Inleiding

Elke microscooptechniek waarbij het gehele monster aan licht wordt blootgesteld, staat bekend als “wideefield”-beeldvorming. De tegenhanger van widefield is confocaal, waarbij gaatjes worden gebruikt om het grootste deel van het licht naar en van het preparaat te blokkeren. In dit artikel worden de widefield beeldvorming en de meest gebruikte widefield technieken in de microscopie besproken.

Widefield Microscopen

In widefield wordt het gehele preparaat verlicht door een lamplichtbron van onderaf (een rechtopstaande microscoop) of van bovenaf (een omgekeerde microscoop). Rechtopstaande microscopen worden vaak gebruikt met vaste monsters zoals cellen of weefsels die zijn behandeld en gemonteerd op microscoop dia’s, terwijl omgekeerde microscopen zijn vaak beter voor de beeldvorming van een monster ondergedompeld in vloeistof, zoals het zou meestal zinken naar de bodem en gemakkelijker te zien van onderaf met hen microscoop objectieven. Dit maakt de beeldvorming van suspensiecellen mogelijk, aangezien cellen die in de biowetenschappen worden bestudeerd, meestal ofwel adherent zijn (aan een oppervlak vastzitten) of in suspensie groeien (cellen die in een vloeistof zweven). Voorbeelden van een rechtopstaande en een omgekeerde microscoop zijn te zien in fig.1.

Widefieldmicroscopen maken gewoonlijk gebruik van een witte lichtbron (zoals een lamp) die volstaat met enkele filters voor fluorescentiewerk. Dit maakt de beeldvorming ook eenvoudiger en de grootte van de beeldbestanden kleiner, waardoor het gemakkelijker is om met widefield te werken voor toepassingen zoals celdocumentatie.

Widefield Technieken

Voorbeelden van widefieldmicroscopietechnieken zijn helderveld, differentieel interferentiecontrast (DIC), fasecontrast en widefieldfluorescentie.

Brightfieldmicroscopie is een toegankelijke vorm van microscopie, waarbij een volledig monster door een helder licht wordt belicht. Deze aanpak vergt weinig monstervoorbereiding en kan worden gebruikt om snel en gemakkelijk levende cellen te controleren of om aanvullende gegevens te produceren. Het gebruik van een contrastmiddel is echter sterk aan te bevelen, aangezien de meeste celmonsters transparant zijn en het moeilijk zal zijn ze zonder kleurstof op te lossen. Cellen bestaan voor het grootste deel uit water en wanneer ze op doorzichtig glas of plastic worden afgebeeld, kan het moeilijk zijn om kleinere structuren eruit te pikken zonder wat extra contrast.

Bij differentieel interferentiecontrast (DIC) wordt het monster belicht met licht dat in twee gepolariseerde lichtbundels wordt gesplitst; wanneer deze bundels opnieuw samenkomen, verschijnen de verschillen in faseverschuiving als contrast in het uiteindelijke beeld. Evenals fasecontrast is deze techniek niet geschikt voor dikkere preparaten en vereist zij een grotere technische opstelling dan andere technieken.

Fasecontrastmicroscopie geeft een beter contrast dan helderveld door gebruik te maken van verstrooid licht van het preparaat. Door het preparaat te verlichten met een ring van licht en door een andere ring voor de zoeker van de microscoop te plaatsen, worden delen van het preparaat die het licht anders verstrooien donkerder of lichter op het beeld weergegeven, waardoor het contrast groter is dan bij standaard helderveldmicroscopie. Dit verbeterde contrast is niet zichtbaar op dikkere preparaten omdat het artefacten veroorzaakt, maar werkt goed bij celculturen. Een voorbeeld van deze ringen is te zien in Fig.2.

Widefield fluorescentiemicroscopie is vergelijkbaar met helderveldmicroscopie, maar er worden specifieke golflengten van licht gebruikt om fluorescerende moleculen te exciteren waarmee het monster is voorbehandeld (hoewel sommige monsters van nature zelf fluorescerend zijn). Monsters kunnen worden gekleurd met fluorescente markers voor specifieke eiwitten of celcomponenten, en vervolgens vormt het fluorescentie-emissielicht van deze markers een beeld. Het fluorescentiesignaal betekent dat er een beter contrast is dan bij andere technieken, aangezien door het gebruik van specifieke golflengten van licht alleen de fluorescerende moleculen licht uitstralen, in tegenstelling tot het gehele beeld dat wordt verlicht. Aangezien echter het hele monster met dit licht wordt verlicht, kunnen de fluorescentiesignalen van buiten het kijkgebied achtergrondfluorescentie en wazige beelden veroorzaken.

Out-Of-Focus Light

Het belangrijkste nadeel is dat als het gehele monster wordt verlicht, terwijl het brandvlak licht ontvangt en een beeld kan genereren, de vlakken boven en onder het brandvlak ook licht ontvangen, wat resulteert in out-of-focus licht waardoor beelddegradatie optreedt. Vooral voor fluorescentie-excitatie wordt de resolutie van een widefield systeem beperkt doordat de achtergrondfluorescentie ook door de camera wordt opgevangen en de signaal-ruisverhouding afneemt.

Zekere breedveldtechnieken vermijden dit probleem, zoals gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM), waarbij lichtpatronen worden gebruikt om een complex patroon te genereren, beeldvorming op basis van het interferentiepatroon maakt superresolutieniveaus van detail mogelijk, waarbij objecten van slechts 200 nm worden opgelost. Meer over SIM kunt u lezen in de SIM appnote op onze website.

Samenvatting

Widefield imaging is de basis van de meeste cellulaire studies, waardoor onderzoekers snel en gemakkelijk monsters in beeld kunnen brengen met weinig voorbereiding van het monster of technische expertise die nodig is. Van helderveld tot fluorescentie beeldvorming, widefield is een krachtige en gevarieerde techniek die veel onderzoekers bekend zijn met. Hoewel de techniek kan missen in resolutie in vergelijking met confocale of andere geavanceerde microscopie toepassingen, widefield beeldvorming heeft een vaste plaats in het onderzoek en zal blijven ontwikkelen in de tijd.