Global bla KPC-E. coli-stammen zijn divers, zelfs binnen de meest voorkomende ST, ST131, met bewijs voor lokale transmissie

45 isolaten werden verkregen uit 21 steden in 11 landen verspreid over vier continenten (2010-2013; eerdere laboratoriumtyperingsresultaten samengevat in Tabel S1). Eén isolaat was bla KPC-negatief op whole-genome sequencing (WGS; ecol_252), mogelijk door verlies van bla KPC tijdens opslag of subkweek in de tussenliggende periode tussen het moment waarop de oorspronkelijke typering werd uitgevoerd en de daaropvolgende DNA-extractie en voorbereiding voor WGS. Voor één isolaat waren de WGS-gegevens inconsistent met de labtyperingsresultaten (ecol_451), waarschijnlijk een verwisseling in het laboratorium; ecol_252 en ecol_451 werden daarom van verdere analyses uitgesloten. De andere 43 isolaten werden met succes gesequeneerd (voor kwaliteitsmetingen zie Tabel S1). Onder deze 43 isolaten waren 21 verschillende E. coli STs vertegenwoordigd (Tabel 1; voorspeld in silico uit WGS), waaronder: ST131 , ST410 , ST38 , ST10, ST69 (overige isolaten singleton STs).

Van de 16 053 geannoteerde open leesramen (ORF’s) die in alle KPC-E. coli-isolaten zijn geïdentificeerd, waren er slechts 2 950 (18,4%) die in alle isolaten voorkwamen (“kern”), en nog eens 222 (1,4%) in 95- < 100% van de isolaten (“zachte kern “27). Op nucleotidenniveau waren er 213.352 single nucleotide varianten (SNV’s) in het kerngenoom, consistent met de eerder waargenomen soortendiversiteit28. Resistentiegenprofielen varieerden ook aanzienlijk tussen stammen, waarbij sommige verschillende resistentiemechanismen tegen beta-lactam, aminoglycoside, tetracycline en fluorochinolon bevatten (bv. ecol_224) en andere alleen bla KPC (bv. ecol_584; Fig. 1). Voor de 16 KPC-ST131 stammen waren 4.071/7.910 (51%) ORFs core, met 6.778 SNVs over het core genoom van deze isolaten, opnieuw consistent met eerdere globale studies van ST131 diversiteit23, 24 (Figuur S1). De accessoire genomen waren zeer concordant voor sommige (b.v. ecol_356/ecol_276/ecol_875), maar niet alle (b.v. ecol_AZ159/ecol_244) isolaten die nauw verwant waren in hun kerngenoom, wat een zeer variabele evolutionaire dynamiek tussen kern- en accessoire genomen ondersteunt (Fig. 1). De geografische spreiding van isolaten die nauw verwant zijn in zowel de kern- als de accessoire genomen, ondersteunt lokale (bv. ecol_AZ166, ecol_AZ167 ) transmissie van bepaalde KPC-E. coli-stammen. De homologie van de genetische flankerende motieven rond de bla KPC-genen in deze nauw verwante isolatenparen zou ook consistent zijn met deze hypothese, en minder consistent met meervoudige verwerving van bla KPC binnen dezelfde genetische achtergrond, vooral gezien de diversiteit in bla KPC-flankerende sequenties die in de rest van de dataset is waargenomen (zie hieronder).

Phylogenie van KPC-Escherichia coli die zijn geïdentificeerd in wereldwijde bewakingsprogramma’s voor carbapenemresistentie, 2008-2013. De panelen rechts van de fylogenie geven gemeenschappelijke resistentiegen-mechanismen weer (volledige details van de resistentie-gen-typering in tabel S2) en kern- en hulpgenoomcomponenten. Voor het accessoire genoompaneel geeft blauw geannoteerde gebieden weer die aanwezig zijn, en wit die welke afwezig zijn.

bla KPC-genen lijken momenteel beperkt tot plasmidecontexten in E. coli, maar kunnen bestaan in meervoudige kopieën op enkele plasmidestructuren of in plasmiden met een hoog kopiegetal

