Abstract

Serummonsters van 474 wilde vogels, 378 paarden, en 42 mensen met meningitis en lymfocytaire meningitis werden verzameld tussen 2010 en 2014 uit verschillende gebieden van Polen. West Nijl virus (WNV) antilichamen werden gedetecteerd met behulp van competitie enzyme linked immunosorbent assays: ELISA-1 ID Screen West Nile Competition, IDvet, ELISA-2 ID Screen West Nile IgM Capture, en ELISA-3 Ingezim West Nile Compac. De antilichamen werden aangetroffen in 63 (13,29%) van de 474 serummonsters van wilde vogels en in één (0,26%) van de 378 serummonsters van paarden. Veertien (33,33%) van de 42 sera van patiënten waren positief tegen WNV-antigeen en één serum was twijfelachtig. Positieve monsters verkregen bij vogels werden vervolgens opnieuw getest met een virus-microneutralisatietest om de positieve resultaten en de kruisreacties met andere antigenen van het Japanse encefalitiscomplex te bevestigen. Wij vermoeden dat positieve serologische resultaten bij mensen, vogels en paarden erop wijzen dat WNV op een of andere manier nauw verwant kan zijn met het ecosysteem in Polen.

1. Inleiding

West Nijl virus (WNV) kan een breed scala van vogelsoorten, paarden en mensen treffen. Het virus is een opkomend agens dat wereldwijd verantwoordelijk is voor ziekten bij deze dieren en mensen. De belangrijkste vectoren van WNV zijn verschillende soorten bloedzuigende insecten, die het virus kunnen overbrengen op vogels, paarden en mensen.

De infecties worden gekenmerkt door een hoge mate van pyrexie, verlamming en morbiditeit, veroorzaakt door de factoren die tot nu toe alleen als pathogeen voor de dieren werden erkend. Vaker worden de infecties gekenmerkt door milde klinische verschijnselen .

WNV staat op de lijst van de Wereldorganisatie voor diergezondheid (OIE) als de neurotropische factor die de ziekte veroorzaakt, waarvoor een meldingsplicht geldt. West Nile Fever (WNF), veroorzaakt door het virus, is een zoönose, die het grootste probleem voor de volksgezondheid in de VS vormt.

WNV is een arbovirus dat behoort tot de familie Flaviviridae, geslacht Flavivirus opgenomen in Japanse encefalitis antigenic complex geïnduceerd door verwante antigenic Japanse encefalitis virus (JEV), St. Louis encefalitis virus (SLEV), Murray Valley encefalitis virus (MVEV), en Usutu virus (USUV). Het ssRNA+ genoom van het virus bevat een enkel open leesraam van 11.000 tot 12.000 nucleotiden. Het genoom van het virus bestaat uit zeven niet-structurele eiwitten, NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, en NS5, en drie structurele eiwitten: glycoproteïne E, kernproteïne C, en premembraaneiwit prM.

Tropische en trekvogels, die tot verschillende soorten behoren, zijn het voornaamste reservoir van het virus . Lijn 1 van WNV is een over de hele wereld geïsoleerde lijn, maar lijn 2 werd alleen geïsoleerd in Afrika en Madagaskar, tot de Hongaarse uitbraken van WNV, die werd veroorzaakt door een nieuwe lijn 2, die in Hongarije werd geïntroduceerd, waarschijnlijk door trekvogels uit Afrika, in 2004 . Dezelfde lijn 2 veroorzaakte in de zomer van 2010 endemische neuro-invasieve ziekte (WNND) bij mensen in Griekenland met 262 bevestigde gevallen en 35 sterfgevallen. In 2011 verspreidde het virus zich naar Centraal-Griekenland, maar met minder gevallen, 101 gediagnosticeerde en 9 dodelijke slachtoffers. Het totale aantal met het virus besmette mensen in Griekenland wordt geschat op 18000.

Meer dan 300 verschillende vogelsoorten zijn besmet met het WNV. Gewoonlijk circuleert het virus tussen wilde vogels en muggen in een gesloten cyclus en kan het door de vogels worden overgebracht tijdens hun trek naar de verschillende regio’s.

