Opstelling van een humaan maagslijmvlieskankermodel in immunocompetente muizen met behulp van de Microcarrier-6
Abstract
Maagdarmkanker behoort tot de meest voorkomende kwaadaardige tumoren van het spijsverteringskanaal. Het vaststellen van een robuust en betrouwbaar diermodel is de basis voor het bestuderen van de pathogenese van kanker. In deze studie werd een muismodel van maagcarcinoom vastgesteld door immunocompetente muizen te inoculeren met MKN45 cellen met behulp van microcarrier. Zestig mannelijke C57BL/6 muizen werden willekeurig verdeeld in drie groepen: een 2D-groep, een lege drager-groep, en een 3D-groep, volgens het cocultuursysteem van MKN45 en de microdrager. De muismodellen werden tot stand gebracht door hypodermische injectie. In elke groep werden de tijd tot ontwikkeling van de tumor, de mate van tumorvorming en de pathologische kenmerken waargenomen. In de 3D-groep was de tumorigenesetijd kort, terwijl het percentage tumorvorming hoog was (75%). Er was geen detecteerbare tumorvorming in zowel de 2D-of de lege drager groep. Zowel H&E en immunohistochemische kleuring van de tumor xenograft toonde karakteristieke aanwijzingen van menselijke maag neoplasma. De huidige studie vestigde met succes een menselijk maagcarcinoom model in immunocompetente muizen, die een nieuw en waardevol diermodel voor het kankeronderzoek en de ontwikkeling van antikanker geneesmiddelen biedt.
1. Met ongeveer een miljoen nieuw gediagnosticeerde gevallen per jaar, vormt maagkanker een ernstige bedreiging voor de gezondheid en het leven van mensen wereldwijd. De pathogenese en de mechanismen van metastasering van maagkanker zijn echter nog niet volledig opgehelderd. In vivo modellen van maagkanker zijn essentiële hulpmiddelen voor de exploratie van de biologische karakteristieken van deze kanker en mogelijke nieuwe behandelingsopties. Van mensen afgeleide maagslijmvlieskankermodellen zijn tot stand gebracht in immunodeficiënte muizen, zoals naaktmuizen en muizen met ernstige gecombineerde immunodeficiëntie. Immunodeficiënte muizen zijn echter niet gemakkelijk te kweken en zijn duur. Belangrijk is dat immunodeficiënte muizen niet de belangrijke rol van het immuunsysteem bij de ontwikkeling en progressie van tumoren weerspiegelen. De oprichting van een nieuw humaan maagkanker xenograft model in muizen met een normaal immuunsysteem is dus van groot belang. In de huidige studie werden MKN45, menselijke maagkankercellen en de microdrager gecocultureerd, en immunocompetente muizen werden vervolgens geïnoculeerd met de suspensie, waarbij met succes een nieuwe menselijke maagkankerxenograft werd vastgesteld.
2. Materialen en Methoden
2.1. Materials
Roswell Park Memorial Institute- (RPMI-) 1640 kweekmedium, trypsine, foetaal runderserum, en penicilline werden gekocht bij Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Konijn anti-humaan carbohydraat antigeen 199 (CA199), cytokeratine 7 (CK-7), en caudale type homeobox 2 (CDX-2) monoklonale antilichamen werden gekocht bij Abcam (Cambridge, UK). De microcarrier-6 werd gekocht van Elyon Biotechnologies LLC (Gaithersburg, MD, USA).
2.2. Experimentele dieren
Zestig 6-8 weken oude mannelijke C57BL/6 muizen met een gewicht van 22-25 g werden gekocht van Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co, Ltd. (licentienummer: SCXK 20140007, provincie Shandong, China) en ondergebracht in een specifiek pathogeenvrij dierencentrum in het Affiliated Hospital van Jining Medical College (provincie Shandong, China). Alle dierproeven werden uitgevoerd met goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee van het Affiliated Hospital van Jining Medical University en uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen.
