In deze studie, om de rol van IRE1a-XBP1 pathway te begrijpen, was onze basisstrategie om een in vitro Th2 differentiatiemodel te gebruiken (Fig. 1b). Naïeve T-helpercellen werden geactiveerd door TCR activering in anti-CD3e/CD28-gecoate platen onder Th2-differentiatieconditie gedurende 72 uur, rustten gedurende 42 uur, en werden opnieuw geïmmuleerd door TCR activering met anti-CD3e/CD28-gecoate platen. Om de IRE1a-XBP1-route te verstoren, gebruikten we een bekend geneesmiddel 4μ8c dat specifiek de route blokkeert door remming van de IRE1a endonuclease activiteit. Het geneesmiddel werd toegevoegd aan de kweekmedia in een concentratie van 15 μM aan het begin van de kweek en tijdens de overgang van de activeringsplaat naar de rustplaat. De keuze van de concentratie van het geneesmiddel werd bepaald door de hoogste IRE1a remmingsefficiëntie met de laagste celtoxiciteit (Additional file 1: Figuur S1). We vergeleken transcriptomen van naïeve en herstimuleerde Th2 (medicijn behandeld en onbehandeld) lymfocyten door RNA sequencing, identificeerden XBP1 transcriptiefactor bindingsplaatsen in gereactiveerde Th2 door ChIPmentatie (ChIP-sequencing), en integreerden de genoom-brede gegevens om directe doelwitten en hun regulerende rol te voorspellen.

T-helpercellen schakelen de IRE1a-XBP1-route in tijdens in vitro activatie

Geactiveerde en gedifferentieerde T-helpercellen scheiden een overvloed aan cytokines uit. Daarom is een goed ontwikkelde secretorische machinerie een eerste vereiste voor cellen om zich aan deze secretorische stress aan te passen. Om de betrokkenheid van ER-stress/UPR pathway tijdens T helper cel activatie te voorspellen, vergeleken we het transcriptoom van naïeve en gedifferentieerde Th2 cellen (restimulated Th2). Differentieel tot expressie komende genen, verkregen uit deze vergelijking, werden geïntegreerd in de “Protein Processing in the Endoplasmic Reticulum” KEGG pathway om de componenten te visualiseren die up- of downgereguleerd zijn. De analyse toont aan dat wanneer naïeve T helper cellen worden geactiveerd en gedifferentieerd tot Th2 cellen, zij de expressie van genen betrokken bij de ER stress pathway upreguleren (Additional file 1: figuur S2). Verschillende factoren die eerder zijn gekarakteriseerd als controleurs van eiwitvouwing en secretie, waaronder XBP1 zelf, worden geüpreguleerd tijdens T helper celdifferentiatie.

Om deze voorspelling te valideren, en specifiek de betrokkenheid van de IRE1a-XBP1 route te onderzoeken, maten we IRE1a mRNA en eiwitexpressie in Th2 lymfocyten gedifferentieerd en gereactiveerd in vitro (Fig. 1b). De cellen werden geanalyseerd door qPCR en Western blot om respectievelijk het mRNA en het eiwit te vergelijken. Wij vonden dat zowel het mRNA als het eiwit niveau verhoogd waren in geactiveerde T helper cellen (Fig. 1c, linker en middelste paneel). Het is bekend dat fosforylering van IRE1a zijn functionele toestand aanduidt. Wij stelden vast dat het eiwit gefosforyleerd is in geactiveerde Th2 lymfocyten (Fig. 1c, rechter paneel). Deze verhoogde fosfo-IRE1a kan verklaard worden door de verhoogde synthese van het eiwit, hoewel we de mogelijkheid van verhoogde kinase activiteit en auto-fosforylering niet kunnen uitsluiten. De densitometrische analyse van de Western blot band suggereert dat beide mechanismen, upregulatie van de eiwitsynthese en verhoogde fosforylering, hierbij betrokken zijn. De eiwitupregulatie verdrievoudigde, maar het fosfo-eiwit nam 4,5-voudig toe (Fig. 1c).

