema iBlot (Life Technologies). As membranas foram analisadas usando anticorpos primários contra SDHA, β-catenin, c-Myc, Cyclin D1, e β-actin (Cell Signaling, Cambridge, UK), diluídos 1 : 1000 em TBS-Tween com 3% de leite, seguido por incubação com um anticorpo secundário apropriado conjugado com peroxidase de rábano (diluição 1 : 2000). As bandas proteicas foram visualizadas usando a detecção ECL.
2,5. Isolamento do RNA e RT-PCR
RNA total foi isolado usando NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha) e 1 μg O RNA foi transcrito em modo reverso com Verso cDNA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha) em um volume de 40 μL. As sequências dos iniciadores (MWG, Munique, Alemanha) utilizados para a transcriptase reversa semiquantitativa PCR são para GAPDH 5′-catggtgagatttgccaac-3′ (forward) e 5′-tcaacaccttgacctcatcac-3′ (reverse), para MYC 5′-ccgagcaaggacgacgactc-3′ (para a frente) e 5′-gcctcaggagaagcgggtcct-3′ (para trás), e para CCND1 5′-gcctgaacctgaggagcccccca-3′ (para a frente) e 5′-gtcacacttgatcactcactcactgg-3′ (para trás). A amplificação PCR foi realizada usando My Taq Red Mix (Bioline, Luckenwalde, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. A reacção foi realizada com desnaturação preliminar durante 2 min a 94°C, seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1 min, recozimento a 55°C (CCND1), 57°C (GAPDH), ou 60°C (MYC) durante 30 seg, e extensão a 72°C durante 1 min. A etapa final de extensão durou 10 min. a 72°C. Os produtos PCR foram analisados por electroforese num gel de agarose a 1,5%.
2,6. Análise de dados
Microsoft Excel software foi usado para gerenciamento de dados, incluindo cálculo de desvios padrão. Western blots e agarose gels foram escaneados pelo sistema de documentação em gel Quantum ST4 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Alemanha). As bandas foram quantificadas usando o software ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, EUA).
3. Resultados
3.1. Efeitos do Wnt3a na Indução de β-Catenin e Genes Alvo Típicos do Wnt
Para provar a ativação do caminho do Wnt, detectamos a quantidade de proteína de β-catenin em células HEK293T após o tratamento com Wnt3a (Figura 1). Após 24 horas de tratamento, a concentração da proteína β-catenin aumentou com o aumento das concentrações de Wnt3a. A maior concentração da proteína β-catenin foi identificada às 24 horas com uma concentração de 200 ng/mL de Wnt3a. Aqui a quantificação mostrou um aumento de quatro vezes em comparação com o controle. Nos momentos 48 e 72 horas após o tratamento, o efeito da indução da β-catenin não é mais claramente reconhecível. Além disso, analisamos a regulação dos genes alvo de Wnt CCND1 e MYC após o tratamento com Wnt3a tanto por RT-PCR semiquantitativo como por Western blot (Figuras 2 e 3). Um nível basal de c-Myc e ciclina D1 foi detectado em células não tratadas. Os resultados da RT-PCR mostraram alterações marginais na quantidade de c-ADN MYC e uma indução de CCND1 após 24 e 48 horas com 10 ng/mL Wnt3a, bem como após 72 h com uma concentração de 100-200 ng/mL Wnt3a. Foi observado um ligeiro aumento do nível proteico de c-Myc com uma concentração de 50 ng/mL após 24 horas. A quantificação ocidental da ciclina D1 mostrou um aumento de 1,5 com uma concentração de Wnt3a de 50 a 200 ng/mL após 24 horas. O nível de proteína da c-Myc subiu da mesma forma com a concentração de 50 ng/mL Wnt3a após 24 horas.
3.2. Ensaios de Proliferação Celular
Para estudar os efeitos das proteínas Wnt no crescimento celular, as células HEK293T foram cultivadas em placas de 96 poços por 24 horas antes de serem tratadas com concentrações de proteína Wnt3a de 0, 10, 50, 100, 150, ou 200 ng/mL, respectivamente. Após 24, 48 e 72 horas de incubação, foram realizados ensaios de MTT e BrdU. Os ensaios de BrdU mostram uma tendência clara; com concentrações crescentes de Wnt3a a leitura associada aumentou (Figura 4(a)), na qual Wnt3a indica a maior taxa de crescimento após 48 horas e uma concentração de 200 ng/mL.
(a)
(b)
(a)
(b)
Em contraste com os ensaios BrdU, os ensaios MTT não mostraram uma correlação entre as concentrações de Wnt e o número de células. O número de células permaneceu praticamente o mesmo ou diminuiu em comparação com seus controles relevantes (ver Figura 4(b)).
3.3. Atividade Mitocondrial
Para substanciar o papel do Wnt3a em relação à atividade mitocondrial em células HEK293T, quantidades de proteína SDHA foram determinadas pelo western blot, bem como pela análise imunocitoquímica. A succinato desidrogenase (SDH) com sua subunidade SDHA é um componente chave do ciclo do ácido cítrico, que está envolvido no complexo II da cadeia de transporte de elétrons mitocondriais e é responsável pela transferência de elétrons de succinato para ubiquinona. As células foram tratadas igualmente para experimentos de análise de proliferação e incubadas com anticorpos SDHA, como descrito acima. Os resultados (Figura 5) mostraram um sinal de fluorescência crescente e também um sinal mais intenso no western blot em relação ao controle após 24 horas de tratamento com Wnt3a. Após 48 horas, o nível de proteína registrado por microscopia de imunofluorescência ou por análise do western blot não mostrou nenhuma alteração significativa. Após 72 horas de tratamento com Wnt3a, mesmo um sinal decrescente foi observado em ambos os experimentos. O maior sinal foi medido após 24 horas com 50 ng/mL de Wnt3a.
