Abstract

Wnt5a is betrokken bij het activeren van verschillende niet-canonieke Wnt signaalwegen, die de canonieke Wnt/β-catenine signaalweg kunnen inhiberen of activeren op een receptorcontext-afhankelijke manier. Wnt5a signaaltransductie is cruciaal voor het reguleren van normale ontwikkelingsprocessen, waaronder stamcel zelfvernieuwing, proliferatie, differentiatie, migratie, adhesie, en polariteit. Bovendien blijkt een afwijkende activatie of inhibitie van Wnt5a signaaltransductie een belangrijke rol te spelen in de progressie van kanker, waarbij zowel oncogene als tumoronderdrukkende effecten optreden. Recente studies tonen de betrokkenheid aan van Wnt5a signalering in de regulatie van normale en kankerstamcel zelfvernieuwing, kankercel proliferatie, migratie, en invasie. In dit artikel bespreken we recente bevindingen met betrekking tot de moleculaire mechanismen en rollen van Wnt5a signalering in stamcellen in embryogenese en in de normale of neoplastische borst of eierstok, waarbij we benadrukken dat Wnt5a verschillende effecten kan hebben op doelcellen, afhankelijk van de oppervlaktereceptoren die door de doelcel tot expressie worden gebracht.

1. Inleiding

Stamcellen, waaronder embryonale stamcellen en stamcellen geïdentificeerd in volwassen weefsels, hebben een vermogen tot zelfvernieuwing en tot het genereren van meer gedifferentieerde nakomelingen. De embryonale stamcel is afkomstig van de binnenste celmassa van de blastocyst, is pluripotent en kan zo alle weefsels van het lichaam genereren. Stamcellen in volwassen weefsels verblijven in gespecialiseerde niches, waar zij verschillende omgevings- en intrinsieke signaalinputs integreren die het lot van de cellen bepalen en de weefselhomeostase in stand houden.

Wnt-factoren zijn een groep van deze signaalmoleculen die op stamcellen in de stamcelniche inwerken om hun vermogen tot zelfvernieuwing in stand te helpen houden. Van Wnt factoren is bekend dat ze zich binden aan verschillende receptoren om de canonieke signaalroute of niet-canonieke signaalroute(s) te transduceren die diverse biologische activiteiten reguleren. De canonieke Wnt signaalweg wordt geïnitieerd wanneer Wnt factoren binden aan Frizzled familie receptoren (Fzd) en lage-densiteit lipoproteïne receptor-gerelateerd eiwit 5/6 coreceptoren (LRP5/6) om complexen te vormen. Dit resulteert in de rekrutering van Axin en dishevelled (Dvl) naar de plasmamembraan en verstoring van het β-catenine degradatiecomplex, wat leidt tot accumulatie van β-catenine in het cytoplasma, dat vervolgens naar de kern transloceert, waar het bindt aan T-celfactor (TCF)/lymfoïde enhancer factor (LEF) familie en activeert de transcriptie van canonieke Wnt doelgenen . Verscheidene Wnt-factoren daarentegen activeren β-catenine-onafhankelijke routes (niet-canonieke Wnt-signaalroutes), bekend als de Wnt-Ca2+ route of planaire celpolariteit (PCP) route, die de celmigratie tijdens de embryogenese sturen.

In muizen en mensen zijn negentien gesecreteerde cysteïnerijke Wnt-familie glycoproteïnen geïdentificeerd. Tijdens de vroege embryogenese van zoogdieren of tijdens het behoud van de homeostase van volwassen weefsels, komen deze Wnt factoren en hun receptoren dynamisch tot expressie om de juiste signalisatie te activeren, om zo de juiste balans tussen proliferatie en differentiatie te verzekeren. Verstoring van de Wnt signalisatie met afwijkende expressie van Wnt factoren, hun receptoren, of stroomafwaartse signaalmoleculen kan leiden tot de ontwikkeling van verschillende humane kankers. Omdat het vermogen tot tumorinitiatie beperkt lijkt te zijn tot een kleine populatie tumorcellen die begiftigd zijn met het vermogen tot zelfvernieuwing en differentiatie, worden zij vaak aangeduid als kankerstamcellen (CSC’s, of tumorinitiatiecellen) . Belangrijker nog is dat de biologie van embryonale stamcellen, normale stamcellen en CSC’s sterk met elkaar verweven is. Dit blijkt uit het feit dat moleculaire signalen (b.v. Wnt signalering) die embryonale stamcellen of volwassen normale stamcellen definiëren en in stand houden, vaak afwijkend geactiveerd worden in tumorcellen.

