3.06.4.1.1 Saccharomyces gist

Eerdere studies hadden aangetoond dat de Saccharomyces gist xylulose kan vergisten tot ethanol, zij het niet efficiënt. Theoretisch ontbreekt het Saccharomyces-gist dus alleen aan het enzym (de enzymen) om xylose om te zetten in xylulose. Zoals hierboven beschreven, zetten bacteriën xylose om in xylulose met een enkel enzym dat geen cofactoren nodig heeft (figuur 3). Het xylose-tot-xylulose-systeem van gist vereist daarentegen twee enzymen die metabolisch niet ideaal zijn, zoals hierboven beschreven. Aanvankelijk probeerden bijna 10 verschillende laboratoria wereldwijd een bacterieel xylose-isomerasegen in gist te klonen. Ho et al. van de Purdue University waren de eerste groep die erin slaagden het gen voor xylose-isomerase uit Escherichia coli te klonen. Het eiwit dat in gist werd gesynthetiseerd door het gekloonde bacteriële gen had echter geen xylose-isomerase-activiteit.

Een tweede benadering was het klonen van de XR- en XD-genen van P. stipitis in Saccharomyces-gist. De kinetiek van deze enzymen en het thermodynamische evenwicht van de reactie zijn echter gunstig voor de productie van xylitol in plaats van ethanol. In het begin van de jaren negentig meldden drie groepen (Kotter, Ciriacy en collega’s aan de Universiteit van Düsseldorf, Tantirungkij en collega’s aan de Universiteit van Osaka, en Hahn-Hägerdal en collega’s aan de Universiteit van Lund) de succesvolle klonering van de XR- en XD-genen in Saccharomyces-gist om deze in staat te stellen xylose te fermenteren. De recombinante gist die door deze groepen werd ontwikkeld fermenteerde xylose echter uiterst langzaam en produceerde weinig ethanol; het belangrijkste stofwisselingsproduct was xylitol.

De Ho-groep veronderstelde dat overexpressie van het eigen xylulokinase (XK) samen met XR en XD van P. stipitis de stroom van xylose door het metabolisme naar ethanol zou verbeteren door de intracellulaire concentratie van xylulose te verlagen. Aangezien xylulokinase een irreversibele reactie op de productie van ethanol katalyseert (figuur 3), zal een hoge xylulokinase-activiteit resulteren in lage xyluloseconcentraties. Dit is wenselijk omdat het evenwicht van de XD-gekatalyseerde reactie de voorkeur geeft aan xylitol, en lage steady-state concentraties van xylulose nodig zijn om de metabolische flux in de richting van ethanolproductie te sturen. Bovendien maakte het klonen van deze drie genen het mogelijk hun expressie in de cel te controleren. Onder het eigen expressie-controlesysteem van de cel wordt hun expressie geïnduceerd door de aanwezigheid van xylose en geremd door glucose. De resulterende recombinante gist zou in staat kunnen zijn om glucose en xylose gelijktijdig tot ethanol te vergisten zonder de lange vertragingsperiode tussen de vergisting van glucose en xylose, hetgeen uiterst wenselijk zou zijn voor de industriële productie van ethanol.

In 1989 meldde de Ho-groep van Purdue voor het eerst het klonen van het xylulokinase-gen van de Saccharomyces gist. Vervolgens verving de Ho-groep de DNA-sequenties stroomopwaarts van de structurele genen XR, XD en XK door stroomopwaartse sequenties van de glycolytische genen die effectieve constitutieve promotors bevatten. De resulterende XR-, XD- en XK-genen werden gekloond op een plasmide met een hoog kopiegetal van 2μ en het resulterende plasmide, pLNH32, werd gebruikt om een stam van wild-type industriële Saccharomyces-gist te transformeren, waarvan bekend is dat deze superieur is voor de productie van ethanol met zetmeel (glucose) als grondstof. In 1993 meldde dezelfde groep de succesvolle ontwikkeling van de recombinante Saccharomyces gist 1400 (pLNH32) die hoge concentraties xylose bijna volledig kon vergisten tot ethanol met zeer weinig xylitol als bijproduct. Bovendien kon de resulterende gist glucose en xylose co-fermenteren tot ethanol zonder veel vertraging tussen de fermentatie van deze twee suikers, hoewel de fermentatiesnelheid van xylose langzamer is dan die van glucose (figuur 4). Vervolgens werden de details van de constructie en ontwikkeling van de 1400 (pLNH 32) gerapporteerd. Sindsdien is de groep Ho doorgegaan met het verbeteren van de gist met verschillende nieuwe benaderingen, zoals hieronder beschreven.

