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As análises em todo o genoma revelam que a via IRE1a-XBP1 promove a diferenciação das células T helper resolvendo o estresse secretor e acelerando a proliferação

Março 14, 2021 by admin

Neste estudo, para entender o papel da via IRE1a-XBP1, nossa estratégia básica foi utilizar um modelo de diferenciação in vitro Th2 (Fig. 1b). As células auxiliares naïve T foram activadas por activação de TCR em placas revestidas com anti-CD3e/CD28 na condição de diferenciação Th2 durante 72 h, descansadas durante 42 h, e estimuladas por activação de TCR com placas revestidas com anti-CD3e/CD28. Para perturbar a via IRE1a-XBP1, usamos um medicamento bem estabelecido 4μ8c que bloqueia especificamente a via inibindo a atividade de endonuclease IRE1a . O medicamento foi adicionado ao meio de cultura na concentração 15-μM no início da cultura e durante a passagem da placa de ativação para a placa de repouso. A escolha da concentração do fármaco foi determinada pela sua maior eficiência de inibição IRE1a com menor toxicidade celular (arquivo adicional 1: Figura S1). Comparamos transcriptomas de linfócitos Th2 (tratados e não tratados) ingênuos e reestimulados por sequenciamento do RNA, identificamos os sítios de ligação do fator de transcrição XBP1 na reativação do Th2 por ChIPmentation (ChIP-sequenciamento), e integramos os dados de todo o genoma para prever alvos diretos e seu papel regulador.

As células auxiliares T comutam na via IRE1a-XBP1 durante a activação in vitro

Células auxiliares T activadas e diferenciadas secretam uma abundância de citocinas. Portanto, uma máquina secretora bem desenvolvida é um pré-requisito para que as células se adaptem a esta tensão secretora. Para prever o envolvimento da via ER/UPR durante a activação da célula T helper, comparamos o transcriptoma de células Th2 ingenuas e diferenciadas (Th2 reestimulado). Os genes diferencialmente expressos, obtidos a partir desta comparação, foram integrados na via KEGG “Processamento de Proteínas no Retículo Endoplásmico” para visualizar os componentes que estão acima ou abaixo da regulação. A análise mostra que quando células auxiliares T ingênuas são ativadas e diferenciadas em células Th2, elas upregulam a expressão dos genes envolvidos na via de estresse ER (arquivo adicional 1: Figura S2). Vários factores que foram anteriormente caracterizados como controladores de dobramento e secreção de proteínas, incluindo a própria XBP1, são upregulados durante a diferenciação das células T helper.

Para validar esta previsão, e especificamente investigar o envolvimento da via IRE1a-XBP1, medimos o mRNA IRE1a e a expressão de proteínas em linfócitos Th2 diferenciados e reactivados in vitro (Fig. 1b). As células foram analisadas pelo qPCR e Western blot para comparar o mRNA e a proteína, respectivamente. Verificamos que tanto o mRNA quanto o nível de proteína foram upregulados nas células T helper ativadas (Fig. 1c, painel esquerdo e médio). Sabe-se que a fosforilação da IRE1a denota o seu estado funcional. Observamos que a proteína é fosforilada em linfócitos Th2 ativados (Fig. 1c, painel direito). Este aumento da fosforilação da IRE1a pode ser explicado pelo aumento da síntese da proteína, embora não possamos excluir a possibilidade de aumento da atividade cinase e da auto-fosforilação. A análise densitométrica da banda western blot sugere que ambos os mecanismos, upregulação da síntese protéica e aumento da fosforilação, estão envolvidos. A upregulação da proteína triplicou, mas a fosfoproteína aumentou 4,5 vezes (Fig. 1c).