Geactiveerd IRE1a splitst het ongesplitste XBP1 (XBP1u) mRNA en produceert een gesplitste XBP1 (XBP1s) mRNA isovorm. We zagen een toename van de gesplicte vorm van XBP1 (XBP1s), zowel op mRNA- als eiwitniveau, bij activering van T-helpercellen (Fig. 1d, e). Tunicamycine werd gebruikt als positieve controle. Het is een geneesmiddel dat N-gekoppelde glycosylering remt en daardoor accumulatie van ongevouwen eiwitten (d.w.z. endoplasmatisch reticulum (ER) stress) veroorzaakt, en XBP1s verhoogt door de IRE1a activiteit te verhogen. Specifieke remming van de IRE1a endonuclease activiteit door de cellen te behandelen met 4μ8c deed zowel de XBP1s mRNA als eiwit isovormen verdwijnen, wat bevestigt dat de vorming van de gesplicte vorm afhankelijk was van IRE1a activiteit (Fig. 1d, e).

Deze resultaten bevestigen dat de IRE1a-XBP1 pathway geconserveerd is in Th2 lymfocyten en opgehoogd wordt tijdens in vitro T helper cel activering. Vervolgens hebben we onderzocht of dit ook in vivo geldt.

In vivo geactiveerde T-helpercellen upreguleren de IRE1a-XBP1 route

Om te testen of de IRE1a-XBP1 route operationeel is in CD4+ T cellen in vivo, hebben we C57BL/6 muizen geïnfecteerd met de helminth parasiet Nippostrongylus brasiliensis, een gerenommeerd model van Th2-gedreven immuunresponsen. Na 7 dagen post-infectie analyseerden we de XBP1s eiwitexpressie in T-helpercellen door middel van flowcytometrie. We ontdekten dat T-helpercellen van muizen met een worminfectie significant meer XBP1s tot expressie brengen in vergelijking met niet-geïnfecteerde controlemuizen, wat wijst op een upregulatie van de pathway (Fig. 2).

Deze resultaten bevestigen dat de route actief is in vivo. Daarom hebben we de route ontleed met behulp van genoombrede benaderingen in Th2-lymfocyten.

Genoombrede transcriptoomanalyse van differentiële genexpressie onthult IRE1a-XBP1-gereguleerde genen

Om een globale genregulerende rol van de IRE1a-XBP1-route vast te stellen, hebben we in vitro geactiveerde Th2-cellen vergeleken met cellen met geremde IRE1a-endonucleaseactiviteit door 4μ8c toe te voegen aan de celkweekmedia. Vervolgens vergeleken we de transcriptomen van geactiveerde Th2 lymfocyten met of zonder remming van de IRE1a-XBP1 pathway. Transcriptomen van 4μ8c-behandelde en onbehandelde Th2 cellen werden verkregen door mRNA-sequencing (RNA-seq). Kwaliteitscontrole van de RNA-sequencing gegevens wordt weergegeven in aanvullend bestand 1: Figuur S3. Het vergelijken van transcriptomen van naïeve en geactiveerde Th2 lymfocyten, vonden we dat 10995 genen differentieel gereguleerd werden bij Th2 activatie. Remming van de IRE1a-XBP1 route door 4μ8c behandeling resulteerde in differentiële expressie van 3144 genen in vergelijking met de onbehandelde Th2 controle (Fig. 3a, Additional file 1: Figuur S3 rechter paneel). Tweeduizend zeshonderd zeventig van deze genen waren betrokken bij Th2 differentiatie (Fig. 3a). Hiërarchische clustering van de genen onthult de groepen van genen up- en downgereguleerd bij 4μ8c behandeling (Additional file 1: Figuur S3, rechts). Gedetailleerd onderzoek van deze genen toonde aan dat velen geassocieerd zijn met de ontvouwen eiwitrespons en ER-stress, wat wijst op een grote invloed van de IRE1a-XBP1 route (Fig. 3b) op deze biologische processen. De volledige lijst van differentieel tot expressie komende genen kan worden gevonden in Additional file 2: Tabel S1. Gene Ontology (GO) analyse van deze differentieel tot expressie komende genen na 4μ8c behandeling van Th2 cellen (d.w.z., IRE1a-XBP1 pathway gereguleerde genen) toonde aan dat ze verrijkt zijn in de volgende biologische processen: “Reactie op ER stress” (GO:0006950), “Regeling van signaaltransductie” (GO:0009966), “Cytokineproductie” (GO:0001816), “celproliferatie” (GO:0008283), “celcyclus” (GO:0007049), en Immuunrespons (GO:0006955) (Fig. 3c). Deze veranderingen in de genexpressiepatronen bij remming van IRE1a suggereren een verregaande betrokkenheid van XBP1 transcriptiefactor bij Th2 activering en proliferatie, alsook differentiatie. Daarom gingen we op zoek naar de genoomwijde chromatinebezettingspatronen van de XBP1-transcriptiefactor.