Figuur 4. (Links) Saccharomyces giststam 1400, getransformeerd met het moederplasmide pLNH32 dat hetzij geen XR-, XD- of XK-genen bevat, hetzij alleen XR- en XD-, maar geen XK-genen bevat, gebruikt voor de fermentatie van een mengsel van glucose en xylose. (Rechts) gist uit 1400, getransformeerd met plasmide pLNH32, dat gekloonde XR-, XD- en XK-genen bevat. De gist werd gebruikt om glucose en xylose te fermenteren onder identieke omstandigheden als de resultaten beschreven in de linker figuur. De in deze plasmiden gekloonde genen werden op identieke wijze gemodificeerd en geconstrueerd als beschreven in referentie 9.

De 2 μ-plasmide, pLNH32, die het gekloonde XR-XD-XK-gen bevat, is een breed gastheerplasmide dat is ontworpen om alle Saccharomyces-giststammen te kunnen transformeren, met inbegrip van industriële wild-type Saccharomyces-gist. Een dergelijk plasmide kan worden gebruikt om betere gastheren voor cellulose-ethanolproductie te screenen. De Ho-groep ontwikkelde ook een unieke nieuwe gen-integratietechniek die de effectieve integratie van meerdere genen in het gistchromosoom in meervoudige kopieën mogelijk maakt. Deze techniek is gemakkelijk uit te voeren en garandeert bijna dat de genen die op het integratieplasmide zijn gekloneerd en in de gistgastcellen zijn getransformeerd, in zoveel kopieën als gewenst in het gastheergenoom kunnen worden geïntegreerd om de beste activiteiten te leveren (figuur 5). Deze integratietechniek werd gebruikt om de stabiele xylose-fermenterende 1400 stam, 1400 (LNH-ST), te ontwikkelen door eerst de XR-XD-XK genen samen als een cassette in het gistchromosoom te integreren in voldoende kopieën totdat de resulterende gist xylose vergistte met de hoogste efficiëntie (figuur 6). De huidige beste stam die door de groep Ho is ontwikkeld, 424A (LNH-ST), werd gescreend uit 10 verschillende stammen Saccharomyces-gist door elke stam eerst te transformeren met de 2 μ-plasmide pLNH32 om er zeker van te zijn dat deze stammen in staat waren om zowel xylose als glucose/xylose effectief te co-fermenteren in aanwezigheid van pLNH32, gevolgd door het integreren van genen in de chromosomen van de geselecteerde giststammen om de “stabiele gist” te ontwikkelen met behulp van deze nieuwe integratietechniek. De co-fermentatie van glucose/xylose door 424A (LNH-ST) wordt getoond in Figuur 7.

Figuur 5. Demonstratie van de stapsgewijze integratie van meerdere kopieën van XR-XD-XK-genen in de chromosomen van Saccharomyces gist stam 259 door de methode beschreven in Ho et al. . Gisten in verschillende stadia van integratie werden gebruikt om glucose en xylose te fermenteren onder identieke omstandigheden om de voortgang van de integratie van deze genen aan te tonen: a) in het beginstadium van integratie, b) 25% van voltooiing, c) 50-75% van voltooiing, d) na voltooiing van integratie. De voltooiing van de integratie wordt weerspiegeld door cellen van het integratieproces die gedurende een voldoende lange periode dezelfde gistingsresultaten produceren.

Figuur 6. Co-fermentatie van glucose en xylose met 1400 (LNH-ST) met meerdere kopieën van XR-XD-XK-genen geïntegreerd in de gistchromosomen volgens de methode van Ho et al. .

Figuur 7. Co-fermentatie van glucose en xylose met 424A (LNH-ST) recombinante Saccharomyces-stam met meerdere kopieën van XR-XD-XK-genen geïntegreerd in de gistchromosomen van Saccharomyces-stam 424A volgens de methode van Ho et al. . Dit is de beste Ho-Purdue-gist die vóór 2007 aan de Purdue University is ontwikkeld en momenteel aan de industrie wordt geleverd voor de productie van cellulose-ethanol.