Vierendertig isolaten (80%) bevatten bla KPC-2, en negen isolaten (20%) bla KPC-3. Chromosomale integratie van bla KPC is beschreven in andere Enterobacteriaceae, Pseudomonas en Acinetobacter spp. maar blijft zeldzaam5, 29, 30. Er was geen bewijs van chromosomale integratie van bla KPC in de 18 chromosomale structuren gereconstrueerd uit long-read sequencing, of op basis van herziening van de annotaties in de bla KPC-bevattende contigs (afgeleid van Illumina de novo assemblies) voor de andere 25 isolaten. De schatting van het aantal bla KPC-kopieën per bacterieel chromosoom varieerde van <1 (ecol_879, ecol_881) tot 55 (ecol_AZ152). In negen gevallen was deze schatting ≥10 kopieën van bla KPC per bacterieel chromosoom (ecol_276, ecol_356, ecol_867, ecol_869, ecol_870, ecol_875, ecol_AZ150, ecol_AZ152, ecol_AZ159, Tabel S2). Zes van deze isolaten bevatten bla KPC in een col-achtige plasmide context, in twee gevallen was het plasmide rep type onbekend, en in één geval was het een IncN replicon. Plasmidekopiegetal wordt geassocieerd met hogere niveaus van antibioticumresistentie als het relevante gen zich op een hoge kopie-eenheid bevindt. Interessant is dat wordt verondersteld dat plasmiden met een hoog kopiegetal een grotere kans hebben om zich in nakomelingscellen te fixeren, aangezien zij zich beter door toeval en zonder de noodzaak van partitioneringssystemen verdelen31 , en om bij elke conjugatie direct of indirect te worden overgedragen32,33,34.

bla KPC- en niet-bla KPC-plasmidepopulaties in wereldwijde KPC-E. coli-stammen zijn uiterst divers

Plasmide Inc-typering onthulde de aanwezigheid van een mediaan van vier plasmide replicontypen per isolaat (bereik: 1-6; IQR: 3-5), die een grote diversiteit vertegenwoordigen (tabel 1). IncN-, col-, IncFIA- en IncI1-replicons waren echter onevenredig oververtegenwoordigd in bepaalde ST’s (p < 0,05; tabel 1). Onder de 18 isolaten die PacBio sequencing ondergingen, identificeerden we 53 gesloten, niet-bla KPC plasmiden, variërend van 1.459 bp tot 289.903 bp (Tabel S1; minstens vier bijkomende, gedeeltelijk volledige plasmidestructuren waren aanwezig). Van deze niet-bla KPC plasmiden hadden er 10 (grootte: 2.571-150.994 bp) <70% overeenkomst (gedefinieerd door de procentuele sequentie-identiteit vermenigvuldigd met het deel van de query-lengte dat homologie aantoont) met andere sequenties beschikbaar in GenBank, wat aantoont dat een deel van het “plasmidoom” in KPC-E. coli nog onvolledig gekarakteriseerd is. Voor de andere 43 plasmiden was de top-match in GenBank een plasmide van E. coli in 35 gevallen, K. pneumoniae in 5 gevallen, en Citrobacter freundii, Shigella sonnei, Salmonella enterica in elk 1 geval (Tabel S3).

Tweeëntwintig bla KPC plasmide structuren werden volledig opgelost (17 van alleen Pacbio-gegevens, vier van alleen Illumina-gegevens, 1 van zowel PacBio- als Illumina-gegevens), variërend van 14.029 bp tot 287.067 bp (mediaan = 55.590 bp; IQR: 23.499-82.765 bp). Deze bla KPC-bevattende plasmiden, en zes bijkomende gevallen waar bla KPC geïdentificeerd werd op een replicon-bevattende contig, waren zeer divers gebaseerd op Inc-typering (Tabel S1). IncN was het meest voorkomende type (n = 8/28 typeerbare bla KPC-structuren; 29%), gevolgd door kleine, col-achtige plasmiden (n = 6/28 ; 21%). Andere minder vaak voorkomende typen waren: A/C2, FII(k), U (alle n = 2); en L/M, P, Q1 en R (alle n = 1). Vier (14%) bla KPC plasmiden waren multi-replicon constructen, namelijk: col/repA, FIB/FII, FIA/FII, en FIA/FII/R.