IRE1a ativada emenda o mRNA do XBP1 (XBP1u) não emendado e produz um mRNA do XBP1 (XBP1s) emendado. Observamos aumentos na forma emendada do XBP1 (XBP1s), tanto ao nível do mRNA como da proteína, na ativação da célula auxiliar T (Fig. 1d, e). A tunicamicina foi usada como controle positivo. É uma droga que inibe a glicosilação ligada ao N e, portanto, causa acúmulo de proteínas desdobradas (ou seja, estresse reticulum endoplasmático (ER)), e aumenta a XBP1s ao aumentar a atividade da IRE1a. A inibição específica da actividade endonuclease IRE1a através do tratamento das células com 4μ8c aboliu tanto o mRNA da XBP1s como as isoformas proteicas, confirmando que a formação da forma emendada dependia da actividade da IRE1a (Fig. 1d, e).

Estes resultados confirmam que a via IRE1a-XBP1 é conservada nos linfócitos Th2 e upregulada durante a activação das células auxiliares T in vitro. Em seguida, começamos a investigar se esta também se mantém in vivo.

Células T helper activadas in vivo upregulam a via IRE1a-XBP1

Para testar se a via IRE1a-XBP1 está operacional em células T CD4+ in vivo, infectamos ratos C57BL/6 com o parasita helminto Nippostrongylus brasiliensis, um modelo bem estabelecido de respostas imunitárias Th2. Após 7 dias pós-infecção, analisamos a expressão da proteína XBP1s nas células T helper por citometria de fluxo. Encontramos células T helper de ratos infectados com vermes expressam significativamente mais XBP1 em comparação com ratos de controle não infectados, sugerindo uma upregulação da via (Fig. 2).

Estes resultados confirmam que o caminho está ativo in vivo. Portanto, nós nos propusemos a dissecar a via usando abordagens genômicas em linfócitos Th2.

Análise transcriptômica de expressão gênica diferencial em todo o genoma revela genes regulados pela IRE1a-XBP1

Para capturar um papel regulador global do gene da via IRE1a-XBP1, nós comparamos células Th2 ativadas in vitro com células com atividade endonuclease IRE1a inibida, adicionando 4μ8c aos meios de cultura celular. Comparamos então os transcriptomas de linfócitos Th2 ativados com ou sem inibição da via IRE1a-XBP1. Transcriptomas de células Th2 tratadas e não tratadas de 4μ8c foram obtidos por sequenciamento do mRNA (RNA-seq). O controlo de qualidade dos dados da sequenciação do RNA é mostrado no ficheiro adicional 1: Figura S3. Comparando os transcriptomas de linfócitos Th2 naïve e ativados, descobrimos que 10995 genes foram regulados diferentemente na ativação do Th2. Inibição da via IRE1a-XBP1 pelo tratamento 4μ8c resultou na expressão diferencial de 3144 genes em comparação com o controle Th2 não tratado (Fig. 3a, arquivo adicional 1: Figura S3 painel direito). Dois mil seiscentos e setenta desses genes estavam envolvidos na diferenciação do Th2 (Fig. 3a). O agrupamento hierárquico dos genes revela os grupos de genes para cima e para baixo no tratamento 4μ8c (Arquivo adicional 1: Figura S3, à direita). O exame detalhado destes genes revelou que muitos estão associados à resposta protéica desdobrada e ao estresse ER, indicando um grande impacto da via IRE1a-XBP1 (Fig. 3b) sobre estes processos biológicos. A lista completa dos genes expressos diferentemente pode ser encontrada no arquivo adicional 2: Tabela S1. A análise da Ontologia Genética (GO) destes genes diferentemente expressos no 4μ8c tratamento de células Th2 (ou seja, genes regulados pela via IRE1a-XBP1) mostrou que eles são enriquecidos nos seguintes processos biológicos: “Resposta ao estresse ER” (GO:0006950), “Regulação da transdução de sinal” (GO:0009966), “Produção de citocinas” (GO:0001816), “proliferação celular” (GO:0008283), “ciclo celular” (GO:0007049), e Resposta imune (GO:0006955) (Fig. 3c). Estas mudanças nos padrões de expressão gênica após a inibição da IRE1a sugerem um extenso envolvimento do fator de transcrição da XBP1 na ativação e proliferação do Th2, assim como diferenciação. Portanto, nós nos propusemos a encontrar os padrões de ocupação de cromatina em todo o genoma do fator de transcrição da XBP1.

