8 Polymyxinen

Polymyxinen zijn een klasse van kationische cyclische decapeptiden die worden gekenmerkt door de aanwezigheid van vijf positief geladen amineresiduen, afkomstig van di-amino boterzuur (Dab), en een lipofiele staart, zoals blijkt uit de structuur van polymyxine B1 (50). Zij vertonen een krachtige activiteit tegen Gram-negatieve bacteriën en werden in de jaren vijftig voor het eerst klinisch gebruikt, maar het gebruik werd beperkt door meldingen van toxiciteit, met name nefrotoxiciteit. In het afgelopen decennium echter, met de toenemende prevalentie van multi-drug-resistente Gram-negatieve bacteriën, is er een opleving geweest in het gebruik van polymyxinen als laatste redmiddel.

Er zijn veel nadelen aan de huidige polymyxinetherapie. Het meest gangbare preparaat dat klinisch wordt gebruikt is de prodrug van polymyxine E (colistine) (51), bekend als CMS (colistine-methaansulfonaat), dat in de jaren zestig werd ontwikkeld als een minder toxische doseringsvorm. Aangezien het echter een prodrug met vijf gesulfonyleerde aminogroepen is, is de farmacokinetiek gecompliceerd en niet goed begrepen. Polymyxine B wordt gedoseerd als het sulfaatzout door middel van langzame infusie om acute toxicologische effecten te ondervangen, maar bezorgdheid over nefrotoxiciteit leidt tot suboptimale dosering. Een polymyxine van de “tweede generatie” met een verbeterde therapeutische index, en een doseringsschema ontwikkeld met moderne PK-PD methodologie zou een voordelige aanvulling zijn op het arsenaal tegen multi-resistente Gram-negatieve infecties.

Het werkingsmechanisme van polymyxines is niet volledig begrepen. Polymyxinen binden zich aan het negatief geladen lipopolysaccharide (LPS) van het buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën en verstoren dit, waardoor het polymyxine (en andere geneesmiddelen) in de periplasmatische ruimte kunnen doordringen. Hoewel de polymyxines kationische amfifiele moleculen zijn, is de binding en de herkenning aan het buitenmembraan specifiek. Schrapping van de vetzuurketen en van aminozuur 1 leidt tot polymyxine B nonapeptide (PMBN, (52)), dat weliswaar aanzienlijk minder actief is dan polymyxine B, maar nog steeds in staat is het buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën te permeabiliseren. Het enantiomeer van PMBN is echter geen permeabilisator. Een model voor de binding van polymyxine aan het sterk geconserveerde hydrofobe lipide A van LPS is ontwikkeld op basis van NMR-studies van polymyxine in complex met LPS. In dit model interageren de positief geladen amines met de fosfaten van LPS, terwijl de lipofiele staart en de lipofiele aminozuur 6-7 regio van de kern interageren met de lipidestaart van het LPS. Van bepaalde polymyxinederivaten zonder significante antibacteriële activiteit is aangetoond dat zij zich aan LPS binden en de bacteriën permeabiliseren voor de werking van andere antibiotica.

De structuur-activiteitsrelaties van de polymyxinen zijn in 2010 uitvoerig geëvalueerd en sindsdien hebben zich verdere ontwikkelingen voorgedaan in de medicinale chemie en het preklinisch onderzoek, gericht op zowel vermindering van de toxiciteit als verhoging van het activiteitsniveau, met name tegen opkomende stammen die resistent zijn tegen meerdere geneesmiddelen.

Polymyxinen vertonen nefrotoxiciteit bij niveaus die dicht bij de therapeutische dosis liggen, alsmede een aantal slecht gekarakteriseerde acute toxicologische effecten. Het mechanisme van de nefrotoxiciteit wordt momenteel onderzocht, maar aangenomen wordt dat het verband houdt met de kationische aard van het molecuul en de accumulatie in de proximale tubulaire niercellen, waarbij de opname wordt gemedieerd door de multi-ligand receptor, megalin . Cytotoxiciteit is vastgesteld in de celtypes waarin het geneesmiddel zich ophoopt, bijvoorbeeld menselijke proximale tubulaire niercellen (HK-2) of proximale tubule epitheelcellen (PTEC), en kan gepaard gaan met mitochondriale schade, of de betrokkenheid van reactieve zuurstofspecies.