2.3. Cellijnen
De MKN45 menselijke maagkanker cellijn werd gekocht van Cell Bank of the Chinese Academy of Science (Shanghai, China) en gekweekt in RPMI-1640 medium met 10% foetaal runderserum en 100 U/mL penicilline bij 37°C met 5% CO2. Het kweekmedium werd elke 24 uur veranderd, en de cellen geoogst door ontsluiting met 0,25% trypsine.
2.4. De microcarrier-6 werd gedurende 24 uur in 75% ethanol gedrenkt, driemaal gewassen met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing en gedurende 24 uur geïncubeerd in RPMI-1640 medium. Vervolgens werd de microcarrier-6 gemodificeerd via een 3 uur durende incubatie met stromale celafgeleide factor-1-alfa (SDF-1α) en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), beide in een concentratie van 100 ng/ml. Cellen in de logaritmische groeifase werden geteld na trypanblauwkleuring en bijgesteld tot een concentratie waarbij de levensvatbaarheid >95% was. De MKN45-celsuspensie werd gemengd met de gemodificeerde microcarrier-6 en gedurende nog eens 24 uur bij 37°C met 5% CO2 geïncubeerd om de cellen met de microcarrier te verzadigen, zoals microscopisch is waargenomen (figuren 1(c) en 1(d)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Figuur 1
3D cocultuursysteem van MKN45 cellen onder de microscoop en de elektronenmicroscoop. (a) In de 2D kweekomgeving vertoonden de MKN45 cellen een onregelmatige veelhoekige vorm. (b) De microcarrier-6 type C; onregelmatige “doolhof”-achtige structuur. (c) Na een cocultuur van 24 uur hechtten de MKN45-cellen zich goed aan de microcarrier-6, zoals microscopisch is waargenomen. Onregelmatige celclusters werden waargenomen rond de MKN45 cellen hechtten zich aan de microcarrier-6. (d) Na een 24 uur cocultuur, DAPI kleuring toonde een groot aantal MKN45 cellen hechtten aan de microcarrier-6 steiger. (e) Meerlaagse poreuze structuur van microcarriers kan worden waargenomen onder de scanning elektronenmicroscoop. (f) MKN45 cellen hechtten zich aan de microcarriers, en de cellen vastgeklonken aan het oppervlak gevormd cel clusters.
2.5. Animal Grouping
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
De 60 C57BL/6 muizen werden willekeurig verdeeld in drie groepen (20 muizen per groep): de twee-dimensionale (2D) groep (dieren geïnoculeerd met containing ), de lege drager groep (dieren geïnoculeerd met containing 30 ug microcarrier-6), en de 3D-groep (dieren geïnoculeerd met containing en 30 ug microcarrier-6).
2.6. Animal Model Generation
De 3D tumor celcultuur model werd opgericht op de eerste dag van het experiment en geïncubeerd gedurende 24 h. Op de tweede dag, de gekweekte cel-microcarrier complexen werden drie keer gewassen in en voorzichtig gemengd met de concentratie aan te passen aan cellen en 300 ug microcarrier-6 per 1 mL suspensie, en geplaatst op ijs voor later gebruik. MKN45 cellen in de logaritmische groeifase werden geoogst, getrypsiniseerd, driemaal gewassen met , en opnieuw gesuspendeerd in een concentratie van , die werd geplaatst op ijs voor later gebruik. De gemodificeerde microcarrier-6 werd driemaal gewassen met , geresuspendeerd in een concentratie van 300 ug / ml, en geplaatst op ijs voor later gebruik. Elke muis in alle drie experimentele groepen werd geïnoculeerd met 100 ul van de overeenkomstige oplossing onder de rechter okselkam.