Het virus komt voor in vele landen over de hele wereld en ook in 20 Europese landen, waaronder landen die naaste buren van Polen zijn, waar de aanwezigheid van het virus is bevestigd. De aanwezigheid van WNV-antilichamen werd ook bevestigd in serummonsters van wilde vogels en mensen in Polen .

In 2010 werd menselijke morbiditeit en mortaliteit veroorzaakt door WNV-infectie gemeld in Griekenland, Rusland, Roemenië, Italië en Israël . de circulatie van het Usutu-virus is ook bevestigd in Polen . Er zijn geen andere studies gepubliceerd over de circulatie van andere virussen die verantwoordelijk zijn voor het Japanse encefalitiscomplex in Polen.

Het doel van de studie was de opsporing van WNV-antilichamen in serummonsters van verschillende wilde vogels, paarden, en gehospitaliseerde patiënten met neurologische symptomen.

2. Materialen en methoden

Vogels. Serummonsters van 474 wilde vogels, 400 witte ooievaars (Ciconia ciconia), 21 fazanten (Phasianus colchicus), 19 vinken (Fringilla coelebs), negen wilde eenden (Anas platyrhynchos), vier zeearenden (Haliaeetus albicilla), twee auerhanen (Tetrao urogallus), zes passagiersduiven (Ectopistes migratorius), drie haviken (Accipiter gentilis), twee klapeksters (Corvus cornix), drie haviken (Accipiter gentilis), en een gierzwaluw (Apus apus), merel (Turdus merula), spreeuw (Sturnus vulgaris), raaf (Corvus corax) en buizerd (Buteo buteo), werden verzameld op verschillende locaties in Polen (Dierentuinen, Revalidatiecentrum voor Beschermde Dieren). De meeste monsters waren echter afkomstig van het Wild Birds Rehabilitation Center, Albatros Foundation. De monsters werden verzameld in de periode maart-oktober, 2010-2014, toen de activiteit van de muggen het hoogst was (figuur 1).

Figuur 1

Kaart van Polen. Gebieden waar de monsters zijn verzameld.

Paarden. Er zijn 378 serummonsters verkregen van gezonde gedomesticeerde paarden uit enkele ranches in vier districten. De serummonsters werden ook genomen van renpaarden (figuur 1).

Mensen. Serummonsters afkomstig van 42 patiënten (17 mannen en 25 vrouwen) van de afdeling Infectieziekten en Neuroinfecties, Medische Universiteit van Bialystok. De patiënten vertoonden neurologische symptomen die kenmerkend zijn voor meningitis, lymfocytaire meningitis en door teken overgedragen encefalitis. Zij werden tussen mei en september 2010 in het ziekenhuis opgenomen. Alle patiënten werden getest op antilichamen tegen het tekenencefalitisvirus met Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus, Siemens . De monsters werden bewaard bij -20°C.

Alle onderzochte monsters werden dubbel gecontroleerd en getest onder bioveiligheidsniveau 3+ omstandigheden.

ELISA-1. Serologisch onderzoek werd uitgevoerd met een in de handel verkrijgbare competitie, ELISA ID Screen West Nile Competition (Innovative Diagnostics, Montpelier, Frankrijk), voor de opsporing van antilichamen tegen het West Nile-virus tegen de pr-E en pr-M envelope-eiwitten die een epitoop bevatten die gemeenschappelijk is aan het Japanse encefalitisvirus, volgens het protocol van de fabrikant. Alle monsters werden tweemaal onderzocht. De microtiterplaten werden afgelezen bij 450 nm. De ELISA werd gevalideerd wanneer de restbindingsratio’s (S/N%) werden berekend. Serummonsters met S/N-ratio’s gelijk aan of lager dan 40% werden als positief beschouwd; monsters met ratio’s hoger dan 50% werden als negatief beschouwd. S/N-waarden tussen 40% en 50% waren twijfelachtig.

ELISA-2 werd uitgevoerd met ID Screen West Nile IgM Capture (Innovative Diagnostics, Montpelier, Frankrijk). De putjes werden gecoat met polyklonaal IgM-antilichaam. Bij positieve resultaten verscheen de aanwezigheid van antilichamen als blauwe oplossing en na toevoeging van de stopoplossing werd deze geel. Bij afwezigheid van antilichamen verscheen er geen kleuring. De platen werden afgelezen bij 450 nm.