Differentiële genexpressie in Th2 als gevolg van de remming van IRE1a-XBP1 door 4μ8c. Naïeve T-helpercellen werden geactiveerd onder Th2-differentiatieomstandigheden in aanwezigheid of afwezigheid van 4μ8c. Cellen werden geactiveerd in anti-CD3e en anti-CD28 antilichaam-gecoate platen gedurende 3 dagen, rustte gedurende 2 dagen, en gereactiveerd in gecoate platen gedurende 6 uur. De RNAseq gegevens werden geanalyseerd op differentiële genexpressie. a Venn diagram met de aantallen differentieel tot expressie komende genen in verschillende experimentele omstandigheden. “Naïeve → Th2” geeft de differentieel tot expressie komende genen tussen naïeve T helpers en Th2 cellen. “Th2 → Th2 + 4μ8c” geeft de differentieel tot expressie komende genen tussen onbehandelde en 4μ8c-behandelde Th2. b Heatmap met differentieel tot expressie komende genen waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij resolutie van ER stress opgelegd door ontvouwen eiwitrespons. De heatmap toont geschaald expressiewaarden aangeduid als rij Z-score, in rood-blauwe kleurenschaal met rood wijst op verhoogde expressie en blauw wijst op verminderde expressie. c Gene ontology (GO) analyse van de differentieel tot expressie komende genen tussen Th2 en 4μ8c-behandelde Th2

XBP1 ChIPmentation onthult XBP1 directe doelgenen in Th2-cellen

Om de genoom-brede chromatine bezetting van XBP1 te identificeren, hebben we ChIPmentation uitgevoerd, een recent ontwikkelde methode waarvan is aangetoond dat deze sneller, gevoeliger en robuuster is dan traditionele ChIP-seq benaderingen , met behulp van een ChIP-waardig antilichaam tegen XBP1. In vitro gedifferentieerde en gereactiveerde Th2 cellen werden gebruikt voor de XBP1 ChIP. Twee onafhankelijke biologische herhalingen werden uitgevoerd. We verkregen respectievelijk 19,3 miljoen en 22,4 miljoen pair-end reads voor elk replicaat. Met behulp van MACS2 met een q-waarde van minder dan 0,01 en een vouwverrijking van meer dan 5, identificeerden wij respectievelijk 9031 en 7662 pieken in de twee replicaten. Overlappende analyse met behulp van bedtools suggereerde dat 5892 pieken in beide replicaten aanwezig waren. Daarom hebben we ons alleen gericht op deze 5892 pieken voor de downstream-analyse.

Zoals verwacht werden bindingspieken geïdentificeerd rond promotorregio’s in bekende XBP1-doelgenen, zoals Hspa5 dat codeert voor ER-chaperon-eiwit BiP ook bekend als Grp78; een bindingsgebeurtenis werd ook waargenomen rond de promotor van XBP1 zelf (Fig. 4a), wat wijst op potentiële autoregulatie van XBP1. Om de genomische kenmerken te achterhalen die geassocieerd zijn met de XBP1 bindingsplaatsen, vergeleken we de pieklocatie met de RefSeq genen met behulp van HOMER . De meerderheid van de XBP1 bindingspieken bevonden zich binnen de promotor (gedefinieerd als upstream 1000 bp en downstream 500 bp ten opzichte van de geannoteerde transcriptionele startplaatsen) (36%) en intronic (35%) regio’s, en distale intergenic bindingsgebeurtenissen (25%) werden ook vaak waargenomen (Fig. 4b). De genomische verdeling van XBP1-pieken geeft aan dat het zowel promotors als potentiële enhancers bindt.

