TEXT

Het XRCC1-gen codeert voor een moleculair scaffold-eiwit dat multiproteïnecomplexen assembleert die betrokken zijn bij DNA single-strand break repair (samenvatting door Hoch et al., 2017).

Klonen en expressie

Menselijke cellen gefuseerd met Chinese hamster ovary (CHO) mutantlijnen, defect op verschillende genen voor excisieherstel van DNA na ultraviolette (UV) bestraling of defect in herstel na X-straling, produceren hybriden die het menselijke gen behouden dat het defect in de CHO-lijn aanvult wanneer geselecteerd onder omstandigheden die herstel vereisen. Om transgene muizen te produceren die een mutatie in de Xrcc1-locus dragen, kloneerden Brookman e.a. (1994) de muizenhomoloog van XRCC1 uit zowel cosmide genomische als cDNA-bibliotheken. cDNA-analyse gaf een open leesraam van 1.893 bp aan dat codeert voor een eiwit van slechts 631 aminozuren, vergeleken met het 633 aminozuren tellende polypeptide van menselijk XRCC1. Lamerdin et al. (1995) ontdekten dat de menselijke en muizen-eiwitten 86% sequentie-identiteit delen.

Whitehouse et al. (2001) meldden dat XRCC1 interageert met menselijk polynucleotide kinase (PNK; 605610) naast de interacties met DNA polymerase-beta (POLB; 174760) en DNA ligase III (LIG3; 600940). Bovendien zijn deze 4 eiwitten geassocieerd in multiproteïnecomplexen in menselijke celextracten, en samen repareren zij enkelstrengsbreuken die typisch zijn voor breuken die worden geïnduceerd door reactieve zuurstofsoorten en ioniserende straling. Opvallend is dat XRCC1 de DNA kinase en DNA fosfatase activiteiten van PNK op beschadigde DNA termini stimuleert, waardoor de totale herstelreactie wordt versneld. Deze gegevens identificeerden een nieuwe route voor single-strand break repair bij zoogdieren en toonden een gecoördineerde rol aan voor XRCC1 en PNK in de eerste stap van het verwerken van beschadigde DNA-einden. In vitro toonden Sano et al. (2004) aan dat de lange vorm van aprataxine (APTX; 606350), maar niet de korte vorm, interageert met het C-terminale domein van XRCC1, wat suggereert dat aprataxine betrokken kan zijn bij het reparatiecomplex.

Bhattacharyya en Banerjee (2001) vonden dat XRCC1 interageert met een afgeknotte POLB die tot expressie komt in primaire colorectale en borsttumoren en de normale reparatiefunctie van wildtype POLB remt. Zij stelden vast dat de interactie van de POLB-variant en XRCC1 vereist is voor het dominante remmende effect.

Loizou et al. (2004) toonden aan dat caseïne kinase II (CK2; zie 115440) XRCC1 fosforyleert en daardoor de assemblage en activiteit van DNA single-strand break repair eiwitcomplexen in vitro en op plaatsen van chromosoombreuk mogelijk maakt. Remming van de fosforylering van XRCC1 door mutatie van de CK2-fosforyleringsplaatsen of door verhindering van de activiteit van CK2 met behulp van een zeer specifieke remmer verhinderde het snelle herstel van cellulaire DNA-enkelstrengbreuken door XRCC1. Deze gegevens identificeerden een directe rol voor CK2 in het herstel van chromosoom DNA-strengbreuken en in het behoud van genetische integriteit.

Luo et al. (2004) leverden biochemische gegevens om aan te tonen dat er 2 voorgevormde XRCC1 eiwitcomplexen bestaan in fietsende HeLa cellen. Het ene complex bevat bekende enzymen die belangrijk zijn voor het herstel van enkelstrengsbreuken, waaronder LIG3, PNK, en POLB; het andere is een nieuw complex dat LIG3 en aprataxine bevat. Luo et al. (2004) meldden de karakterisering van het nieuwe XRCC1-complex. XRCC1 wordt in vivo en in vitro gefosforyleerd door CK2, en CK2 fosforylering van XRCC1 op ser518, thr519, en thr523 bepaalt grotendeels de binding van aprataxine aan XRCC1 via zijn FHA domein. Een acuut verlies van aprataxine door kleine interfererende RNA maakt HeLa-cellen gevoelig voor behandeling met methylmethansulfonaat door een mechanisme van verkorte halfwaardetijd van XRCC1. Luo et al. (2004) concludeerden dat aprataxine een rol speelt bij het handhaven van het steady-state eiwitniveau van XRCC1. Luo et al. (2004) concludeerden dat hun gegevens gezamenlijk inzicht verschaffen in de moleculaire machinerie van het herstel van enkelstrengsbreuken in de cel en wijzen op de betrokkenheid van aprataxine bij dit proces, waardoor het herstel van enkelstrengsbreuken in verband wordt gebracht met de neurologische ziekte ataxie-oculomotorische apraxie (208920).