(a)
(b)
(c)
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(c)
4. Discussão
As proteínas Wnt estão envolvidas em várias funções celulares, incluindo a regulação da expressão gênica para o ciclo celular e proliferação . Wnt3a é conhecido como promotor de proliferação e migração de células epiteliais de lentes humanas , também para a proliferação de fibroblastos ou como regulador de proliferação de células beta NIT-1 pancreáticas . MYC e CCND1 são genes alvo da via de sinalização Wnt em células de mamíferos. Por exemplo, Yoon et al. expuseram que a sinalização de Wnt ativa a biogênese mitocondrial realizando uma tela de RNAi em larga escala; identificaram genes que afetam a função mitocondrial, entre outros MYC .
Neste trabalho determinamos os efeitos de Wnt3a na proliferação de células HEK293T. Para isso aplicamos dois grandes ensaios, que são amplamente utilizados para análise das taxas de proliferação de células cultivadas, a saber, os ensaios MTT e BrdU. Ao fazê-lo, os efeitos específicos dos ligandos de Wnt na síntese de DNA e atividade mitocondrial foram detectados e comparados diretamente.
Para estabelecer nosso sistema e provar o efeito do Wnt3a na via de Wnt em células HEK293T, demonstramos a indução de β-catenin após 24 horas de tratamento com Wnt3a e analisamos os níveis de expressão de MYC e CCND1. O nível de ambos os genes alvo também aumentou após 24 horas de exposição do Wnt3a. A C-Myc tem um papel fundamental na progressão da fase G1; ela upregula a ciclina D1 e reprime as p21 e p27 . A ciclina D1, por sua vez, promove a fosforilação e inibição do complexo retinoblastoma (Rb), que por sua vez upreglutina o nível de ciclina E. O enriquecimento da ciclina E leva à transição do ponto de controle da fase G1/S .
Durante a mitocôndria da fase G1 tem que fornecer uma alta quantidade de energia . Esta fase oxidativa é seguida por um período redutor durante a fase S-/G2-/M do ciclo celular, no qual ocorre replicação de DNA e proliferação de mitocôndrias .
As taxas de proliferação de Wnt3a tratadas HEK293T foram diferentes, quando medidas pelos dois ensaios utilizados neste estudo. Explicamos a diferença através dos diferentes mecanismos de detecção destes métodos. O ensaio MTT mede a atividade das mitocôndrias; por outro lado, o ensaio BrdU detecta a quantidade relativa de DNA recém-sintetizado. Wagner et al. referem-se a uma relação altamente significativa entre BrdU e MTT em seus resultados com a proliferação de linfócitos caninos, embora o ensaio de BrdU seja comprovadamente mais sensível do que o ensaio de MTT. O efeito aparentemente negativo do Wnt3a no número de células poderia ser explicado por um declínio na atividade mitocondrial. O ensaio de BrdU, no entanto, mostrou um efeito promotor na síntese do ADN nestas células. Os experimentos de atividade mitocondrial mostraram que somente após 24 horas de tratamento com Wnt3a o nível de SDHA foi aumentado. A ativação com Wnt3a recombinante provavelmente não tem efeito sobre a atividade mitocondrial após 48 horas ou mais. De acordo com este efeito de tempo limitado é o sinal decrescente durante o ensaio de MTT após 48 e 72 horas. Isto também é confirmado pela acumulação decrescente de β-catenin pelo Wnt3a após 24 horas. Outras publicações apoiam esta suposição de que as células tratadas com Wnt3a indicam um aumento do nível de β-catenin apenas durante um período de 24 horas. Explicamos nossos resultados, que são contrários ao efeito proliferador publicado do Wnt3a pelo fato de que a maioria dos estudos utilizou células sobreexpressas de Wnt3a, meio Wnt3a-condicionado, ou células sedentas de soro com proteína Wnt recombinante para ativação Wnt/β-actin signal signal path.
Em conclusão, os resultados dos ensaios de BrdU e MTT são dificilmente comparáveis ao medir os efeitos do Wnt3a sobre a taxa de proliferação de células HEK293T. As diferenças podem ser explicadas pelos seus diferentes pontos de aplicação, nomeadamente, a actividade mitocondrial e a síntese de ADN. A fim de dar evidência definitiva sobre a taxa de proliferação celular, a interpretação dos resultados de um único método pode ser enganosa. Para a avaliação da proliferação celular, a contagem direta de células por métodos ópticos seria o melhor espelho da situação real. Seria interessante comparar os resultados correspondentes com os resultados de ensaios bioquímicos como BrdU e MTT.
Conflito de Interesses
Os autores declaram que não há conflito de interesses em relação à publicação deste trabalho.
Conhecimento
Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Ministério Federal de Educação e Pesquisa (BMBF) .