Genoomwijde chromatinebezetting van XBP1-transcriptiefactor in Th2-lymfocyten. XBP1 ChIPmentation werd uitgevoerd in in vitro gedifferentieerde Th2-cellen om genoom-brede XBP1 chromatine bezetting te verkrijgen. a Momentopname van XBP1 bindende pieken rond aangegeven representatieve genen uit de UCSC genoom browser. b Genomische verdeling van XBP1 bindende pieken. De sector die overeenkomt met de promotor omvat sequenties tot 1 kb stroomopwaarts en 100 bp stroomafwaarts van de TSS. c Vergelijking van de XBP1 motieven uit de JASPAR database (boven), ChIP-seq van de menselijke borstkanker cellijnen (midden), en muis Th2 lymfocyten (onder). d Motieffrequenties van XPB1 en NF-Y rond de bindingspieken van XBP1. e GO-termen van biologische processen verrijkt binnen XBP1-bindingspieken geanalyseerd door GREAT

Om het XBP1-reguloom verder te karakteriseren, hebben we de novo motiefontdekking uitgevoerd met HOMER om verrijkte DNA-motieven binnen XBP1-bindingsregio’s te identificeren. Het top motief dat werd geïdentificeerd is de consensus sequentie GCCACGT, die bijna identiek is aan het menselijke XBP1 bindingsmotief gedefinieerd in borstkanker cellijnen (Fig. 4c) . Dit wijst op sterk geconserveerde bindingspecificiteiten van XBP1 tussen mens en muis en tussen celtypes. Het top motief verrijkt in onze muis gegevens lijkt ook op de XBP1 motief uit de JASPAR database , opnieuw ter ondersteuning van de hoge kwaliteit van onze ChIPmentation gegevens. Het tweede meest verrijkte motief is het NF-Y bindingsmotief (Additional file 1: Figuur S4C). Interessant is dat het NF-Y motief vaak gevonden wordt rond promotor regio’s van celcyclus genen, vooral genen die betrokken zijn bij G2/M celcyclus regulatie. Zowel het XBP1 motief als het NF-Y motief komen samen voor rond een subset van 258 XBP1 bindingspieken (Fig. 4d), wat wijst op mogelijke samenwerking tussen XBP1 en NF-Y transcriptiefactoren om een subset van doelgenen te reguleren. De lijst van doelgenen die mogelijk co-gereguleerd worden door XBP1 en NF-Y is weergegeven in Additional file 3: Table S2, en een volledige lijst van XBP1 doelen is ook te vinden in Additional file 3: Table S2. De top vijf verrijkte motieven worden weergegeven in aanvullend bestand 1: Figuur S4C. Om de functies van XBP1-gebonden genen te onderzoeken, gebruikten we GO-termen om XBP1-bindingspieken te karakteriseren. De meeste significante GO-termen zijn gerelateerd aan eiwitvouwing en ER-stress (Fig. 4e), wat consistent is met de bekende biologische rol van XBP1.

Alles bij elkaar voorspellen de ChIPmentatie-experimenten een rol van XBP1 in het verbeteren van eiwitvouwing en secretie, evenals activering van Th2 lymfocyten.