Een belangrijke focus van deze review is de rol van Wnt5a signalering via verschillende oppervlakte receptoren in de regulatie van stamcellen in embryogenese en in de normale of neoplastische borst of eierstok, omdat er al verschillende uitstekende reviews zijn die aspecten van Wnt signalering in dikke darmkanker behandelen. We hebben de laatste ontwikkelingen samengevat over de signaalwegen die geactiveerd worden door Wnt5a en die een raadsel vormen voor het rationele ontwerp van geneesmiddelen gericht op het verwijderen van de CSC’s (of tumor initiërende cellen) binnen tumoren terwijl de functie van normale weefsels gespaard blijft.

2. Wnt5a Signaling Pathway

Wnt5a is een niet-canoniek Wnt ligand dat evolutionair geconserveerd is en een belangrijke rol speelt in de ontwikkeling. Homozygote Wnt5a knock-out muizen hebben perinatale letaliteit als gevolg van ontwikkelingsstoornissen. Eerdere studies toonden aan dat Wnt5a kan interageren met Fzd2 en receptor tyrosine kinase-achtige weesreceptor 2 (ROR2) om Rac1 te activeren in een β-catenine-onafhankelijke route. Meer recent toonden we aan dat Wnt5a heterooligermisatie van receptor tyrosine kinase-achtige weesreceptor 1/2 (ROR1/ROR2) induceerde, die guanine-uitwisselingsfactoren (GEFs) rekruteerde en activeerde, die op hun beurt respectievelijk RhoA en Rac1 activeerden, wat de chemotaxis en de proliferatie van leukemiecellen bevorderde. Anderzijds, als een andere actie van Wnt5a, concurreerde het met Wnt3a voor binding aan Fzd2, waardoor Wnt3a-afhankelijke LRP6 fosforylering en β-catenine accumulatie in vitro en in intacte cellen werd geremd, waardoor het vermogen van Wnt3a om accumulatie van β-catenine te induceren werd geremd, en daardoor β-catenine-afhankelijke Wnt signalering werd geremd.

Wnt5a kon echter ook de β-catenine-afhankelijke route activeren en secundaire asvorming induceren in Xenopus embryo’s die de Fzd5 receptor coexpresseerden. Vervolgens vond een andere studie dat Wnt5a de canonieke Wnt/β-catenine signalering kon inhiberen in cellen die ROR2 tot expressie brachten, maar ook de canonieke Wnt/β-catenine signalering kon induceren in cellen die Fzd4 en LRP5 tot expressie brachten. Een enkel Wnt5a ligand kan dus verschillende effecten hebben op cellen, afhankelijk van de beschikbaarheid van receptoren. Daarom dicteert de cellulaire context het effect van Wnt5a. Dit zou kunnen verklaren waarom Wnt5a zowel oncogene als tumoronderdrukkende effecten heeft in verschillende kankers.

3. Wnt5a Signaling in Embryonic Stem Cells

De Wnt pathway (geactiveerd door Wnt3a, Wnt5a, of Wnt6) zou ook betrokken kunnen zijn bij het korte-termijn behoud van pluripotentie van zowel muis als menselijke ES cellen. Het eerste bewijs hiervoor werd geleverd door een studie van een farmacologische remmer van glycogeensynthase kinase-3 (GSK3) die de GSK3 activiteit kon moduleren, wat leidde tot activatie van β-catenine canonieke signalering en verhoogde stabiliteit van c-Myc . Wnt5a en Wnt6 bleken vervolgens geproduceerd te worden door embryonale fibroblast feedercellen, die muis ES celdifferentiatie op een serum-afhankelijke manier konden inhiberen. Directe activatie van β-catenine, met behulp van constitutief actief β-catenine (S33Y) zonder de stroomopwaartse componenten van de Wnt/β-catenine te verstoren, recapituleerde volledig het effect van Wnts op ES cellen. Belangrijk is dat Wnt5a ook een krachtige remmer is van β-catenine fosforylering, waardoor β-catenine gestabiliseerd wordt. Deze gegevens suggereren dat Wnt5a signalen afgeeft om β-catenine te stabiliseren en zo de canonieke Wnt/β-catenine signalisatie verder te activeren in muis ES cellen. Tenslotte kan de Wnt/β-catenine route het mRNA voor STAT3, een gekende regulator van de zelfvernieuwing van ES cellen, doen stijgen, wat wijst op een moleculair mechanisme waarbij de Wnt/β-catenine route ES celdifferentiatie verhindert door convergentie met de LIF/JAK-STAT route op het niveau van STAT3. Het blijft echter onduidelijk welke oppervlaktereceptoren betrokken zijn bij de activering van Wnt5a/β-catenine signalering in ES cellen en of niet-canonieke Wnt signalering ook geactiveerd kan worden door Wnt5a in ES cellen.