Met behulp van primaire menselijke fibroblasten toonden Moser et al. (2007) aan dat XRCC1 en LIG3 essentiële kerncomponenten zijn van nucleotide-excisie reparatie (NER). Downregulatie van LIG3 verstoorde de verwijdering van UV-geïnduceerde laesies en de rejoining van UV-geïnduceerde nicks in chromosomaal DNA. Bovendien hadden XRCC1-LIG3 en polymerase-delta (zie POLD1; 174761) interactie en colokalisatie met NER componenten op een UV-specifieke manier gedurende de interfase. Daarentegen werd de rekrutering van LIG1 (126391) en polymerase-epsilon (POLE; 174762) op UV-bestraalde plaatsen alleen waargenomen in prolifererende cellen. Moser et al. (2007) concludeerden dat DNA-ligases en -polymerases verschillend worden gerekruteerd voor NER-gemedieerd DNA-herstel gedurende de celcyclus.

Gao et al. (2011) meldden dat DNA-ligase III essentieel is voor mitochondriale DNA-integriteit maar overbodig voor nucleair DNA-herstel. Inactivering van ligase III in het zenuwstelsel van de muis resulteerde in mtDNA verlies wat leidde tot diepgaande mitochondriale disfunctie, verstoring van cellulaire homeostase, en invaliderende ataxie. Op dezelfde manier resulteerde inactivering van ligase III in de hartspier in mitochondriale disfunctie en defecte hartpompfunctie wat leidde tot hartfalen. Ligase III inactivatie resulteerde echter niet in een tekort aan nucleair DNA-herstel, wat aangeeft dat essentiële DNA-herstelfuncties van Xrcc1 kunnen plaatsvinden in afwezigheid van ligase III. In plaats daarvan vonden Gao et al. (2011) dat ligase I kritisch was voor DNA reparatie, maar op een coöperatieve manier met ligase III te werk ging. Bovendien recapituleerde ligase III deficiëntie niet de karakteristieken van neurale Xrcc1 inactivatie zoals DNA schade-geïnduceerd verlies van cerebellaire interneuronen, wat verder de functionele scheiding van deze DNA reparatie factoren onderstreept. Daarom concludeerden Gao et al. (2011) dat de biologische rol van ligase III het handhaven van mtDNA-integriteit is en niet XRCC1-afhankelijk DNA-herstel.

Simsek et al. (2011) toonden een cruciale rol aan voor DNA ligase III in mitochondria maar niet in XRCC1-afhankelijk herstel. Simsek et al. (2011) gebruikten preëmptieve complementatie om de levensvatbaarheidseis voor Lig3 in zoogdiercellen en zijn vereiste in DNA-herstel te bepalen. Verschillende vormen van Lig3 werden stabiel ingebracht in embryonale stamcellen van de muis die een voorwaardelijk allel van Lig3 bevatten dat kon worden verwijderd met Cre recombinase. Met deze aanpak vonden Gao et al. (2011) dat het mitochondriale, maar niet het nucleaire, Lig3 vereist is voor de cellulaire levensvatbaarheid. Hoewel de katalytische functie van Lig3 vereist is, zijn de zinkvinger en BRAC1 C-terminaal-gerelateerde domeinen van Lig3 dat niet. Opmerkelijk genoeg kan de levensvatbaarheidseis voor Lig3 omzeild worden door Lig1 te richten op de mitochondria of door expressie van Chlorella virus DNA ligase, het minimale eukaryale nick-sealing enzym, of Escherichia coli LigA, een NAD(+)-afhankelijk ligase. Lig3-nul cellen waren niet gevoelig voor verschillende DNA-beschadigende middelen die Xrcc1-deficiënte cellen wel gevoelig maken. Simsek et al. (2011) concludeerden dat hun resultaten een rol vaststelden voor Lig3 in mitochondria, maar onderscheidden het van zijn interagerende eiwit XRCC1.