2.7. Indicator Detectie en Pathologisch Onderzoek
Na inoculatie, werden de muizen apart gehuisvest per groep, en de dagelijkse eetlust, activiteiten, en het gewicht werden gecontroleerd. De tijd voor lokale tumorvorming en tumor volume in elke muis werd geregistreerd. Zodra tumoren zichtbaar waren, werden de lange diameter (a) en korte diameter (b) van elke tumor dagelijks gemeten, en het tumorvolume werd berekend volgens de formule voor tumorvolume : . Tumordragende muizen werden opgeofferd in drie batches: 10, 20, en 30 dagen na de inenting. Tumorweefsel werd volledig verwijderd van elke muis, en de kwaliteit van de tumor, de textuur, en de mate van infiltratie en necrose werden geregistreerd. Tumorweefsels werden vervolgens gefixeerd in 4% neutraal gebufferde formaldehyde en gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E). Voor de immunohistochemie werd gebruik gemaakt van de EnVision tweestapskleuringstechniek. De kleuringsresultaten werden bepaald op basis van de positieve korrelige cytoplasmatische kleuring van de tumor. Negatieve (-ve) kleuring werd gedefinieerd als <5% positief gevlekte cellen, en positieve (+ve) kleuring werd gedefinieerd als ≥5% positief gevlekte cellen.
2.8. Statistische analyse
De SPSS 13.0 software (IBM SPSS, Chicago, IL, USA) werd gebruikt voor statistische analyse. Meetgegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). De verschillen tussen de gemiddelde waarden van elke groep werden vergeleken met behulp van one-way variantieanalyse (ANOVA) of de Kruskal-Wallis-toets, al naar gelang het geval. wordt beschouwd als een statistisch significant verschil.
3. Resultaten
3.1. Oprichting van de In Vitro MKN45 3D Tumor Cultuur Systeem met behulp van de Microcarrier-6
De microcarrier-6 is een nieuwe microcarrier samengesteld uit positief elektriseerbare organische polymeren met een meerlagige poreuze structuur. De poriegrootte, de positieve oppervlakteladingsdichtheid en de grootte van de microcarrier-6 kunnen door chemische synthese worden aangepast. Type C microcarrier-6, klein volume, grote poriegrootte, en vele malen van de ruimte vouwen, wordt voornamelijk gebruikt voor 3D-celkweek en drug gevoeligheid experimenten (figuren 2 (a) en 2 (b)). Type M microcarrier-6, groot volume, kleine poriegrootte, en lage interne vouwen tijden, wordt voornamelijk gebruikt voor weefsel engineering onderzoek (Figuren 2 (c) en 2 (d)). Type C microcarrier-6 werd gebruikt in onze studie. De microcarrier-6 is een zuivere organische verbinding die niet gevoelig is voor verontreiniging, heeft geen onzuiverheden, is laag in immunogeniciteit en metabolisme, en is zeer biocompatibel, waardoor een stabiele micro-omgeving voor celgroei (figuren 2 (a) -2 (d)). Bovendien is de microcarrier-6 direct ingebed in de huid van muizen, waardoor bloedvaten ingroeien (figuren 2(e) en 2(f)), wat voldoende bloedtoevoer voor tumorcelgroei kan opleveren. MKN45 cellen hechtten zich snel in de 2D-omgeving, en de celmorfologie waargenomen door microscopie na 24 uur van de cultuur vertoonde een onregelmatige veelhoek vorm (figuur 1 (a)). De microcarrier-6 vertoonde een onregelmatige of lange spilvorm en een losse textuur (figuur 1 (b)). Na een cocultuur van 24 uur van MKN45 en de gemodificeerde microcarrier-6 hechtten de MKN45-cellen zich goed aan de microcarrier en bereikten