XBP1 ChIPmentation reveals XBP1 direct target genes in Th2 cells

To identify the genome-wide chromatin occupancy of XBP1, realizamos a ChIPmentation, um método recentemente desenvolvido que se mostrou mais rápido, sensível e robusto que as abordagens tradicionais ChIP-seq , usando um anticorpo de grau ChIP contra XBP1. Foram utilizadas células Th2 diferenciadas e reativadas in vitro para o ChIP XBP1. Foram realizadas duas réplicas biológicas independentes. Obtivemos 19,3 milhões e 22,4 milhões de leituras de final de par para cada réplica, respectivamente. Utilizando MACS2 com valor q inferior a 0,01 e enriquecimento por dobra acima de 5, identificamos 9031 e 7662 picos, respectivamente, nas duas réplicas. A análise de sobreposição usando bedtools sugeriu que 5892 picos estavam presentes em ambas as réplicas. Portanto, focamos apenas nestes 5892 picos para a análise a jusante.

Como esperado, foram identificados picos de ligação em torno das regiões promotoras nos genes-alvo conhecidos da XBP1, como o Hspa5 que codifica a proteína ER-chaperone BiP também conhecida como Grp78; também foi observado um evento de ligação em torno do próprio promotor da XBP1 (Fig. 4a), indicando uma potencial auto-regulação da XBP1. Para descobrir as características genómicas associadas aos locais de ligação da XBP1, comparámos a sua localização de pico com os genes RefSeq usando o HOMER . A maioria dos picos de ligação da XBP1 estava localizada dentro do promotor (definido como upstream 1000 bp e downstream 500 bp em relação a locais de início transcripcionais anotados) (36%) e regiões intrônicas (35%), e evento de ligação intergênica distal (25%) também foram frequentemente observados (Fig. 4b). A distribuição genômica dos picos do XBP1 indica que ele liga tanto promotores quanto potenciais melhoradores.

Para caracterizar melhor o regulador XBP1, realizamos a descoberta de novo motivo usando HOMER para identificar motivos de DNA enriquecidos dentro das regiões de ligação da XBP1. O motivo superior identificado é a sequência de consenso GCCACGT, que é quase idêntica ao motivo de ligação do XBP1 humano definido nas linhas celulares do cancro da mama (Fig. 4c) . Isto indica especificidades de ligação altamente conservadas da XBP1 entre o humano e o rato e entre os tipos de células. O motivo superior enriquecido nos dados do nosso rato também se assemelha ao motivo XBP1 da base de dados JASPAR , mais uma vez apoiando a alta qualidade dos nossos dados de ChIPmentation. O segundo motivo mais enriquecido é o motivo de ligação NF-Y (ficheiro adicional 1: Figura S4C). Curiosamente, o motivo NF-Y tem sido frequentemente encontrado em torno de regiões promotoras de genes do ciclo celular, especialmente genes envolvidos na regulação do ciclo celular G2/M . Tanto o motivo XBP1 quanto o motivo NF-Y co-ocorreram em torno de um subconjunto de 258 picos de ligação XBP1 (Fig. 4d), indicando uma potencial cooperação entre os fatores de transcrição XBP1 e NF-Y para regular um subconjunto de genes-alvo. A lista de genes alvo que são potencialmente co-regulados pelo XBP1 e NF-Y é exibida no arquivo adicional 3: Tabela S2, e uma lista completa dos alvos do XBP1 também é fornecida no arquivo adicional 3: Tabela S2. Os cinco principais motivos enriquecidos são mostrados no arquivo Adicional 1: Figura S4C. Para investigar as funções dos genes ligados ao XBP1, utilizamos GRANDE para caracterizar os picos de ligação do XBP1. A maioria dos termos GO significativos estão relacionados com dobramento proteico e estresse ER (Fig. 4e), o que é consistente com o papel biológico conhecido do XBP1.