Genstructuur

Lamerdin et al. (1995) karakteriseerden de genomische structuur van XRCC1 in mens en muis. Het menselijke gen heeft 17 exonen en beslaat ongeveer 31,9 kb.

Het eerste x-ray repair complementing gen (XRCC1) werd in kaart gebracht op 19qcen-19q13.3 op basis van het verlies van 19p markers, het behoud van proximale 19q markers, en het verlies van meer distale 19q markers (Siciliano et al., 1987). Door zuidelijke analyse van DNA’s van een hybride panel met probes voor de 3 DNA-herstelgenen op chromosoom 19, concludeerden Thompson et al. (1989) dat ERCC2 (126340) distaal van XRCC1 ligt en in dezelfde regio, namelijk 19q13.2-q13.3, als ERCC1 (126380), maar op verschillende MluI macrorestrictiefragmenten. Vergelijkbare experimenten met een hybride kloonpanel met segregerende Chinese hamsterchromosomen toonden aan dat de hamsterhomologen van de 3 reparatiegenen deel uitmaken van een sterk geconserveerde linkage groep op Chinees hamsterchromosoom 9. De hemizygositeit van hamsterchromosoom 9 in CHO-cellen kan een verklaring zijn voor de hoge frequentie waarmee genetisch recessieve mutaties in deze 3 genen in CHO-cellen worden teruggevonden. Door fluorescentie in situ hybridisatie hebben Trask et al. (1993) het XRCC1 gen toegewezen aan 19q13.2.

Met behulp van metafase in situ hybridisatie hebben Brookman et al. (1994) het Xrcc1 gen van de muis in kaart gebracht in de A3-B2 regio van chromosoom 7.

Molecular Genetics

In een 47-jarige vrouw van Oost-Indiase afkomst met autosomaal recessieve spinocerebellaire ataxie-26 (SCAR26; 617633), identificeerden Hoch et al. (2017) samengestelde heterozygote mutaties in het XRCC1-gen (194360.0001 en 194360.0002). De mutaties, die werden gevonden door exoomsequencing en werden bevestigd door Sanger-sequencing, bleken te resulteren in significant verlaagde eiwitniveaus, consistent met een verlies van functie. Patiëntcellen en XRCC1-nul-cellen vertoonden verhoogde niveaus van eiwit-ADPribosylering als gevolg van verhoogde PARP1 (173870) activiteit. Deze cellulaire veranderingen waren vergelijkbaar met die waargenomen bij patiënten met mutaties in de XRCC1 partner PNKP (605610) die ataxie-oculomotorische apraxie-4 (AOA4; 616267) hebben, welke overlappende kenmerken heeft. De bevindingen identificeerden verhoogde ADP-ribose niveaus als een biomarker van PARP1 hyperactiviteit en als een oorzaak van cerebellaire ataxie geïnduceerd door ongerepareerde enkelstrengs DNA breuken als gevolg van verlies van XRCC1. Studies in muizen met hersenspecifieke Xrcc1-deletie (zie DIERMODEL) toonden aan dat deletie van Parp1 de abnormaal verhoogde ADP-ribose niveaus verminderde, de neuronale dichtheid in het cerebellum verhoogde, en de motorische prestaties verbeterde, zelfs zonder een effect op het herstel van enkelstrengsbreuken. Hoch et al. (2017) suggereerden dat PARP1 een geneesmiddeldoelwit kan zijn voor de behandeling van cerebellaire ataxieën geassocieerd met niet-gerepareerde enkelstrengs DNA-breuk.

Diermodel

Hoch et al. (2017) merkten op dat germline deletie van Xrcc1 in muizen embryonaal dodelijk is. Muizen met voorwaardelijke deletie van het Xrcc1-gen in de hersenen vertoonden cerebellaire ataxie met verhoogde apoptose van cerebellaire granule neuronen, verminderde aantallen cerebellaire interneuronen, en verminderde elektrofysiologische spike-activiteit in Purkinje-cellen. Deze veranderingen werden geassocieerd met verhoogde niveaus van cerebellaire ADP-ribose en hyperactivatie van Parp1. Schrapping van Parp1 verminderde het verhoogde niveau van ADP-ribose, verhoogde de neuronale dichtheid in het cerebellum, en verbeterde de motorische prestaties, zelfs zonder effect op het herstel van enkelstrengsbreuken. De gegevens toonden aan dat in de afwezigheid van Xrcc1-afhankelijke reparatie van enkelstrengsbreuken, Parp1 hyperactief is, wat resulteert in het verlies en/of disfunctie van cerebellaire neuronen.