In de afgelopen jaren is een aantal benaderingen ondernomen om de toxiciteit te verminderen en de therapeutische index van polymyxinen te verbeteren. Totale synthese van nieuwe polymyxinederivaten, via vaste fase peptidesynthese, is de belangrijkste route geweest, die manipulatie op elk punt in de polymyxinestructuur mogelijk maakt. Semi-synthese uitgaande van polymyxine zelf is ook uitgebreid gebruikt, waarbij gebruik wordt gemaakt van het vermogen van verschillende enzymen om de lipofiele staart en de tripeptideketen op specifieke posities selectief te splitsen. Selectieve bescherming van de eindaminogroepen van de Dab-residuen is ook bereikt, waardoor de semi-synthese van een verscheidenheid van derivaten van het nonapeptide mogelijk is geworden.

Er is gerapporteerd dat verwijdering van de lipofiele staart en aminozuur 1 om polymyxine B nonapeptide (PMBN) (52) over te houden, leidt tot een aanzienlijke vermindering van de nefrotoxiciteit en de antibacteriële activiteit, terwijl het vermogen van de molecule om bacteriën permeabiliseren voor de werking van andere antibiotica, behouden blijft. Deze vermindering van de toxiciteit is onlangs bevestigd door in vivo studies bij AstraZeneca , waarbij de histopathologie opmerkelijke veranderingen aan het licht bracht in de nieren van ratten die waren behandeld met colistine in vergelijking met die welke waren behandeld met PMBN of een voertuigcontrole.

In een reeks derivaten waarin de vetzuurketen ontbreekt, hebben Katsuma en medewerkers onderzoek gedaan naar Pseudomonas-specifieke polymyxine-analogen. Vervanging van de vetzuurketen en aminozuur 1 van het polymyxine door alle basische residuen, zoals de Dab-Dab-Dab keten (53a), resulteerde in krachtige en selectieve Pseudomonas activiteit in vitro, maar met verhoogde acute toxiciteit in de muis. Een klein hydrofiel aminozuur aan de N-terminus (di-amino propionzuur (Dap), of serine) (53b,c) resulteerde in Pseudomonas activiteit in vitro vergelijkbaar met polymyxine B zelf. Het Dap-analoog (53b) vertoonde 4,9-maal minder acute toxiciteit dan polymyxine B in de muis. Het effect op de niertoxiciteit is in deze serie niet gerapporteerd.

Een benadering van Northern Antibiotics om de toxiciteit van polymyxinederivaten te verminderen is geweest om het aantal positieve ladingen in het molecuul te verminderen. Hoewel is aangetoond dat de Dab-residuen in het cyclische gedeelte van het polymyxine van cruciaal belang zijn voor zowel de binding aan LPS als voor de daaropvolgende antibacteriële activiteit, kan binding aan LPS nog steeds plaatsvinden in analogen zonder amineresiduen in het lineaire gedeelte van het peptide. Dergelijke derivaten kunnen als permeabilisatoren voor andere antibiotica fungeren en sommige zijn als zodanig werkzaam tegen een beperkter spectrum van organismen. Voorbeelden zijn de niet-apeptiden NAB-7061 (54a) met aminobutyraat op positie 3, en NAB-739 (54b) met d-serine op positie 3. Beide behouden het vermogen van polymyxine om het buitenmembraan te permeabiliseren en werken synergetisch met andere antibiotica. Zowel NAB-7061 als NAB-739 vertoonden een lagere affiniteit (ongeveer een vijfde lager) voor het penseelgrensmembraan van de niercortex dan polymyxine, zoals aangetoond in een radiogelabelde gentamicine-verplaatsingstest. NAB-739 vertoonde een lagere cytotoxiciteit in een HK-2 cellijn met IC50 waarden die ongeveer 26 maal lager waren dan polymyxine B. NAB-739 vertoonde ook antibacteriële activiteit zowel in vitro als in vivo. Terwijl in vitro profilering een goede activiteit tegen E. coli en Klebsiella aantoonde, was de activiteit verminderd vergeleken met polymyxine tegen Pseudomonas species. NAB-739 heeft zijn werkzaamheid aangetoond in een E. coli-infectiemodel, maar tot op heden zijn er geen rapporten over in-vivotoxiciteitsstudies.