Junto, os experimentos de ChIPmentation predizem um papel do XBP1 no aumento do dobramento proteico e secreção, bem como a ativação de linfócitos Th2.

Integração de dados transcriptómicos e dados ChIP-seq para desvendar a rede reguladora de genes controlada pela XBP1

Para revelar os genes alvo directos regulados pela XBP1 e a sua rede reguladora transcripcional, integramos os dados transcriptómicos de todo o genoma e os dados da ChIPmentation. Um gene alvo direto é definido por sua expressão diferencial na inibição do IRE1a (ou seja, tratamento 4μ8c) e na ocupação do fator de transcrição do XBP1 no locus gênico. Encontramos 1143 genes alvo direto no Th2, dos quais 122 alvos foram previamente reportados como alvo direto da XBP1 em outros tipos de células (i.e., músculo, célula β pancreática e plasmócito) (Fig. 5a). Neste contexto, 1021 genes podem ser considerados como específicos de Th2. A ação da XBP1 sobre seus alvos diretos não tem direção definida, contendo genes para cima e para baixo regulados. Os 38 genes superiores que seguem um destes padrões são mostrados na Fig. 5b, e a lista completa pode ser encontrada no arquivo adicional 4: Tabela S3. Os processos e caminhos biológicos identificados mais significativos estão relacionados ao dobramento de proteínas e estresse ER (arquivo adicional 1: Figura S5), que são consistentes com seus papéis biológicos conhecidos, e também incluem novos alvos específicos Th2.

Apesar da preponderância do papel da XBP1 no controlo desta via, outros factores de transcrição também são encontrados envolvidos. Para examinar a cascata regulatória que segue a regulação da XBP1, construímos uma rede regulatória transcripcional extraindo fatores de transcrição anotados com o promotor ou picos exônicos/intrônicos de ChIP-seq (Fig. 5c). A lista completa dos fatores de transcrição pode ser encontrada no arquivo adicional 5: Tabela S4. Esta rede foi ainda complementada com a adição de genes expressos diferentemente que têm interacções anotadas com os factores de transcrição alvo na base de dados STRING (Ficheiro adicional 6: Tabela S5).

Os factores de transcrição que são directamente regulados por XBP1 podem ser categorizados em três grandes categorias funcionais envolvidas nas seguintes: resolução do stress ER secretor de proteínas, regulação do ciclo e proliferação celular e controlo da função das células imunitárias effector. Os fatores de transcrição do estresse ER envolvidos na transcrição são susceptíveis de facilitar a secreção de citocinas no linfócito Th2. Esta previsão é baseada nos relatórios anteriores de células secretoras como as células acinaras pancreáticas e plasmócitos. Estes factores de transcrição, nomeadamente Bhlha15, Atf3, Atf6, Atf6b, Atf4, e Creb3l2, demonstraram estar envolvidos na adaptação secreta do ER ao stress .

O objectivo da proliferação celular e dos factores de transcrição relacionados com o ciclo celular poderia ser o de facilitar a expansão rápida controlada das células Th2 activadas. Os fatores relacionados à resposta imune estão provavelmente envolvidos na diferenciação do Th2 e na produção de citocinas. Portanto, quisemos testar o efeito da desregulação da XBP1 na secreção de citocinas, proliferação celular e produção de citocinas.