4. Wnt5a Signaling on Stem Cells in Normal Mammary Gland and Ovarian Tissues

Een lijn van bewijsmateriaal ondersteunt het belang van Wnt in het behoud van stamcellen in de borstklier . Echter, Wnt5a induceert geen β-catenine/TCF transactivatie activiteit in borstklierweefsel. De cellen van de borstklier zijn hyperproliferatief in Wnt5a knock-out muizen, terwijl in de aanwezigheid van ectopische Wnt5a, ductale uitbreiding wordt geremd. Deze fenotypes zijn het omgekeerde van de activatie van canonieke Wnt/β-catenine signalering. Daarom kan Wnt5a de groei van de melkklier beperken en controleren door het onderdrukken van Wnt/β-catenine signalering. Het is dan ook raadselachtig dat deze remming van borstkliergroei niet werd waargenomen in transgene MMTV-Wnt5a stammen.

In het Drosophila germarium, veranderde Wingless (Wg; de vlieg Wnt homoloog) signalering treedt op in ovaria germline stamcellen (GSCs) door verwijdering van zijn regulatoren zoals dishevelled, armadillo, Axin, en shaggy; dit veroorzaakt verlies van GSC, beïnvloedt follikelcel proliferatie, en induceert differentiatie . Het gebruik van conditionele gen targeting voor Wnt5a in ovariële granulosa cellen (GC) resulteert in vrouwelijke subfertiliteit geassocieerd met verhoogde folliculaire atresie en verlaagde ovulatiecijfers. Verdere studie toonde aan dat Wnt5a zijn doelgenen niet reguleert door te signaleren via de Wnt/Ca2+ of planaire celpolariteit route, maar eerder door de canonieke route te remmen, waardoor zowel β-catenine als cAMP responsieve element binding (CREB) eiwitniveaus dalen via een glycogeensynthase kinase-3β-afhankelijke route in ovarium granulosa cellen (GC). Deze gegevens wijzen erop dat Wnt5a nodig is voor normale ovarium follikel ontwikkeling en gonadotropine responsiviteit in granulosa cellen kan tegengaan door onderdrukking van canonieke Wnt/β-catenine signalering.

Collectief, Wnt5a is het meest waarschijnlijk om β-catenine signalering te onderdrukken in normale stamcellen van borstklier en ovarium weefsels, hoewel Wnt5a in staat is om β-catenine signalering te activeren in embryonale stamcellen. Of dit verschil te wijten is aan receptoren die verschillend tot expressie komen in embryonale stamcellen versus stamcellen van de normale borstklier of de eierstok moet verder onderzocht worden.

5. Wnt5a Signaling in Breast Cancer Stem Cells

Wnt factoren kunnen verschillende mammaire epitheelcellen beïnvloeden en een expansie van stamcellen induceren tijdens tumorprogressie. Bovendien werd afwijkende β-catenine expressie geassocieerd met basale, triple-negatieve borstkankers en een slechte klinische uitkomst. Het optreden van afwijkende Wnt signalering in specifieke subtypes van borstkanker wordt minder waarschijnlijk gedicteerd door activering veroorzaakt door somatische mutaties. Mutaties zijn niet geïdentificeerd in CTNNB1, dat codeert voor β-catenine, en mutaties in APC zijn geïdentificeerd in minder dan 20% van de monsters van borstkankerpatiënten. Verder onderzoek is nodig om te bepalen welke Wnt liganden en receptoren deze afwijkende Wnt/β-catenine signalering veroorzaken.