confluentie. Bovendien werden onregelmatige celclusters waargenomen rond de MKN45-cellen die zich hadden gehecht aan de microcarrier-6 (figuur 1 (c)). De MKN45 cel-microcarrier complexen werden gekleurd met 4,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) oplossing, waaruit bleek een groot aantal MKN45 cellen vastgeklonken aan de microcarrier-6 steiger (figuur 1 (d)). Meerlagige poreuze structuur van microcarriers kan worden waargenomen onder scanning elektronenmicroscoop (figuur 1 (e)). MKN45 cellen hechtten zich aan de microcarriers, en de cellen vastgeklonken aan het oppervlak gevormd cel clusters (figuur 1 (f)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2. Muis Overleving en Tumorvorming
Er werd geen significante verandering in eetlust, vacht, of lichaamsgewicht waargenomen tussen de groepen tijdens het experiment (tabel 1). Muizen in de 3D-groep vertoonden een lichte afname in activiteit één week na de inoculatie. Geen enkel dier in een groep stierf, en er werd geen tumorvorming gevonden in de lege drager of 2D groepen gedurende het 30-dagen experiment. Onderhuidse massa’s in 15 van de 20 muizen in de 3D-groep werden geïdentificeerd via palpatie 7-10 dagen na inoculatie, wat suggereert een tumorvorming percentage van 75% (tabel 1). Tumor xenografts groeide snel en werden waargenomen als onderhuidse massa’s ongeveer 10 dagen na inoculatie (figuur 3 (a), supplementaire figuur 3). Tumor xenografts groeide tot 0,5-1,0 cm3 in grootte van 2 tot 3 weken postinoculatie. De tumor xenograft weefsels werden gemakkelijk gescheiden van de aangrenzende weefsels en gepresenteerd als relatief regelmatige vormen, meestal ronde of ovale, grijsachtig wit of grijsachtig rood van kleur, en met een overvloedige perifere bloedtoevoer (Figuur 3 (b) en 3 (c) en Supplementary Figure 3). Er waren histologische veranderingen van de injectieplaats in de lege drager groep, maar geen veranderingen in de 2D-groep (figuren 3 (d) en 3 (e)). Kleine onderhuidse massa’s werden waargenomen met een gele kleur in de lege drager groep (figuur 3 (d)).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Gegevens worden weergegeven als de .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3. H&E Staining
Histomorfologie, zoals gezien door lichtmicroscopie, toonde een groot aantal ongeordende en atypische cellen in de tumor xenografts van muizen in de 3D groep (Figuren 4(a)-4(c)). Een groot aantal heterotypische cellen, resterende microcarriers, en overvloedige bloedvaten werden waargenomen, 10 dagen na de inoculatie (figuur 4 (a)). Een klein aantal resterende microdragers (figuur 4 (b)) en een groot aantal necrotische laesies (figuur 4 (d)) werden waargenomen, 20 dagen na de inoculatie. De microdragers werden echter 30 dagen na de inoculatie grotendeels geëlimineerd (figuur 4(c)). Een groot aantal microcarriers en een klein aantal ontstekingscellen werden waargenomen in de lege drager groep, maar geen tumorcellen werden gevonden (figuur 4 (e)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.4. Immunohistochemie
Immunohistochemie werd uitgevoerd bij dieren die 20 dagen na de tumorxenograft werden geëuthanaseerd. De tumor xenograft weefsels vertoonden positieve CA199, CK-7, en CDX-2 kleuring (Figuren 4(f)-4(h)), verder bevestigend dat de atypische cellen van de mens afgeleide tumorcellen waren.