A via IRE1a-XBP1 controla a secreção de citocinas em células T helper

A comparação genómica dos genes regulados pela XBP1 prediz que o factor está envolvido na secreção de citocinas. Para validar essa previsão, bloqueamos a atividade de endonuclease IRE1a em células Th2 e analisamos o sobrenadante da cultura celular para quantificar o nível de IL4 pelo ELISA. Selecionamos a IL4 como candidata a citocina testable porque seu mRNA e proteína não foram alterados pela desregulamentação do XBP1 (arquivo adicional 1: Figura S6A painel esquerdo, Fig. 6 painel esquerdo e médio da linha superior). Verificamos que a secreção de IL4 é significativamente inibida nas células tratadas em 4μ8c (Fig. 6, painel direito da fileira superior). Como esperado, este resultado suporta o envolvimento da via IRE1a-XBP1 na facilitação da secreção de citocinas nas células Th2, como previsto. A inibição da via durante a fase de reestimulação não tem efeito inibitório significativo na secreção de IL4 (arquivo adicional 1: Figura S6B). Este resultado sugere que as XBP1s são necessárias durante a diferenciação de Th2, possivelmente para o desenvolvimento de uma máquina secretora eficiente.

A via IRE1a-XBP1 controla a expressão de citocinas IL13 e IL5

IL5 e IL13 são duas citocinas proeminentes do tipo 2 que estão envolvidas na eosinofilia, alergias e infecção por helmintos. Descobrimos que a inibição da via IRE1a-XBP1 suprime significativamente a expressão e secreção das proteínas IL5 e IL13 no meio de cultura (Fig. 6 painéis direitos das fileiras média e inferior). A análise bioinformática do transcriptoma Th2 prediz que a via IRE1a-XBP1 controla positivamente a expressão dos genes IL5 e IL13, pois ambos os genes foram identificados como genes expressos diferencialmente na inibição da IRE1a (arquivo adicional 2: Tabela S1). Validamos esta predição pela análise da expressão gênica mediada por RT-qPCR (arquivo adicional 1: Figura S6A, painel médio e direito) e citometria de fluxo (Fig. 6). Estes resultados sugerem um envolvimento transcripcional da via que regula a IL5 e a IL13. Notavelmente, os níveis de mRNA e proteína da IL4 não são afetados indicando regulação específica de IL5 e IL13.

IRE1a-XBP1 via facilita a proliferação da célula auxiliar T dependente de ativação

A taxa de proliferação de células é um resultado resultante da interação de reguladores positivos e negativos. Observamos que os genes que codificam os reguladores positivos e negativos dos genes de proliferação celular são expressos diferentemente quando a via IRE1a-XBP1 foi bloqueada por 4μ8c (Fig. 7a, painel esquerdo, arquivo adicional 7: Tabela S6), dos quais muitos genes foram encontrados como alvos diretos do XBP1 (Fig. 7a, painel direito, arquivo adicional 8: Tabela S7). Esta observação prevê uma mudança na taxa de proliferação após a inibição da IRE1a. Portanto, nós estávamos interessados em verificar o efeito da inibição da IRE1a-XBP1 sobre a proliferação celular. Realizamos o ensaio de proliferação celular usando células Th2. As células T CD4+ esplênicas naïve foram rotuladas com CellTrace violeta e ativadas sob condição de diferenciação Th2 na presença ou ausência de 4μ8c. A decadência do corante fluorescente foi monitorizada por citometria de fluxo. Verificamos que a desregulação do XBP1 inibe significativamente a proliferação celular (Fig. 7b), mas não induz a morte celular (arquivo adicional 1: Figura S7).