Recentelijk werd in een studie met MMTV-Wnt1 primaire muiscellen gevonden dat zowel recombinant Wnt3a als recombinant Wnt5a de vorming van mammosferen in vitro konden versterken. Wnt5a-geïnduceerde vorming van mammosferen werd niet veroorzaakt door een toename in canonieke Wnt/β-catenine signalering, maar werd in plaats daarvan gemedieerd door niet-canonieke Wnt signalering die het receptor tyrosine kinase ROR2 en de activiteit van het Jun N-terminal kinase, JNK, in muis borstkankercellen nodig heeft. Dit is consistent met de observatie dat patiënten met borstkanker die ROR2 tot expressie brengen een significant kortere overall survival hebben dan patiënten met tumoren zonder expressie van ROR2. Echter, het uitschakelen van ROR2 in menselijke borstkanker cellijnen verminderde zowel β-catenine-afhankelijke en β-catenine-onafhankelijke doelen , wat suggereert dat ROR2 betrokken kan zijn bij zowel β-catenine-afhankelijke en β-catenine-onafhankelijke Wnt signaalwegen. ROR1 lijkt overwegend tot expressie te komen in minder goed gedifferentieerde tumoren met een hoog recidief- en metastaseringspotentieel, die ook markers tot expressie brengen die geassocieerd zijn met epitheliale-mesenchymale transitie (EMT). Omgekeerd zou het uitschakelen van ROR1 in menselijke borstkanker cellijnen de expressie van genen geassocieerd met EMT kunnen verminderen en hun migratie/invasie capaciteit in vitro en hun metastatisch potentieel in vivo verminderen. Zeer recent meldden Chien et al. dat de expressie van ROR1 een onafhankelijke ongunstige prognostische factor zou kunnen zijn bij patiënten met drievoudig-negatieve borstkankers. Of ROR1 een gelijkaardig effect kan hebben als ROR2 op borstkankerstamcellen en welke signaalweg(en) geactiveerd worden door ROR1 in borstkankerstamcellen blijft onbekend.

Een studie op een muismodel van ErbB2-geïnduceerde borstkanker vond tegenstrijdige bewijzen over het effect van Wnt5a op menselijke borstkankerstamcellen. Tijdens ErbB2-geïnduceerde borsttumorigenese, verloren basale tumor-initiërende cellen (TIC), die een verhoogde tumorigene capaciteit vertoonden in vergelijking met de overeenkomstige luminale progenitors, bij voorkeur Wnt5a expressie, zoals bepaald door transcript profiling analyse. Bovendien bevorderde Wnt5a heterozygotie de multipliciteit van tumoren en pulmonale metastase. Als TGFβ substraat induceerde luminale cel-geproduceerde Wnt5a een feed-forward loop die SMAD2 activeerde op een RYK- en TGFβR1-afhankelijke manier om de expansie van basale TIC op een paracriene manier te beperken, een mogelijke verklaring voor het onderdrukkende effect van Wnt5a op de mammatumorigenese. In dit muismodel blijft het onzeker of canonieke Wnt/β-catenine signalering geactiveerd werd of dat Wnt5a ook canonieke β-catenine signalering remde om basale TIC uitbreiding te onderdrukken.

Het Weinberg laboratorium bestudeerde geïmmortaliseerde humane mammarepitheelcellen (mMECs) en ontdekte dat zowel de canonieke als niet-canonieke Wnt pathways samenwerkten met TGFβ signalering in niet alleen het behoud, maar intrigerend genoeg ook de inductie, van stamcel eigenschappen. Bovendien werden alleen de nietcanonieke Wnt liganden Wnt5a en Wnt16 geüpreguleerd gevonden in stamcellen in vergelijking met niet-stemcellen. Daarom is het mogelijk dat Wnt5a of Wnt16 de canonieke of niet-canonieke Wnt signaalroute activeren op een receptorcontext-afhankelijke manier in menselijke borstkankerstamcellen.

6. Wnt5a Signaling in Ovarian Cancer Stem Cells

Gelijkaardig aan borstkanker, is het Wnt5a effect op eierstokkanker ook controversieel. Een vroege studie van primaire eierstoktumoren () die lage niveaus van Wnt5a in eierstokkanker ten opzichte van normale eierstok toonde is voorspellend voor een slechte uitkomst. Ectopische expressie van Wnt5a remt de proliferatie van de menselijke ovariumkanker cellijn OVCAR5 zowel in vitro als in vivo orthotope ovariumkanker muismodellen. Mechanistisch gezien, antagoniseert ectopische expressie van Wnt5a in OVCAR5 canonieke Wnt/β-catenine signalering en induceert cellulaire senescentie door activering van de histon repressor A (HIRA)/promyelocytic leukemie (PML) senescentie pathway.