ELISA-3 werd uitgevoerd met Ingezim WNV Compac enzymatische assay (Ingenasa, Spanje) op basis van de blokkerende ELISA, waarbij een monoklonaal antilichaam (MAb) werd gebruikt dat specifiek is voor het eiwit E van WNV. Indien in serummonsters antilichamen aanwezig waren, bonden deze zich aan het antigeen. Wanneer MAb specifiek voor proteïne E werd toegevoegd, bond het aan het antigeen dat niet werd geblokkeerd door antilichamen uit serummonster. In het geval van antilichamen die het antigeen blokkeren, bindt het conjugaat het niet. De assay werd afgelezen door een colorimetrische reactie na toevoeging van het substraat. Monsters werden als positief beschouwd wanneer de OD-waarden gelijk waren aan of lager dan de positieve controlesera. Monsters werden als negatief beschouwd wanneer de OD-waarde gelijk was aan of hoger was dan de negatieve afkapwaarde. Monsters met een OD-waarde in het bereik van beide waarden werden als twijfelachtig beschouwd.

Virusmicroneutralisatietest. De virus-microneutralisatietest met ELISA-positieve monsters van wilde vogels werd uitgevoerd in het Europees Referentielaboratorium, ANSES, Frankrijk. Voor de test zijn Vero-cellen en West-Nijlvirus, stam IS-98-ST1, gebruikt. De test was gebaseerd op de standaardprocedure van het OIE.

3. Resultaten

Districten van Polen en gebieden waar de monsters werden verzameld, zijn aangegeven in figuur 1.

De meeste monsters werden genomen van de vogels tijdens de toewijzing en veterinaire behandelingen. Sommige vogels bevonden zich in het revalidatiecentrum na enkele ongevallen. De vogels vertoonden geen symptomen van neurologische aandoeningen en geen tekenen van neurologische infecties. Elke vogel werd door de organisatie die de monsters stuurde, voorzien van informatie over de locatie, het geslacht, de leeftijd en, indien mogelijk, over de reisgeschiedenis.

Het onderzoek van serummonsters bracht specifieke WNV-antilichamen aan het licht in 63 monsters van wilde vogels: 62 van witte ooievaars en één van vinkachtigen. Eén positief serummonster werd verkregen van een merrie.

Van de menselijke serummonsters waren er 14 van de 42 positief en één was twijfelachtig. Alle patiënten hadden een voorgeschiedenis van muggen- en tekenbeten. Bij 16 patiënten werd tekenencefalitis vastgesteld.

Om de resultaten te bevestigen werd ELISA-2 uitgevoerd om serum WNV IgM specifieke antilichamen op te sporen als een eerste lijn van immuniteitsreactie. De resultaten waren negatief en bevestigden dus niet de aanwezigheid van IgM-antilichamen of enig bewijs van recente besmetting van de dieren.

Om de met ELISA-1 verkregen resultaten te verifiëren, werd ELISA-3 uitgevoerd, en de aanwezigheid van specifieke WNV-antilichamen werd in deze gevallen bevestigd. De resultaten zijn weergegeven in tabel 1.

Voor de bevestiging van positieve resultaten werden de positieve serummonsters van de vogels opnieuw getest met een microneutralisatietest op het virus. Alle 63 serummonsters van wilde vogels werden bevestigd en positief bevonden voor WNV-antilichamen met een titer 10 in 60 monsters en een titer 30 in drie monsters. Wat het onderzoek van andere leden van JECV betreft, waren de monsters ook negatief voor Usutu-virus. Er werden geen kruisreactiviteit reacties waargenomen.

Vergelijking van de resultaten verkregen door verschillende diagnostische methoden (ELISA’s en virus microneutralisatie tests) wordt gepresenteerd in tabel 1.

4. Discussie

In de afgelopen jaren is vastgesteld dat WNV zich verspreidt in de landen met een gematigd klimaat. muggen van de familie Culicidae zijn de meest voorkomende vector van het virus verspreiding en tegenwoordig zes van de muggen soorten komen voor in het Poolse klimaat zone . In de jaren negentig van de vorige eeuw bevestigden Juřicová et al. met behulp van hemagglutinatieremmingstests antilichamen tegen WNV bij 12,1% van de huismussen (Passer domesticus) en bij 2,8% van de Euraziatische boommussen (Passer montanus) in het Campinas bosgebied in Polen. In de volgende jaren werden WNV-antilichamen gevonden bij drie ooievaars, één kraai (Corvus corone cornix), en één knobbelzwaan (Cygnus olor) in het andere deel van Polen.