A proliferação celular auxiliar está associada à diferenciação e produção de citocinas. A expressão reduzida de IL5 e IL13 (Fig. 6) poderia ser potencialmente explicada pelo fato de que a proliferação celular é retardada. Entretanto, se a redução da proliferação fosse a principal razão para a falta de secreção, a produção de IL4 também seria inibida. Ainda assim, não observamos nenhuma mudança significativa na expressão da IL4 após a inibição da IRE1a (Fig. 6, arquivo adicional 1: Figura S6A). Para examinar essa discrepância, realizamos ensaios de proliferação celular usando linhas de mouse com IL13-GFP e IL4-GFP. Na IL4-GFP expressando células Th2, observamos uma inibição da produção de IL4 nas primeiras gerações de divisão celular até 72 h no tratamento 4μ8c (arquivo adicional 1: Figura S8). Mas com 96 h, a diferença na expressão de IL4 torna-se insignificante, independentemente da geração de divisão celular em que as células se encontram. Esta observação sugere que o retardo de proliferação devido à inibição da IRE1a não é suficiente para inibir a expressão da IL4. Em contraste, na IL13-GFP, observamos a diminuição da expressão da IL13 desde a primeira geração e isto continua nas gerações posteriores (arquivo adicional 1: Figura S9).

IRE1a inibição retarda a progressão do ciclo celular através da fase S e G2/M

Análise bioinformática dos genes diferencialmente expressos (Th2 vs. Th2 tratado em 4μ8c) e os genes alvo diretos XBP1 revelam vários genes que estão envolvidos no controle da progressão do ciclo celular através de diferentes estágios (i.e, G1, S, G2/M) foram agrupados em dois grupos, para cima ou para baixo (Fig. 8a). Pegamos genes diferentemente expressos no Th2 tratado em 4μ8c comparado ao Th2 não tratado (valor de p ajustado < 0,05) (Fig. 8a, à esquerda, arquivo adicional 9: Tabela S8) e os genes diferentemente expressos no XBP1, genes alvo direto (Fig. 8a, à direita, arquivo adicional 10: Tabela S9), e verificamos as funções conhecidas em diferentes estágios do ciclo celular usando uma lista curada manualmente com base nos dados do RNA-seq ou um banco de dados publicado. Encontramos muitos genes de todos os estágios do ciclo celular (isto é, G1, S, e G2/M) que foram afetados. Para identificar os estágios do ciclo celular regulados pela via IRE1a-XBP1, criamos e usamos uma linhagem transgênica de mouse FUCCI (indicador fluorescente do ciclo celular da ubiquitina) que expressa Cdt1 com marcação mCherry e proteína Geminina com marcação mVenus. A estirpe é semelhante à utilizada em . As células G1 são mCherry+ mVenus- (Q3; Fig. 8b), as células G1-S são mCherry+ mVenus+ (Q2; Fig. 8b), e as SG2M são mCherry- mVenus+ (Q1; Fig. 8b), enquanto as células em mitose e que entram em G1 são mCherry- mVenus- (Q4; Fig. 8b). Comparamos os perfis do ciclo celular do veículo e as células Th2 tratadas com 4μ8c durante a ativação da célula T. Verificamos que células acumuladas na fase S e/ou G2/M quando a via IRE1a-XBP1 é bloqueada (Fig. 8b). Resultados similares foram obtidos em uma abordagem diferente usando o ensaio de incorporação BrdU com coloração DAPI (arquivo adicional 1: Figura S10).

Expressão transgênica de XBP1s complementa a inibição mediada por 4μ8c da atividade endonuclease IRE1a

Para testar se os fenótipos tratados com 4μ8c observados foram devidos à perda de XBP1s, realizamos ensaios de complementação através da transdução de um vector de expressão XBP1s para as células Th2 in vitro. O vector codificou a forma emendada da XBP1 (XBP1s), cuja função é independente da função IRE1a. Verificámos que a expressão ectópica estável da XBP1s nega o efeito do tratamento 4μ8c e não há alteração significativa no transcriptoma no tratamento 4μ8c quando as células Th2 sobreexpressam a XBP1s (ficheiro adicional 1: Figura S11A). As XBP1s que superexpressam as células Th2 proliferam e diferenciam-se normalmente na presença de 4μ8c (Arquivo adicional 1: Figura S11B e S11C respectivamente). Estes resultados sugerem fortemente que os fenótipos observados no tratamento 4μ8c são devidos à perda de XBP1s.

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