Integratie van transcriptomische gegevens en ChIP-seq gegevens om het XBP1-gecontroleerde genreguleringsnetwerk te ontrafelen

Om de XBP1-gereguleerde directe doelgenen en zijn transcriptiereguleringsnetwerk te onthullen, integreerden we de genoombrede transcriptomische gegevens en de ChIPmentatiegegevens. Een direct doelwitgen wordt gedefinieerd door zijn differentiële expressie bij remming van IRE1a (d.w.z. 4μ8c behandeling) en XBP1-transcriptiefactorbezetting op de genlokus. We vonden 1143 directe doelgenen in Th2, waarvan 122 doelen eerder werden gerapporteerd als XBP1 direct doelwit in andere celtypes (d.w.z., spier, pancreas β-cel, en plasmacel) (Fig. 5a). In deze context kunnen 1021 genen als Th2-specifiek worden beschouwd. XBP1 actie over zijn directe doelwitten heeft geen gedefinieerde richting, met genen up- en downregulated. De top 38 genen die een van deze patronen volgen worden getoond in Fig. 5b, en de volledige lijst is te vinden in Additional file 4: Table S3. De meest significante geïdentificeerde biologische processen en paden zijn gerelateerd aan eiwitvouwing en ER-stress (Additional file 1: Figuur S5), die consistent zijn met de bekende biologische rollen, en bevatten ook nieuwe Th2-specifieke targets.

Integratie van ChIPmentatie en RNA-seq gegevens onthult XBP1 directe doelgenen en zijn regulerende netwerk. een Venn-diagram waarin eerder gerapporteerde XBP1-doelgenen van andere secretorische celtypen worden vergeleken met de Th2 directe doelgenen van deze studie. XBP1 directe doelgenen van deze studie zijn die welke gemeenschappelijk zijn in zowel “XBP1-bezette genen in Th2” en “Differentieel tot expressie komende genen (Th2 → Th2+4μ8c)” categorieën. De XBP1 directe doelgenen van B-cel / plasmacel, skeletspiercellen, en pancreas β-cellen werden zoals waargenomen door Acosta-Alvear et al. en zijn hier gebruikt voor vergelijking. b Heatmap toont het patroon van XBP1 directe doel genexpressie. De top 38 genen die een duidelijk patroon volgen zijn weergegeven. c Transcriptieregulerend netwerk: transcriptiefactoren die een direct doelwit zijn van XBP1. De genen in het netwerk komen differentieel tot expressie (upregulated-rood; downregulated-blauw) op 4μ8c behandeling. De transcriptiefactoren die niet differentieel tot expressie komen, maar een XBP1 ChIPseq piek hebben, worden getoond in de rechter lijst

Ondanks het overwicht van de rol van XBP1 in het controleren van deze route, blijken ook andere transcriptiefactoren betrokken te zijn. Om de regulerende cascade te onderzoeken die volgt op XBP1-regulatie, hebben we een transcriptieregulerend netwerk gebouwd door geannoteerde transcriptiefactoren met promotor- of exonische/intronische ChIP-seq-pieken te extraheren (Fig. 5c). De volledige lijst van de transcriptiefactoren is te vinden in Extra bestand 5: Tabel S4. Dit netwerk werd verder aangevuld door het toevoegen van differentieel tot expressie komende genen die geannoteerde interacties hebben met de doeltranscriptiefactoren in de STRING database (Additional file 6: Table S5).

De transcriptiefactoren die direct worden gereguleerd door XBP1 kunnen worden gecategoriseerd in drie brede functionele categorieën die betrokken zijn bij het volgende: resolutie van eiwit secretorische ER stress, regulering van de celcyclus en proliferatie, en het controleren van effector immuuncel functie. De ER-stress betrokken transcriptiefactoren zullen waarschijnlijk de cytokine secretie in Th2 lymfocyten vergemakkelijken. Deze voorspelling is gebaseerd op eerdere rapporten van secretorische cellen zoals pancreas acinar cellen en plasma cellen. Van deze transcriptiefactoren, namelijk Bhlha15, Atf3, Atf6, Atf6b, Atf4, en Creb3l2, is aangetoond dat ze betrokken zijn bij secretorische stressadaptatie van het ER .

Het doel van celproliferatie en celcyclus-gerelateerde transcriptiefactoren zou kunnen zijn om de gecontroleerde snelle expansie van geactiveerde Th2 cellen te vergemakkelijken. De immuunrespons-gerelateerde factoren zijn waarschijnlijk betrokken bij Th2 differentiatie en cytokine productie. Daarom wilden we het effect testen van XBP1s downregulatie in cytokine secretie, cel proliferatie, en cytokine productie.