We hebben drie verschillende ELISA’s uitgevoerd om de verkregen resultaten te presenteren en vervolgens te bevestigen. De eerste ELISA was ID Screen West Nile Competition, test specifiek voor WNV, maar geeft ook serologische kruisreacties tussen de JECV leden. Wanneer positieve resultaten werden verkregen, werd de ELISA-2 West Nile IgM Capture test uitgevoerd, die alleen specifiek is voor WNV en kruisreacties kan uitsluiten, maar alleen IgM opspoort. Dit betekent dat we alleen een recente infectie kunnen vaststellen en geen IgG-antilichamen kunnen opsporen. ELISA-3 werd gebruikt om de verkregen resultaten met ELISA-1 te bevestigen en de resultaten werden in 100% van de gevallen bevestigd.

In onze studie werden positieve resultaten met serummonsters van wilde vogels, verkregen met de ELISA’s, bevestigd met een virus-microneutralisatietest. Bovendien toonden ELISA’s WNV-antilichamen aan in 14 van de 42 serummonsters van patiënten met symptomen van meningitis, lymfocytaire meningitis, en door teken overgedragen encefalitis, maar we konden de verkregen resultaten niet verifiëren met plaque reduction neutralisatietest (PRNT). WNV-infectie bij de mens en identificatie van WNV in cerebrospinaal vocht werden gewoonlijk bevestigd door RT-PCR, Nested PCR, of in formaline-vaste, paraffine-embedded menselijke weefsels door RT-PCR. Volgens de studie van Czupryna e.a. waren alle monsters van cerebrospinaal vocht van 24 patiënten die waren opgenomen op de afdeling Infectieziekten en Neuroinfecties, Medische Universiteit van Bialystok, negatief voor WNV RNA.

serummonsters van mensen, vogels en paarden werden gebruikt als goede monsters om specifieke WNV-antilichamen te bepalen. Als we de specifieke antilichamen in serummonsters bevestigden, werd het dier of de mens beschouwd als in contact geweest met het virus (in Polen of buiten het land). Aangenomen wordt dat positieve wilde vogels in contact kunnen zijn geweest met het virus buiten het land. Wat de positieve monsters van mensen betreft, hebben 11 patiënten het land nooit verlaten; dat betekent dat zij al in Polen met het virus in contact moesten zijn geweest. Hetzelfde geldt voor de paarden, die volgens hun reisgeschiedenis het land nooit hebben verlaten.

Op basis van de epidemiologische situatie in Europa, de rol van wilde vogels bij de overdracht van WNV en de resultaten van eerdere serologische onderzoeken bij mensen en vogels, blijkt dat de aanwezigheid van WNV in Polen mogelijk is. In Polen werden WNV-antilichamen aangetroffen bij koortsige vrouwen en bij gezonde bosarbeiders uit de regio’s Swietokrzyskie (28,85%) en Podlaskie (34,14%) . Onze serologische resultaten kunnen erop wijzen dat het virus reeds aanwezig is in onze klimaatzone en in ons ecosysteem. Er moet rekening worden gehouden met de mogelijkheid van een kruisreactie met virussen van tekenencefalitis en endemische ziekten.

Ethische goedkeuring

De studie werd goedgekeurd door de II lokale Ethische Commissie in Lublin (nummer 92/2010 van 16 november 2010) en kreeg de toestemming van de Algemeen Directeur van Milieubescherming (nummer DOP-OZGŁZ. 6401.03.36.2011.dł).

Belangenconflict

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is.

Acknowledgments

De auteurs willen graag hun erkentelijkheid uitspreken voor de financiële ondersteuning door een kaderwerkproject P/020, Vrijlevende watervogels als reservoir en de vector tijdens de uitbreiding van virale ziekten, en kaderwerkproject W/211, Ontwikkeling diagnostische methoden en risico-evaluatie van het vóórkomen van West-Nijl Virusinfectie bij vogels in Polen (2014-2018).