4. Discussie
Diermodellen zijn uitgebreid gebruikt om de pathogenese en metastatische mechanismen van maagkanker te bestuderen en spelen een uiterst belangrijke rol bij de evaluatie van de werkzaamheid en toxiciteit van therapeutische geneesmiddelen. Op dit moment omvatten de diermodellen voor maagkanker voornamelijk het volgende: het inductiemodel, het transplantatiemodel en het genetische manipulatiemodel. Van de drie soorten modellen is het transplantatiemodel gemakkelijk te bedienen en wordt het dus veel gebruikt. Het type proefdieren, tumor xenograften, en de plaats en route van transplantatie zijn beschouwd als factoren die het succes van xenograft modellen beïnvloeden . Muizen met gebreken in de immuunfunctie, zoals naaktmuizen en muizen met ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID), worden vaak gebruikt voor xenograftermodellen. Echter, vanwege de relatief dure kosten, korte levensduur, en het gebrek aan immuunrespons op tumoren in immunodeficiëntie muizen, selecteerden wij immunocompetente C57BL/6 muizen voor het xenograft model om de tekortkomingen van immunodeficiëntie muizen te vermijden. Algemeen wordt aangenomen dat het optreden van maagkanker niet gerelateerd is aan het niveau van oestrogeen, en dat de incidentie van maagkanker bij mannetjes hoger is dan bij vrouwtjes. Daarom hebben wij mannelijke muizen als model gebruikt. Bovendien werd in deze studie gebruik gemaakt van MKN45 menselijke maagkankercellen om het in vitro model op te stellen, voornamelijk vanwege de sterke invasieve en metastatische kenmerken van de cellijn. Bovendien werden de onderarm subcutane regio en ectopische transplantatie geselecteerd als de plaats en route van tumorceltransplantatie, respectievelijk als gevolg van de overvloedige bloedtoevoer en losse weefselstructuur van dit gebied, die tumorgroei bij muizen vergemakkelijkt.
Als een brug tussen het 2D celkweeksysteem en het diermodel, simuleert 3D celkweeksysteem beter de micro-omgeving van tumorcelgroei en is een aantrekkelijk onderwerp geworden in het huidige onderzoek. 3D kweek van kankercellen zal vormen tumor organoids, en muis tumor xenograft modellen op basis van tumor organoids zijn begonnen te worden toegepast op de screening van antikanker geneesmiddelen . De huidige studie gebruikte de nieuwe microcarrier-6 en MKN45 cellen voor de cocultuur experimenten om met succes een 3D groeimodel vast te stellen. We direct ingebed de microcarrier-6 in de onderhuidse weefsel van muizen om bloedvaten toe te staan de microcarriers, die een specifiek voordeel dat niet wordt bereikt met andere microcarriers. Studies hebben gemeld milde immunosuppressie van immunocompetente muizen om resistentie tegen menselijke tumorcellen te bereiken, met succes tot vaststelling van een tumor-dragende muis model, maar tot op heden zijn er geen meldingen van succesvolle ectopische transplantatie van een menselijke tumor in normale muizen onder niet-immunosuppressieve omstandigheden. Bovendien, toen we de concentratie van MKN45 cellen aangepast aan en onmiddellijk geïnjecteerd 100 pi MKN45 celsuspensie subcutaan aan elke muis, stabiele tumorvorming werd niet bereikt als gevolg van de sterke immuun klaring van de ectopisch getransplanteerde menselijke tumorcellen. De microcarrier-6 gebruikt in de huidige studie vertoonde een lage immunogeniciteit en een losse textuur met talrijke poriën in het centrum, het vergemakkelijken van tumorcelgroei. De microcarrier-6 fungeerde ook als een barrière om de immuuncellen te blokkeren van het direct doden van de tumorcellen. De gemodificeerde microcarrier-6 maakte het mogelijk dat bloedvaten gemakkelijk binnen de tumor konden groeien, waardoor geschikte omstandigheden ontstonden voor de snelle groei van tumorcellen.
Cellulaire immuniteit is het belangrijkste leger tegen tumorgroei; de betrokken cellen omvatten hoofdzakelijk T-cellen, natuurlijke killercellen, macrofagen en dendritische cellen. Door de onregelmatige “doolhof”-achtige structuur van de microcarrier-6, kan deze fungeren als een kortetermijnbarrière en het directe doden van tumorcellen door immuuncellen tot op zekere hoogte blokkeren. Bovendien werd drie uur voor het experiment de microcarrier-6 verder gemodificeerd met SDF-1α en VEGF om de vorming van bloedvaten te versnellen en een bloedtoevoer te voorzien voor een snelle tumorgroei, die het antitumor immuuneffect van de muizen oversteeg. Tegelijkertijd vonden we dat macrofagen in het perifere bloed en de miltweefsels van de muizen aanzienlijk waren afgenomen tijdens het vroege stadium van getransplanteerde tumorvorming, in vergelijking met de normale controlegroep (Supplementary Figure 1). Het aantal beenmerg macrofagen geleidelijk afgenomen tussen de lege drager groep, de 2D-groep, en de 3D-groep, maar er was geen statistische significantie (Supplementary Figuur 2A, 2B). Vergeleken met de lege drager groep, was het aantal milt T lymfocyten in de 2D-groep verminderd, maar er was geen statistische significantie (Supplementary Figuur 2C). Het aantal milt T-lymfocyten in de 3D-groep was significant lager dan die in de 2D-groep (Supplementary Figure 2C). Dit suggereert dat de groei van de tumor het immuunsysteem remde, waardoor de tumor snel kon groeien.