Gemeenschappelijke IncN plasmide backbones hebben zich wereldwijd verspreid binnen E. coli

Uit GenBank selecteerden we alle unieke, volledig gesequencieerde IncN-bla KPC plasmide sequenties (Tabel S4) ter vergelijking, daterend van zo vroeg als 2005, rond de tijd van de eerste meldingen van KPC-producerende E. coli. De plasmide backbones en flankerende sequenties rond bla KPC in deze 16 plasmide referenties en een subset van 12 studie sequenties (zie “Methoden”) waren consistent met meervoudige acquisities van twee bekende IncN-Tn4401-bla KPC complexen in divergente E. coli STs: ten eerste, binnen een Plasmid-9 (FJ223607, 2005, USA)-achtige achtergrond, en ten tweede, binnen een Tn2/3-achtig element in een Plasmid-12 (FJ223605, 2005, USA)-achtige achtergrond.

In het eerste geval werden genetische overeenkomsten vastgesteld tussen Plasmid-9, pKPC-FCF/3SP, pKPC-FCF13/05, pCF8698, pKP1433 (die een hybride IncN vertegenwoordigt), en bla KPC plasmiden van isolaten ecol_516, ecol_517, ecol_656, en ecol_736 (deze studie). Plasmide-9 bevat dubbele Tn4401b elementen in omgekeerde oriëntatie met vier verschillende 5 bp flankerende sequenties in een atypische rangschikking binnen een groep II intron35. De backbone-structuren van de andere plasmiden in deze groep zijn consistent met een afzonderlijke acquisitie van een Tn4401b element tussen de pld en traG regio’s binnen een voorouderlijke versie van de Plasmid-9 structuur, met de generatie van een flankerende TTCAG target site duplicatie (TSD) (gelabeld als Plasmid 9-like plasmid (hypothetisch), Fig. 2). Internationale verspreiding gevolgd door lokale evolutie zowel binnen als tussen soorten zou de verschillen tussen plasmiden verklaren, waaronder: (i) variatie op nucleotideniveau (waargenomen in alle plasmiden); (ii) kleine insertie/deletie gebeurtenissen (waargenomen in alle plasmiden); (iii) grotere insertie/deletie gebeurtenissen gemedieerd door transponeerbare elementen (b.v. pCF8698_KPC_2); en (iv) waarschijnlijk homologe recombinatie, resulterend in geclusterde variatie binnen een vergelijkbare plasmide ruggengraat (b.v. ecol_656/ecol_736), alsook meer uitgesproken herschikkingen, met inbegrip van de vorming van “hybride” plasmiden (bv. pKP1433) (fig. 2).

Vergelijkend schema van FJ223607-achtige (Plasmid 9-achtige) IncN-plasmiden (publiek beschikbaar; deze studie), en hun geografische herkomst/isolatiedata. Plasmide sequentie namen in rood zijn die van deze studie, afgeleid van PacBio data en gesloten (ecol_517, ecol_656) of onvolledige plasmide structuren (ecol_516, ecol_736) afgeleid van Illumina data. Uitgelijnde balken naast plasmide namen vertegenwoordigen plasmide sequenties: licht grijs geeft regio’s met 100% sequentie identiteit; zwart staat voor nucleotide diversiteit tussen sequenties, en dunne lijnen vertegenwoordigen indels. Coderende sequenties worden voorgesteld door vette pijlen onder individuele sequentiebalken en zijn kleurgecodeerd volgens de kleurensleutel. Het inset-schema dat de genetische variatie tussen sequenties beschrijft, toont voorbeelden van evolutionaire gebeurtenissen die zijn geïdentificeerd: (a) verandering op één nucleotideniveau, (b) kleine indels (≤100 bp), (c) grote indels (>100 bp), (d) recombinatiegebeurtenissen.