De IRE1a-XBP1 pathway controleert cytokine secretie in T helper cellen

De genoom-brede vergelijking van XBP1s-gereguleerde genen voorspelt dat de factor betrokken is bij de secretie van cytokines. Om deze voorspelling te valideren, blokkeerden we de IRE1a endonuclease activiteit in Th2 cellen en analyseerden het celcultuursupernatant om het IL4 niveau te kwantificeren door ELISA. We selecteerden IL4 als een testbare kandidaat cytokine omdat zijn mRNA en eiwit onveranderd zijn door downregulatie van XBP1 (Additional file 1: Figuur S6A linker paneel, Fig. 6 linker en middelste paneel van de bovenste rij). We vonden dat de secretie van IL4 aanzienlijk werd geremd in 4μ8c-behandelde cellen (Fig. 6, rechter paneel van de bovenste rij). Zoals verwacht, ondersteunt dit resultaat de betrokkenheid van de IRE1a-XBP1 route in het vergemakkelijken van cytokine secretie in Th2 cellen zoals voorspeld. De remming van de pathway tijdens de restimulatie fase heeft geen significant remmend effect op de IL4 secretie (Additional file 1: Figuur S6B). Dit resultaat suggereert dat de XBP1s nodig is tijdens de Th2-differentiatie, mogelijk voor de ontwikkeling van een efficiënte secretorische machinerie.

IRE1a-XBP1 pathway is nodig voor cytokine expressie en secretie in Th2 lymfocyt. Naïeve T-helpercellen werden gekweekt na Th2 activering voorwaarde in de aanwezigheid van IRE1a remmer 4μ8c gedurende 3 dagen, rustte gedurende 2 dagen, gereactiveerd door gecoate plaat, en geanalyseerd door flowcytometrie naar intra-cellulaire cytokines IL4, IL5, en IL13 expressie te detecteren. Vertegenwoordiger FACS profielen worden weergegeven in de eerste twee kolommen. De intra-cellulaire cytokine expressie wordt vergeleken in kolom 3, met drie tot zeven onafhankelijke biologische replicaten. Vierde kolom: celcultuur supernatanten van 4μ8c-behandelde of DMSO-behandelde Th2 werden geanalyseerd door ELISA om de cytokine concentratie te meten. FACS gating: lymfocyten > singlets > levende cellen > cytokines

De IRE1a-XBP1 pathway controleert IL13 en IL5 cytokine expressie

IL5 en IL13 zijn twee prominente type 2 cytokines die betrokken zijn bij eosinofilie, allergieën en helminth infectie. Wij vonden dat remming van het IRE1a-XBP1 pad de IL5 en IL13 eiwitexpressie en secretie in het kweekmedium aanzienlijk onderdrukt (Fig. 6 rechter panelen van de middelste en onderste rij). Bioinformatica analyse van het Th2 transcriptoom voorspelt dat de IRE1a-XBP1 pathway IL5 en IL13 genexpressie positief controleert, omdat beide genen werden geïdentificeerd als differentieel tot expressie komende genen bij IRE1a remming (Additional file 2: Tabel S1). We valideerden deze voorspelling door RT-qPCR-gemedieerde genexpressie analyse (Additional file 1: Figuur S6A, midden en rechter paneel) en flow cytometrie (Fig. 6). Deze resultaten suggereren een transcriptionele betrokkenheid van de route die IL5 en IL13 reguleert. Met name de IL4 mRNA- en eiwitniveaus worden niet beïnvloed, hetgeen wijst op specifieke regulatie van IL5 en IL13.