In de huidige studie werd een MKN45-cel 3D-groeimodel vastgesteld, waarbij met succes een humaan maagkanker xenograftmodel werd vastgesteld in immunocompetente muizen in de 3D-groep, terwijl de muizen in de 2D- en lege dragergroepen geen tumoren vormden. Dit xenotransplantatiemodel werd gekenmerkt door de snelle groei van tumoren, die 7-10 dagen na inoculatie met de hand konden worden gepalpeerd en 10-15 dagen na inoculatie een optimale groei bereikten; het tumorvolume bedroeg 0,5-1,0 cm3 ongeveer 20 dagen na inoculatie. Een groot aantal cellen met nucleaire atypie die geïnfiltreerd waren in spier- en vetweefsel werden gedetecteerd door H&E kleuring. Resterende microcarrier-6 was omgeven door ontstekingscellen en vormde granulomen met een groot gebied van necrose in het centrum, die waarschijnlijk werd veroorzaakt door een onvoldoende bloedtoevoer als gevolg van snelle tumorgroei. Deze verschijnselen komen overeen met de ontwikkeling van tumoren bij de mens. Bovendien bevonden de overvloedige haarvaten zich voornamelijk in de periferie van de tumoren. Momenteel is er geen specifieke tumormarker voor maagkanker; CA199, CK-7, en CDX-2 worden echter algemeen gebruikt als markers van gastro-intestinale tumoren. Daarom kozen wij deze drie merkers voor de etikettering en identificatie van menselijke afgeleide maagkankercellen. Immunohistochemische kleuring van CA199, CK-7, en CDX-2 was positief, verder bevestigend dat heteromorfe cellen menselijke maagkankercellen waren.
5. Conclusies
We hebben met succes een humaan maagkanker xenograft model in immunocompetente muizen vastgesteld. Dit model kan de interactie tussen het immuunsysteem van het lichaam en tumoren weerspiegelen en heeft brede toepassingsvooruitzichten in het toekomstige onderzoek naar tumorimmuniteit evenals nieuw geneesmiddelenonderzoek en -ontwikkeling.
Data Availability
De gegevens die zijn gebruikt om de bevindingen van deze studie te ondersteunen, zijn op verzoek beschikbaar bij de corresponderende auteur.
Conflicts of Interest
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Authors’ Contributions
Yanzhen Bi, Quanyi Wang, en Yonghong Yang hebben gelijkelijk bijgedragen aan dit werk.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81170395 en 81570556), de Natural Science Foundation van de provincie Jilin (20180101137JC en 20180101130JC), en Research Fund for Lin He’s Academician Workstation of New Medicine and Clinical Translation in Jining Medical University (JYHL2019FMS21).
Aanvullende materialen
De veranderingen van ontstekingscellen en andere tumorigene gegevens. Supplementary Figure 1: de veranderingen van ontstekingscellen in tumordragende muizen tijdens het vroege stadium van getransplanteerde tumorvorming. Supplementaire figuur 2: de veranderingen van ontstekingscellen in verschillende groepen tijdens de vroege fase van getransplanteerde tumorvorming. Aanvullende figuur 3: tumor-dragende muizen en getransplanteerde tumor weefsels. (Aanvullende materialen)