In plasmide-12 (FJ223605) is Tn4401b ingevoegd in een hybride Tn2-Tn3-achtig element (met geassocieerde genen voor geneesmiddelenresistentie, waaronder bla TEM-1, bla OXA-9, en verscheidene genen voor aminoglycoside-resistentie), zij het zonder duplicatie van de doelsequentie, mogelijk als gevolg van een intra-moleculaire, replicatieve transpositiegebeurtenis die tot verkeerd gematchte doelsequenties heeft geleid (L TSS = TATTA; R TSS = GTTCT). Dit complex bevindt zich op zijn beurt tussen twee IS15DIV (IS15Δ)/IS26-achtige elementen, geflankeerd door 8 bp inverted repeats, en bevindt zich tussen de traI (891 bp van het 3′ einde) en pld loci (~28 Kb; Fig. 3A). De backbone-componenten van het IncN-plasmide-12 komen overeen met die welke werden waargenomen in een NIH-uitbraak5 en in een herschikte versie in een uitbraak van de Universiteit van Virginia (CAV1043; 2008)6. Uit deze studie blijkt dat de plasmiden van ecol_224, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_422, en de scaffolds van ecol_AZ151, ecol_744, ecol_AZ150 alle vrijwel identieke structuren hebben als Plasmid-12, met geclusterde nucleotidenniveau variatie in de traJ-traI genen, consistent met een homologe recombinatie gebeurtenis die deze regio beïnvloedt, en bewijs van sporadische insertie/deletie gebeurtenissen (Fig. 3A). De bla KPC-Tn4401 structuren in deze isolaten worden echter bijna volledig afgebroken door de aanwezigheid van andere mobiele genetische elementen (MGE’s), waaronder Tn2/Tn3-achtige elementen, ISKpn8/27 en Tn1721. In ecol_224 is bla KPC-2 in de IncN-backbone ingevoegd als onderdeel van twee herhalende, omgekeerde Tn3-achtige structuren, geflankeerd door een TTGCT TSD, en dichter bij traI (136 bp van het 3′-uiteinde) dan het eerder genoemde IS15DIV (IS15Δ)/IS26-achtig complex in Plasmid-12 (Fig. 3B). Hoewel het gezien de beschikbare gegevens niet mogelijk is de evolutionaire geschiedenis van deze genomische regio nauwkeurig te traceren, suggereert de aanwezigheid van gedeelde kenmerken van deze structuur in ecol_422, ecol_744, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_AZ150 en ecol_AZ151 een gemeenschappelijke verwerving en meervoudige daaropvolgende herschikkingen die worden bemiddeld door de aanwezigheid van het grote aantal MGE’s die bla KPC-2 flankeren.

Vergelijkingsschema van FJ223605-achtige (Plasmid-12-achtige) IncN KPC-plasmiden uit deze studie. Paneel 3A. Geografische oorsprong, data van isolatie en algemene uitlijning van plasmide/contig-structuren. Plasmide sequentie namen in rood zijn die van deze studie, afgeleid van PacBio data en gesloten (ecol_224, ecol_422, ecol_881, ecol_AZ159) of onvolledige plasmide structuren (ecol_744, ecol_AZ151, ecol_AZ150) afgeleid van Illumina data. Uitgelijnde balken naast plasmide namen vertegenwoordigen plasmide sequenties: licht grijs geeft regio’s met 100% sequentie homologie; zwart staat voor nucleotide diversiteit tussen sequenties, en dunne lijnen vertegenwoordigen indels. Coderende sequenties worden voorgesteld door vette pijlen onder individuele sequentiebalken en zijn kleurgecodeerd volgens de kleurensleutel. Het inset-schema dat de genetische variatie tussen sequenties beschrijft, toont voorbeelden van evolutionaire gebeurtenissen die zijn geïdentificeerd: (a) enkele nucleotide niveau verandering, (b) kleine indels (≤100 bp), (c) grote indels (>100 bp), (d) recombinatie gebeurtenissen. Paneel 3B. Close-up van de regio tussen traI en pld die bla KPC-2 bevat in alleen de studie-isolaten. Coderende sequenties zijn met kleur gecodeerd zoals in Fig. 3A; sequentiegebieden waarnaar in de tekst wordt verwezen, zijn geannoteerd.