In tegenstelling, studies waarbij een groot aantal patiënten betrokken was, vonden dat upregulatie van Wnt5a geassocieerd was met een relatief slechte prognose. Vergeleken met de frequentie van Wnt1 expressie in ovariumkanker, werd Wnt5a frequenter gevonden in kwaadaardige epitheliale ovariumkankerpatiënten (80% van de in totaal 38) . Patiënten met eierstokkanker die hoge niveaus van zowel Wnt1 als Wnt5a tot expressie brachten hadden een significant lagere kans op lange termijn overleving dan patiënten met eierstokkanker die geen Wnt1 of Wnt5a tot expressie brachten. Bovendien is Wnt5a dominant aanwezig in ascitesvocht van vrouwen met eierstokkanker, wat suggereert dat het bijdraagt tot de micro-omgeving van de eierstoktor. Dit is consistent met de observatie dat hoge niveaus van Wnt5a geassocieerd zijn met een verhoogd risico op metastase.

Activerende mutaties in de canonieke Wnt pathway zijn zeldzaam bij ovariumkanker, met uitzondering van endometrioide ovariumkankers. De bijdrage van canonieke Wnt signalering aan de progressie van eierstokkanker blijft onbekend. Omgekeerd tonen studies over niet-canonieke Wnt/β-catenine signalisatie aan dat Wnt5a eierstokkanker EMT, migratie en metastase kan reguleren via niet-canonieke signalisatiewegen. In overeenstemming met dit idee hebben recente studies aangetoond dat expressie van ROR1, een receptor van Wnt5a, in hoge mate tot expressie komt bij hooggradige en minder gedifferentieerde ovariumkankers en geassocieerd is met een relatief korte ziektevrije overleving en overall survival in vergelijking met ovariumkankers die geen ROR1 tot expressie brengen. Ovariumkankers die hoge niveaus van ROR1 tot expressie brengen hadden genexpressie handtekeningen geassocieerd met ovarium CSCs. Bovendien correleert de expressie van ROR1 door tumorcellen blijkbaar met de expressie van ALDH1 en de capaciteit om tumor sferoïden te vormen in vitro (beide merkers van CSC). Behandeling van primaire ovariumpatiënt-afgeleide xenograft (PDX) tumorcellen, die hoge niveaus van ROR1 tot expressie brengen, met een anti-ROR1 mAb (UC-961 of cirmtuzumab), remde de vorming en migratie van sferoïden in vitro en de enting en re-entransplantatie in immuundeficiënte muizen, wat erop wijst dat ROR1 de zelf-vernieuwing van ovariumkankerstamcellen kan beïnvloeden. Verdere studies zijn nodig om te bepalen of Wnt5a verantwoordelijk is voor de invloed die ROR1 blijkbaar heeft op de biologie van stamcellen van eierstokkanker.

7. Concluderende opmerkingen

Wnt5a speelt mogelijk een belangrijke rol in embryonale stamcel- en orgaanontwikkeling. De rol van Wnt5a in kankerstamcellen is echter gevarieerd en complex. Het kan tumorprogressie onderdrukken of bevorderen. Om de moleculaire mechanismen die het veranderde celgedrag sturen op te helderen, is bijkomend onderzoek naar weefselspecifieke expressie van specifieke receptoren en coreceptoren nodig. In het bijzonder, een meer gedetailleerd begrip van de complexe cross-talk tussen Wnt5a en specifieke receptoren die tot expressie komen in embryonale stamcellen en die opnieuw tot expressie kunnen komen of gereactiveerd kunnen worden in kankerstamcellen, maar niet in normale somatische weefsels (bv, ROR1 en ROR2), kan de ontwikkeling mogelijk maken van specifieke remmers die afwijkende signalering blokkeren en daardoor de overleving van patiënten gunstig beïnvloeden.

Conflicts of Interest

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de Breast Cancer Research Foundation (NIH Grant P01-CA081534), het California Institute for Regenerative Medicine, de National Natural Science Foundation van China (NSFC, Grant nr. 2016YFC009159), en de Science and Technology Foundation van Shenzhen, China (Shenzhen Peacock Innovation Team Project, Grant nr. KQTD20140630100658078).