Om de grote evolutionaire afstand tussen de huidige vertebraten en de voorouderlijke chordaat met een niet-gedupliceerd genoom te overbruggen, reconstrueerden Sacerdot en collega’s eerst het voorouderlijke genoom van de amniote. Daartoe pasten zij eerst het AGORA-algoritme (Algorithm for Gene Order Reconstruction in Ancestors) toe dat zij eerder hadden ontwikkeld op de genorden, -oriëntaties en genbomen van 61 genomen van extraverte dieren uit de Ensembl-database. Deze omvatten 40 zoogdieren, 3 vogels, 2 reptielen, 1 amfibie, 8 teleosten, 1 coelacanth, 2 tunicates, 1 nematode en 1 vlieg. Helaas bevat Ensembl niet het genoom van een kraakbeenvis (b.v. de olifantshaai, Callorhinchus milii, een chimaera, die het langzaamst evoluerende gewervelde genoom heeft dat bekend is), of die van hemichordaten, echinodermen of cephalochordaten – ongewervelde deuterostomen waarvan de genomen niet het aanzienlijke genenverlies en de verdichting hebben ondergaan die kenmerkend zijn voor de genomen van de manteldieren.

Sacerdot et al. identificeerden vervolgens vermoedelijke ohnolog-genparen in dit voorouderlijke amniote-genoom en produceerden sets van Contiguous Ancestral Regions (CARs). Ohnologs zijn homologe genen binnen een soort die het resultaat zijn van WGDs. Tenslotte groepeerden zij deze CAR’s in een reeks van 51 die significant vielen in 17 groepen van vier, of tetrads; het verwachte resultaat van twee rondes van WGD. Om het patroon van chromosomale fusies en splitsingen tijdens de evolutie te onderscheiden, wilden zij deze 17 tetrads vergelijken met de organisatie van genen in een niet-verdubbeld pre-vertebratengenoom. De genomen van de manteldieren evolueren echter zeer snel en wijken sterk af van die van andere ongewervelde deuterostomen, terwijl de gepubliceerde genoom-analyse van de cephalochordaat Branchiostoma floridae te gefragmenteerd is voor de analyse. Daarom vergeleken de auteurs hun 17 tetrads van CARs met de 17 voorouderlijke chordate linkage groepen die eerder waren vastgesteld door vergelijking van de syntenie van genen op menselijke chromosomen en op scaffolds van het B. floridae genoom. Opmerkelijk is dat elk van deze chordate linkage groepen correleerde met één predominant CAR tetrad. Zij concludeerden uit deze vergelijking dat het genoom van de voorouderlijke gewervelde 17 chromosomen had, die zich vervolgens verdubbelden tot 34 chromosomen door één ronde van WGD (1R). Vervolgens waren er 7 chromosoomfusies die resulteerden in 27 chromosomen, die bij de oorsprong van de vertebraten, vóór de splitsing agnathan/gnathosoom, opnieuw werden gedupliceerd (2R WGD) tot 54 chromosomen. Na de 2R WGD waren er nog vier fusies vóór de voorouderlijke benige vertebraten, gevolgd door een vijfde fusie vóór de basis van de amniotes. Aldus omvatte het voorouderlijke karyotype van de gewervelde beenderen 50 chromosomen en had de voorouderlijke amniote 49 chromosomen (Fig. 1b).

Naast het reconstrueren van duplicaties, fusies en splitsingen van chromosomen tijdens de evolutie, kan het AGORA-algoritme de genvolgorde op de chromosomen van de hypothetische amniote voorouder berekenen door de genvolgorde op de chromosomen van zijn nog levende afstammelingen te vergelijken. Dit gereconstrueerde voorouderlijke amniotegenoom bevat 80% van de 15.854 genen in de CARs. De ongelijke verdeling van deze genen over de 49 chromosomen van de voorouderlijke amniote zou een weerspiegeling kunnen zijn van de werkelijkheid of van de moeilijkheid om de genvolgorde te reconstrueren op chromosomen die tijdens de evolutie een aanzienlijke genherschikking hebben ondergaan.

Evenwel vallen twee dingen op in de analyse. Het eerste is dat vergelijking van het voorouderlijke amniote genoom met de CARs gegroepeerd in 17 tetrads met de super-scaffolds van de lamprei (Petromyzon marinus) genoom-assemblage een duidelijk 1-op-vier patroon laat zien dat consistent is met 2R WGD vóór de agnathan/gnathostome splitsing. Dit is in tegenspraak met de resultaten van Smith et al. die sterke aanwijzingen vonden voor slechts 1R WGD bij de lamprei in vergelijking met de kip. Deze discrepantie zou kunnen worden verklaard doordat bij de reconstructie van het hypothetische voorouderlijke genoom van de amniote ook genoomgegevens van meer soorten zijn gebruikt, een proces dat op zich ook verwarrende genoomherschikkingen elimineert die zich na de amniote voorouder in de gewervelde dieren hebben voorgedaan. Het is waarschijnlijk ook te danken aan de opname van fylogenetische gegevens om de CAR tetrads te bepalen, waardoor ohnologs worden onthuld die divergeerden aan de basis van de evolutie van de vertebraten.

Het tweede resultaat dat opvalt is de overeenkomst tussen de genvolgorde op menselijke chromosomen en de 17 pre-1R chromosomen. Wanneer de 17 pre-1R chromosomen van een kleurcode worden voorzien (Fig. 1b) en de kleuren van elk gen worden overgebracht naar de posities van de 8282 menselijke genen die van de pre-1R genen afstammen, wordt het patroon van genoomduplicaties en translocaties duidelijk. Zo bevat chromosoom 1 in het pre-1R-genoom bijvoorbeeld Hox-genen. Een groot segment van menselijk chromosoom 2 bevat de HoxD-cluster plus vele andere genen die overeenkomen met die op pre-1R-chromosoom 1. De andere 3 menselijke Hox-clusters bevinden zich op de menselijke chromosomen 7, 12 en 17. Bovendien bevindt een aanzienlijk aantal homologe genen van andere genen op pre-1R-chromosoom 1 zich op de menselijke chromosomen 1, 3, 10, 16 en 22, wat wijst op translocaties.