Col-achtige plasmiden kunnen een belangrijke vector van overdracht voor bla KPC in E. coli

Kleine col-achtige plasmiden waren het op één na meest voorkomende type plasmide dat bla KPC in E. coli droeg (n = 5 ), maar drie daarvan waren identiek (bla KPC-2, 16.559 bp), alle geïsoleerd in Pittsburgh, VS, uit ST131-isolaten over een periode van twee jaar (ecol_276 , ecol_356 , ecol_875 ). Deze drie isolaten bevatten bovendien FIA, FIB, FII, X3 en X4 replicons, wat wijst op stabiele persistentie van een klonale stam + plasmiden in de loop van de tijd, consistent met zowel SNV/kern- als accessoire genoomanalyses (Fig. 1, Figuur S1).

De andere twee col-achtige plasmiden vertegenwoordigen effectief korte stukken DNA die coderen voor verschillende mobilisatiegenen (mbeA/mbeC/mbeD) die zijn gekoppeld aan Tn4401/bla KPC-modules. De 5 bp sequenties die Tn4401 flankeren waren consistent met directe, intermoleculaire transpositie in beide gevallen (ecol_870: TGTTT-TGTTT; ecol_867: TGTGA-TGTGA). Een col/repA co-integraat plasmide werd ook waargenomen in deze dataset (ecol_AZ161), waarin Tn4401b werd ingevoegd tussen colE3 signatuursequenties en een Tn3 element (Tn4401 TSS: AGATA-GTTCT). De vorming van dergelijke geco-integreerde plasmide structuren in E. coli is ook eerder beschreven36, waaronder die van een gefuseerde col/pKpQIL-achtige plasmidestructuur (pKpQIL wordt historisch in verband gebracht met bla KPC)37.

Col-achtige plasmiden zijn in verband gebracht met KPC-producenten in andere kleinere, regionale studies21, 38. Van belang is dat is aangetoond dat deze kleine vectoren verantwoordelijk zijn voor de verspreiding tussen soorten van qnr-genen die fluorochinolonresistentie mediëren, zelfs bij afwezigheid van enige duidelijke antimicrobiële selectiedruk39. De significante associatie van col-achtige plasmiden met bepaalde ST’s van E. coli (voornamelijk ST131) in deze studie zou een verklaring kunnen zijn voor de onevenredige vertegenwoordiging van bla KPC in deze stamreeks.

Diverse Tn4401 5 bp target site sequenties (TSSs) ondersteunen hoge transposon mobiliteit

Volledige Tn4401 isovormen flankerend bla KPC-2 of bla KPC-3 werden waargenomen in slechts 24/43 (56%) isolaten, inclusief Tn4401a/a-achtige (n = 10; één isolaat met een contig-breuk stroomopwaarts van bla KPC), Tn4401b (n = 12), en Tn4401d (n = 2) varianten. Elf verschillende 5 bp target site sequence (TSS) paren werden geïdentificeerd, waarvan 7 (64%) niet werden waargenomen in een vergelijking plasmide gedownload van GenBank (Tabel S5). Tn4401a had drie verschillende 5 bp TSS’s, Tn4401b zeven, en Tn4401d één. De meeste vertegenwoordigd TSD’s, maar in drie gevallen verschillende 5 bp TSS’s waren flankerende Tn4401, consistent met zowel directe inter- en replicatieve intra-moleculaire transpositie events.