Als een recombinant micro-organisme wordt gebruikt voor grootschalige industriële productie, zoals voor de productie van ethanol, is het om twee belangrijke redenen noodzakelijk de te klonen genen in de gastheerchromosomen te integreren. Ten eerste kunnen, als de gekloonde genen met een betrouwbare methode in de gastheerchromosomen worden geïntegreerd, de gekloonde genen op het gastheerchromosoom in stand worden gehouden zonder dat het gebruik van speciale chemicaliën, media, antibiotica en additieven nodig is. Het gebruik van chemicaliën of antibiotica om de eigenschappen in stand te houden brengt niet alleen extra kosten met zich mee, maar ook kosten en moeilijkheden in verband met de wettelijke goedkeuringsprocedure en het opruimen van eventueel geloosd afvalwater. Zelfs in aanwezigheid van een selectief middel zijn plasmiden met een hoog kopie-aantal, zoals pLNH32, die worden gebruikt voor het klonen van de genen in de gastcellen, wellicht niet in staat om op grote schaal industrieel te werken. De groep Ho toonde aan dat de stabiele gist ontwikkeld met behulp van het nieuwe integratiesysteem, 1400 (LNH-ST), in staat was om de continue fermentatie van maïsstengelhydrolyzaten tot ethanol in een proeffabriek te ondersteunen, terwijl dezelfde giststam die het plasmide, 1400 (pLNH32), bevatte, hier niet toe in staat was.

De stam 424A (LNH-ST) en andere stabiele stammen, 1400 (LNH-ST) en 259 (LNH-ST), die met de nieuwe integratietechniek zijn ontwikkeld, zijn alle door anderen gevalideerd en hebben bewezen duurzaam en effectief te zijn voor de productie van cellulose-ethanol met hydrolyzaten van verschillende lignocellulose-grondstoffen. De stam 424A (LNH-ST) wordt sinds 2004 ook industrieel gebruikt voor de productie van cellulose-ethanol uit landbouwresidu in een demonstratiefabriek.

De door Hahn-Hägerdal ontwikkelde recombinante gist is uitgebreid verbeterd door het kloneren van verschillende extra genen, waaronder het kloneren van het xylulokinase-gen nadat de Ho-groep aan de Purdue University had aangetoond dat verhoogde expressie van dit inheemse gen de ethanolopbrengst uit xylose verbetert.

De door de Ho-groep aan Purdue ontwikkelde gist is beschikbaar voor industriële productie van cellulose-ethanol. Zij zal waarschijnlijk een goede kans van slagen hebben, omdat het een industriële ethanolproducerende gist is, die uitvoerig is getest. Onlangs heeft de Purdue groep de stam verder verbeterd door haar arabinose te laten co-fermenteren met de andere vier suikers (glucose, xylose, mannose, en galactose), en door haar resistenter te maken tegen ethanol en tegen azijnzuur.

Ondanks dat de vroege poging om een xylose isomerase-gebaseerde Saccharomyces xylose-fermenterende gist te ontwikkelen niet succesvol was en er een effectieve XR/XD-gebaseerde gemanipuleerde xylose-fermenterende gist was ontwikkeld, is de interesse in de ontwikkeling van een xylose isomerase-gebaseerde xylose-fermenterende gist door de jaren heen blijven bestaan, deels omdat deze pathway geen redox disbalans heeft. In 2009 construeerden Brat et al. xylose-fermenterende S. cerevisiae met behulp van xylose-isomerase van Closteidium phytofermentans. Eveneens in 2009 meldde Cargill de ontwikkeling van een niet-Saccharomyces giststam die xylose-isomerase tot expressie brengt en in staat is om efficiënt een mengsel van glucose en xylose te fermenteren bij lage pH en in aanwezigheid van 1% azijnzuur.

Ondanks dat arabinose slechts in kleine hoeveelheden aanwezig is in biomassa van grassen als onderdeel van GAX hemicellulose, bevatten enkele speciale biomassabronnen zoals maïsvezels wel relatief grote hoeveelheden arabinose. Niettemin is het ideaal om de cellulose-ethanol producerende microben in staat te hebben om alle vijf verschillende suikermoleculen aanwezig in cellulosehoudende biomassa te fermenteren, aangezien recycling van processtromen binnen een industrieel proces de concentratie van minder belangrijke componenten kan verhogen .

Het mechanisme van arabinose metabolisme in micro-organismen is net zo ingewikkeld als xylose metabolisme. Opnieuw is het mechanisme van arabinosemetabolisme in gist verschillend van bacteriën . Net als bij het xylose-metabolisme is het metabolisme in gist niet bevorderlijk voor het anaërobe metabolisme. Onlangs hebben Hahn-Hägerdal en medewerkers hun xylose-fermenterende Saccharomyces-gist verder gemanipuleerd om arabinose met xylose en andere suikers te co-fermenteren via de fungal l-arabinose pathway . De resulterende gemanipuleerde gist was echter nog steeds niet in staat om arabinose tot een significante hoeveelheid ethanol te vergisten, maar wel om een kleine hoeveelheid arabinose om te zetten in arabitol.