Cubist Pharmaceuticals heeft gerapporteerd over de vermindering van de toxiciteit door de vervanging van de lipofiele staart van polymyxine door een aryl-ureum in verbinding CB-182.804 (55). Tot dusver is dit het enige polymyxine van de nieuwe generatie dat in Fase I wordt getest, nadat is aangetoond dat de nefrotoxiciteit bij cynomolgische apen is verminderd.

Pfizer heeft onlangs de synthese gerapporteerd van een reeks polymyxinederivaten waarin Dab-3 van het lineaire gedeelte van de aminozuurketen is vervangen door di-amino propionzuur Dap , waarvan is gerapporteerd dat het de antibacteriële activiteit verhoogt. Een verscheidenheid van biaryl eindgroepen werd onderzocht met als conclusie dat verbindingen met meer polaire zijketens, zoals gemeten door ClogD minder cytotoxisch waren tegen de hRPTEC niercellijn, maar een algemene tendens hadden tot verminderde antibacteriële werkzaamheid. Eén bepaalde Pfizer-verbinding, 5x (56), waarbij de lipofiele staart van polymyxine werd vervangen door een polair N-fenylpyridongedeelte, vertoonde echter een aanzienlijk verminderde in vitro toxiciteit in vergelijking met polymyxine, terwijl de activiteit behouden bleef. In een 7-daags onderzoek bij de rat werd 5x in vivo onderzocht op zijn nefrotoxisch potentieel in vergelijking met polymyxine B. Bij een blootstellingsniveau waarbij polymyxine B bij elk dier necrotische nierlaesies veroorzaakte (zij het minimaal) (56) kwam geen necrotische nierlaesie voor. Bij de hond werd echter geen significante veiligheidsmarge van (56) ten opzichte van polymyxine B gerapporteerd. Inzicht in de relatie tussen in vitro toxiciteit en de in vivo situatie bij polymyxinen is nog steeds een te nemen horde.

Cantab anti-infectives heeft gerapporteerd dat polymyxine nonapeptide derivaten waarbij de acyl keten een polaire functionaliteit bevat, een verminderde toxiciteit in vitro en in vivo vertonen terwijl de in vivo werkzaamheid behouden blijft. Bijvoorbeeld, verbinding (57) werd vergeleken met polymyxine B in een E. coli infectiemodel in de dij van muizen. Een totale dosis van 10 mg/kg (i.v., b.i.d.) van (57) gaf een vermindering van de bacteriële belasting met 4 log10 vergeleken met onbehandelde controle, terwijl dezelfde dosis polymyxine de bacteriële belasting met 4,8 log10 verminderde. Vergelijkbare resultaten werden verkregen in een Klebsiella pneumoniae-infectiemodel, waar (57) een vergelijkbare vermindering van de bacteriële belasting gaf (2,3 log10 vermindering) als colistine bij 10 mg/kg. In vitro was (57) zes maal minder cytotoxisch dan polymyxine, gemeten naar IC50 tegen de HK-2 cellijn. In vivo, in een rattenmodel van nefrotoxiciteit, gaf (57) een significant lager gehalte aan biomarkers van nierschade in de urine (N-acetyl-bèta-d-glucosaminidase, albumine en cystatine C) dan colistine bij dezelfde dosis.

Een andere benadering is gevolgd door de groep aan de Monash University, die modificaties heeft onderzocht die activiteit vertonen tegen resistente stammen. Polymyxines met een verhoogde lipofiliteit bij aminozuren 6 en 7 van de kern, en een lipofiele keten, b.v. FADDI-02 (58a) en FADD1-03 (58b) vertonen een verbeterde activiteit tegen resistente stammen van Pseudomonas aeruginosa en Acinetobacter baumanii in vergelijking met polymyxine B. In vitro toxiciteit is niet gerapporteerd; de verbindingen zijn echter wel geëvalueerd in een in vivo model van nefrotoxiciteit. Histologisch onderzoek toonde geen laesies aan bij deze met FADDI-03 behandelde ratten, in vergelijking met positieve tekenen van nierschade bij de met polymyxine B behandelde dieren. Deze lagere toxiciteit werd toegeschreven aan de hoge serumbinding van de molecule, waardoor accumulatie in de nieren werd voorkomen.