Van de volledige set van GenBank plasmiden en in vitro transpositie experimenten uitgevoerd door anderen, 30 verschillende soorten 5 bp TSS paren zijn gekarakteriseerd, zeven in de experimentele setting alleen40. De gedownloade plasmiden zijn afkomstig van een reeks soorten en tijdstippen (2005-2014), hoewel ze een ondervertegenwoordiging kunnen zijn van de bredere Tn4401 insertiesite-diversiteit als gevolg van biases in de bemonstering. Onze gegevens zouden echter consistent zijn met een significante mobiliteit van Tn4401 binnen E. coli na verwerving van diverse Tn4401 isovormen en/of vertegenwoordigen meerdere importgebeurtenissen in E. coli van andere soorten.

De traditionele associatie van bla KPC met Tn4401 is aanzienlijk uitgehold in KPC plasmiden in E. coli

Notably, in de andere 19/43 (44%) isolaten was de Tn4401 structuur afgebroken door vervanging door MGEs, waarvan slechts enkele eerder zijn beschreven41, 42. Twee isolaten hadden nieuwe Tn4401Δb structuren (upstream truncations door IS26 of IS26-ΔIS5075 ). Een Tn4401e-achtige structuur (255 bp deletie stroomopwaarts van bla KPC) was aanwezig in drie isolaten (ecol_227, ecol_316, ecol_583): deze werd verder gekarakteriseerd in één volledige PacBio-plasmide-assemblage (ecol_316) en vertegenwoordigde een herschikking op de plaats van het L TSS van het ISKpn7-element. In dit plasmide was een tweede, gedeeltelijk Tn4401 element aanwezig zonder bla KPC, wat consistent zou zijn met een onvolledige, replicatieve, intra-moleculaire transpositie gebeurtenis (GGGAA = L TSS en R TSS op de twee Tn4401b elementen, in omgekeerde oriëntatie). Andere motieven die bla KPC flankeren omvatten: hybride Tn2/Tn3-elementen-ISKpn8/27-bla KPC (n = 1; ecol_224); IS26-ΔtnpR(Tn3)-ISKpn8/27- bla KPC-ΔTn1721-IS26 (n = 5; ecol_AZ153-AZ155, ecol_AZ166, ecol_AZ167); ISApu2-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC- korC-klcA-ΔTn1721-IS26 (n = 1; ecol_542); IS26-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC-korC-IS26 (n = 1; ecol_545); hybride Tn2/Tn3-elementen + ΔblaTEM-bla KPC-ΔTn1721 (n = 2; ecol_744, ecol_422), Tn3-elementen-Δbla TEM-bla KPC- ΔTn1721 (n = 4; ecol_881, ecol_AZ151, ecol_AZ159, ecol_AZ150) en ΔTn3-Δ -ΔIS3000 (Tn3-achtig) (n = 1; ecol_AZ152). We konden de flankerende context van bla KPC in ecol_452 niet beoordelen vanwege beperkingen van de assemblage.

Deze schijnbare diversiteit in onafhankelijk verworven MGE’s rond het bla KPC-gen breidt de manier uit waarop bla KPC kan worden gemobiliseerd. Interessant is dat, zoals eerder waargenomen43, alle afgebroken Tn4401 sequenties in deze dataset geassocieerd waren met variabele stukken flankerende Tn2/3-achtige sequenties, wat suggereert dat de insertie van Tn4401 in een Tn2/Tn3-achtige context deze laatste in staat kan hebben gesteld om te fungeren als een hotspot voor de insertie van andere MGEs6. Een bijzondere bevinding is de associatie met IS26, dat in verband is gebracht met de verspreiding van verscheidene andere resistentiegenen in E. coli, waaronder CTX-M ESBL’s24, 44; dat in staat is de expressie van nauw met elkaar samenhangende resistentiegenen te verhogen45; dat deelneemt aan co-integratievorming en daardoor aan plasmideherschikking46; en dat het optreden van andere IS26-gemedieerde overdrachtgebeurtenissen in plasmiden waarin IS26 voorkomt, bevordert 46.