Por Sara Ryding, B.Sc.Reviewed by Deepthi Sathyajith, M.Pharm.

Sequenciamento de bissulfito de genoma inteiro, ou WGBS, é uma técnica de sequenciamento de próxima geração para analisar a metilação do DNA.

Crédito da imagem: Egorov Artem /

A metilação do ADN é um mecanismo epigenético para regular a expressão gênica e envolve a adição de um grupo metilo a uma base de citosina. Os padrões anormais de metilação têm sido associados a várias condições e doenças, como o câncer. Desde o desenvolvimento do WGBS, ele tem sido aplicado para estudar a reprogramação epigenética, assinaturas epigenéticas e outras.

Basic methodology

WGBS combina o uso do tratamento com bissulfato de sódio e sequenciamento de DNA de alto rendimento. O bissulfito de sódio protege as citosinas metiladas, ou metilcitosinas, da conversão, enquanto que as citosinas não metiladas são convertidas em uracilo.

As citosinas não metiladas são então convertidas para timina após PCR, o que significa que os resultados da sequência mostram predominantemente adenina, guanina e bases de timina, com quaisquer bases de citosina indicando sítios de citosina metilada.

O método foi inicialmente tentado em Aradopsis thaliana, uma planta, devido ao seu genoma relativamente pequeno. Desde então, provou ser capaz de analisar cerca de 90% de todas as citosinas que foram tentadas. A técnica WGBS tem sido aplicada aos genomas de humanos, ratos, milho e soja.

Aplicações com células-tronco

Células-tronco são células indiferenciadas que retêm a capacidade de se tornar qualquer tipo de célula, como neurônios ou células musculares. Isto as torna de grande interesse para biólogos do desenvolvimento e eventuais aplicações na medicina, para entender o que as torna diferentes das células maduras.

Os primeiros mapas de citosinas metiladas de base única e ampla em células-tronco embrionárias humanas e fibroblastos fetais mostraram grandes diferenças entre as duas. Em células embrionárias, quase um quarto de todas as metilações identificadas estava em um contexto de guanina não citosina (CG), enquanto nas células fetais 99,98% das metilcitosinas estavam no contexto de GC.

Contexto não-CG significa que estava em CHG ou CHH, onde H representa adenina, timina, ou citosina. Antes disso, acreditava-se predominantemente que quase toda a metilação do DNA de mamíferos ocorria no contexto CG, enquanto este estudo indicou que pode ser uma característica geral nas células-tronco embrionárias humanas.

Metilação não-CG parecia ser perdida na diferenciação. A metilação não-CG foi restaurada quando as células fetais foram manipuladas em células estaminais pluripotentes induzidas. Isto também demonstra que a metilação CHG e CHH não se deve a diferenças genéticas, mas é uma característica das células estaminais embrionárias.

O estudo anterior indicou que as células estaminais, quer fossem células estaminais pluripotentes induzidas ou células estaminais embrionárias, partilhavam características epigenéticas através da metilação. As células estaminais são tremendamente importantes para fins terapêuticos e para o estudo de doenças. Elas diferem das células somáticas por transformações epigenómicas e não genéticas, tornando o estudo do seu padrão de metilação altamente interessante.

Um estudo de seguimento focado nas diferenças entre as células estaminais embrionárias e as células estaminais pluripotentes induzidas e descobriu que enquanto o seu padrão de metilação é muito semelhante a nível global, as células estaminais pluripotentes induzidas apresentam uma variação substancial na reprogramação em comparação com as células estaminais embrionárias. Assim, enquanto o WGBS tem ajudado a elucidar muito sobre as células-tronco, certas questões ainda permanecem.

WGBS em biologia do desenvolvimento

A metilação do DNA é importante durante o desenvolvimento normal em mamíferos. Em particular, a metilação não-GC é generalizada em células-tronco pluripotentes e oócitos.

Pesquisadores têm usado o WGBS para explorar este conceito mais a fundo e descobriram que quase dois terços de toda a metilação em oócitos da vesícula germinal de camundongos ocorre em um contexto não-GC. Eles também descobriram que a metilação de locais não-CG acumulados durante o crescimento dos oócitos.

Metilação não-CG parece depender de algumas metiltransferases em particular, ou seja, o complexo de metiltransferases do DNA, ou seja, o complexo Dnmt3s-Dnmt3L. Em contraste, o Dnmt1 parecia manter a metilação de CG.

A herança da programação epigenética é mais comum em plantas do que em mamíferos. Um estudo centrado na metilação descobriu que, usando WGBS, a linha germinativa da planta preservou a metilação de CG e CHG. Isto contrasta com os mamíferos em que a metilação do CHH se perde nos microporos e espermatozóides. Entretanto, ela é restaurada pela metiltransferase de novo DNA guiada por pequenos RNA após a fertilização.

WGBS para o diagnóstico precoce de doenças

Estudos demonstraram que o WGBS pode ser usado para detectar a metilação anormal através do rastreamento de genes supressores hipermetilados específicos, como visto em cânceres como a leucemia promielocítica aguda, câncer gástrico, etc.

Aplicações do WGBS na ciência forense

Estudos forenses foram realizados em amostras de sangue seco usando o WGBS após a extração do DNA. O uso do WGBS fornece amostras de alta qualidade que melhoram a análise da metilação do DNA em manchas forenses.

Em resumo, o WGBS está se tornando cada vez mais popular no estudo da metilação do DNA devido à capacidade desta técnica de estimar a metilação do DNA genômico convertido em bissulfito com uma única resolução de nucleotídeos.

Embora o WGBS seja uma ferramenta muito eficiente para a compreensão da reprogramação epigenética, é de igual importância desenvolver e manter uma tecnologia de alta sequenciação econômica que possa ser usada em vários campos da pesquisa científica.

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Escrito por

Sara Ryding

Sara é uma apaixonada escritora de ciências da vida, especializada em zoologia e ornitologia. Ela está atualmente concluindo um doutorado na Universidade Deakin na Austrália, que se concentra em como os bicos das aves mudam com o aquecimento global.

Citações