IRE1a-XBP1 pathway faciliteert activatie-afhankelijke T helpercel proliferatie

Celproliferatie is een resultaat van positieve en negatieve regulatoren interactie. We observeerden dat genen die coderen voor zowel positieve als negatieve regulatoren van celproliferatie genen differentieel tot expressie komen wanneer de IRE1a-XBP1 pathway werd geblokkeerd door 4μ8c (Fig. 7a, linker paneel, Additional file 7: Tabel S6), waarvan vele genen directe doelwitten van XBP1 bleken te zijn (Fig. 7a, rechter paneel, Additional file 8: Tabel S7). Deze waarneming voorspelt een verandering in de proliferatiesnelheid bij remming van IRE1a. Daarom waren we geïnteresseerd in het controleren van het effect van IRE1a-XBP1 remming op de celproliferatie. We voerden celproliferatietests uit met Th2 cellen. Naïeve splenic CD4 + T-cellen werden gelabeld met CellTrace violet en geactiveerd onder Th2 differentiatie conditie in de aanwezigheid of afwezigheid van 4μ8c. Het verval van de fluorescerende kleurstof werd gecontroleerd door flowcytometrie. We vonden dat downregulatie van XBP1s de celproliferatie aanzienlijk remt (Fig. 7b), maar geen celdood induceert (Additional file 1: Figuur S7).

IRE1a-XBP1-route bevordert activeringsafhankelijke Th2-celproliferatie en celcyclus. a Linker paneel: hiërarchische clustering van differentieel tot expressie komende celproliferatie-geassocieerde genen in het met 4μ8c behandelde en onbehandelde Th2-transcriptoom. Rechter paneel: hiërarchische clustering van XBP1 directe doelgenen waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij celproliferatie. De heatmap toont geschaalde expressiewaarden aangeduid als rij Z-score, in rood-blauwe kleurenschaal met rood voor verhoogde expressie en blauw voor verlaagde expressie. b Splenic naïeve T helpercellen werden gekleurd met CellTrace Violet kleurstof en geactiveerd gedurende 72 uur onder Th2 differentiatie omstandigheden en geanalyseerd door flowcytometrie. Generaties van Th2-cellen zijn in “rood” en 4μ8c-behandelde cellen zijn in “blauw” in het histogram van celproliferatie (linker paneel, een representatief experiment). Grafische weergave van de delingsindex zoals verkregen uit vijf onafhankelijke biologische replicaten (rechter paneel)

T-helpercelproliferatie is geassocieerd met differentiatie en cytokineproductie. De verminderde IL5- en IL13-expressie (Fig. 6) zou mogelijk verklaard kunnen worden door het feit dat de celproliferatie wordt vertraagd. Indien echter de verminderde proliferatie de voornaamste reden voor het gebrek aan secretie zou zijn, zou ook de IL4 productie geremd zijn. Toch zagen we geen significante verandering in IL4 expressie na remming van IRE1a (Fig. 6, Additional file 1: Figuur S6A). Om deze discrepantie verder te onderzoeken, voerden we celproliferatie testen uit met IL13-GFP en IL4-GFP reporter muislijnen. In IL4-GFP expresserende Th2 cellen, zagen we een remming van de IL4 productie in de eerste paar generaties van celdeling tot 72 uur na 4μ8c behandeling (Additional file 1: figuur S8). Maar na 96 uur, wordt het verschil in IL4 expressie onbeduidend, ongeacht in welke generatie van celdeling de cellen zich bevinden. Deze waarneming suggereert dat de vertraging van de proliferatie als gevolg van de IRE1a remming niet voldoende is om IL4 expressie te remmen. In tegenstelling hiermee, in IL13-GFP, zagen we de afname van IL13 expressie vanaf de allereerste generatie en dit gaat door in de latere generaties (Additional file 1: figuur S9).

IRE1a-remming vertraagt de celcyclusprogressie door de S- en G2/M-fase

Bioinformatica-analyse van differentieel tot expressie komende genen (Th2 vs 4μ8c-behandelde Th2) en XBP1 directe doelgenen onthult verschillende genen die betrokken zijn bij het controleren van de celcyclusprogressie door verschillende stadia (d.w.z., G1, S, G2/M) werden geclusterd in twee groepen up- of downregulated (Fig. 8a). We namen genen differentieel tot expressie in 4μ8c-behandelde Th2 in vergelijking met onbehandelde Th2 (aangepaste p-waarde < 0,05) (Fig. 8a, links, Additional file 9: Tabel S8) en de genen differentieel tot expressie XBP1 directe doelgenen (Fig. 8a, rechts, Additional file 10: Tabel S9), en gecontroleerd op bekende rollen in verschillende celcyclus stadia met behulp van ofwel een handmatig gecureerde lijst op basis van RNA-seq gegevens of gepubliceerde database . We vonden veel genen van alle celcyclus stadia (dat wil zeggen, G1, S, en G2 / M) werden beïnvloed. Om de celcyclus stadia gereguleerd door IRE1a-XBP1 pathway te identificeren, creëerden en gebruikten we een transgene FUCCI (fluorescent ubiquitin cell cycle indicator) muizenstam die mCherry-tagged Cdt1 en mVenus-tagged Geminin eiwit tot expressie brengt. De stam is vergelijkbaar met die gebruikt in . De G1-cellen zijn mCherry + mVenus- (Q3; Fig. 8b), G1-S cellen zijn mCherry + mVenus + (Q2; Fig. 8b), en SG2M zijn mCherry- mVenus + (Q1; Fig. 8b), terwijl cellen in mitose en het invoeren van G1 zijn mCherry- mVenus- (Q4; Fig. 8b). We vergeleken celcyclus profielen van voertuig en 4μ8c behandelde Th2-cellen tijdens T-cel activering. We vonden dat cellen zich ophoopten in de S-en / of G2/M-fase wanneer de IRE1a-XBP1 pathway is geblokkeerd (Fig. 8b). Vergelijkbare resultaten werden verkregen in een andere aanpak met behulp van BrdU incorporatie assay met DAPI kleuring (Additional file 1: figuur S10).

IRE1a remming vertraagt de celcyclus progressie door de S en G2/M fase. a Linker paneel: heatmap van differentieel tot expressie komende celcyclus fase-geassocieerde genen in de 4μ8c-behandelde en onbehandelde Th2 transcriptoom. Rechter paneel: heatmap van XBP1 directe doelwit genen waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij de celcyclus. De heatmap toont geschaalde expressiewaarden aangeduid als rij Z-score, in rood-blauwe kleurenschaal met rood op verhoogde expressie en blauw op verlaagde expressie. b Celcyclus analyse van Th2 lymfocyten na 72 uur van activering, met behulp van FUCCI muislijn die mCherry-getagged CDT1 en Venus-getagged GEMININ uit te drukken. Linksboven: schematische weergave van de celcyclus stadia in de gebruikte FUCCI muis. Rechtsboven: vergelijking van cellen (% van het totaal) verkregen uit verschillende stadia van de celcyclus in Th2 en 4μ8c-behandelde Th2 (n = 6). Onderste panelen: een representatief FACS-profiel van Th2 en 4μ8c-behandelde Th2 met CDT1 en GEMININ expressie cellen

Transgene expressie van XBP1s complementeert de 4μ8c-gemedieerde remming van IRE1a endonuclease activiteit

Om te testen of de waargenomen 4μ8c-behandelde fenotypen te wijten waren aan het verlies van XBP1s, hebben we complementatietests uitgevoerd door transducerend een XBP1s expressievector in de Th2 cellen in vitro. De vector codeerde voor de gesplicte vorm van XBP1 (XBP1s), waarvan de functie onafhankelijk is van de functie van IRE1a. We vonden dat stabiele ectopische expressie van XBP1s het effect van 4μ8c behandeling teniet doet en er is geen significante verandering in het transcriptoom op 4μ8c behandeling wanneer Th2 cellen XBP1s overexpresseren (Additional file 1: figuur S11A). XBP1s overexpresserende Th2-cellen prolifereren en differentiëren normaal in aanwezigheid van 4μ8c (Additional file 1: Figuur S11B en S11C respectievelijk). Deze resultaten suggereren sterk dat de fenotypen waargenomen op 4μ8c behandeling te wijten zijn aan het verlies van XBP1s.