Study design and participants

We voerden een prospectief diagnostisch nauwkeurigheidsonderzoek uit van Ultra op zowel FNA- als lymfeklierkernnaaldbiopsieweefsel bij patiënten met verdenking op tuberculosis adenitis. De studie werd uitgevoerd in het Groote Schuur Ziekenhuis, een academisch centrum voor tertiaire verwijzingen in Kaapstad, Zuid-Afrika. In aanmerking komende studiedeelnemers waren volwassenen (≥18 jaar), zowel in- als poliklinisch, verwezen met vergrote lymfeklieren van >20 mm in de breedste diameter, gelegen in de cervicale, axillaire of inguinale regio. Patiënten met tuberculosetherapie werden ingeschreven op voorwaarde dat deze therapie <1 maand was gegeven (subanalyses werden uitgevoerd bij patiënten met tuberculosetherapie <24 uur). Patiënten met contra-indicaties voor kernnaaldbiopsie (lage bloedplaatjes, andere coagulopathie en bloedingsrisico, klinisch onstabiel, plaats van biopsie onveilig) werden uitgesloten. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers. De Human Research Ethics Committee van de Faculty of Health Sciences, University of Cape Town, keurde de studie goed.

Patiënten kwamen van binnen Groote Schuur en van secundaire ziekenhuizen en dagklinieken in het verwijzingsgebied. Resultaten van voorafgaand tuberculose-onderzoek (sputum Xpert of tuberculosekweek van een willekeurige plaats binnen 3 maanden na verwijzing, of urine lipoarabinomannan (LAM)) werden geregistreerd. Details over HIV-status, tuberculosebehandeling en ART werden verkregen.

Gegevensverzameling

Demografische informatie, symptomen, symptoomduur, HIV-testresultaat, en andere uitgevoerde TB-onderzoeken werden bij de inschrijving geregistreerd. De prestatiestatus werd gegradeerd volgens de Eastern European Cooperative Group (ECOG) . De plaats van de biopsie werd genoteerd, samen met andere plaatsen van lymfadenopathie. De aanwezigheid en duur van constitutionele symptomen (hoest, gewichtsverlies, nachtelijk zweten) werden specifiek opgevraagd, evenals de duur dat de patiënt de lymfadenopathie had opgemerkt. Er werd bloed afgenomen voor een volledig bloedbeeld met differentieel, lactaatdehydrogenase en HIV-status en, indien positief, een CD4-telling en een virale belasting voor degenen die ART kregen.

Studieprocedures en monsterafname

FNA werd uitgevoerd met een 22G naald en 5 mL spuit; verdere studieprocedures werden bepaald door het volume van het verkregen aspiraatmonster, zoals getoond in Fig. 1. Een core-needle biopsie werd alleen uitgevoerd wanneer < 0,5 mL caseus materiaal werd verkregen door het aspiraat, vanwege het risico op het veroorzaken van een drainerende sinus. Aanvankelijk werd, wanneer bij een deelnemer zowel een FNA als een biopsie werd uitgevoerd, de Ultra alleen op het weefsel uitgevoerd, maar na 25 patiënten werd het protocol gewijzigd en werd de Ultra zowel op het FNA als op het weefsel bij dezelfde patiënt uitgevoerd. Wanneer een patiënt zowel een FNA als een kernnaaldbiopsie had, werd de TB-kweek alleen op het weefselmonster uitgevoerd. Voor de Ultra op het FNA werden de naald en de spuit gespoeld in een steriele container met 2 ml zoutoplossing. Een aan de lucht gedroogd uitstrijkje voor AFB’s werd aan het bed gemaakt van een tweede FNA. Voor de kweek van het FNA werd het aspiraat gericht gespoeld in mycobacteriumkweekmedium (Middlebrook 7H9 bouillonmedium). De kernnaaldbiopsie werd uitgevoerd met een geautomatiseerd biopsiepistool (BARD Magnum™, CR Bard Inc., Covington, GA, USA) met een 14G naald. Als de lymfeklier niet duidelijk palpabel was, werd de biopsie uitgevoerd onder echogeleiding. Twee of drie kernen werden in formaline opgestuurd voor histologie (10-15 mm lang), een extra kern werd met een steriel mesje in tweeën gesneden en opgestuurd voor kweek en Ultra, beide in 2 ml 0,9% zoutoplossing. Als alle uitgevoerde tests geen uitsluitsel gaven, onderging de patiënt een herhaalde kernnaaldbiopsie of een excisiebiopsie naar keuze van de behandelend arts.

Studieprocedures

Laboratoriumonderzoeken

FNA- en weefselspecimens werden binnen 2 uur na afname naar een gecentraliseerd laboratorium getransporteerd en door opgeleid laboratoriumpersoneel volgens gestandaardiseerde protocollen individueel verwerkt. Het aan het bed gemaakte uitstrijkje werd met Ziehl-Neelsen (ZN) onderzocht op AFB’s. Het door de kernnaaldbiopsie verkregen weefsel werd fijngemalen met stamper en mortier. Een klein deel werd op een objectglaasje uitgesmeerd en met een ZN-kleuring onderzocht op AFB’s. De mycobacteriële kweek werd uitgevoerd met een geautomatiseerd vloeibaar mycobacterieel kweeksysteem (BACTEC™ MGIT™ 960; Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA). Lymfeklieren worden beschouwd als een steriele locatie en er werd geen ontsmetting uitgevoerd voorafgaand aan de vloeistofbiopsie. Als de MGIT positief bleek, werd één druppel geïnoculeerd op 2% bloedagar en gedurende 24 uur geïncubeerd om te controleren op bacteriële groei. Als er geen bacteriegroei was, werd de MGIT gerapporteerd als positief voor mycobacterium, werd het monster ontsmet met natriumhydroxide (1%) en N-acety-L-cysteïne en werd vervolgens een nieuwe MGIT uitgevoerd. Positieve isolaten van kweekmedia werden geïdentificeerd door zuurvaste kleuring gevolgd door MRTBDRplus-testen (Hain LifeScience, Hehren, Duitsland) om de aanwezigheid van M. tuberculosis en de gevoeligheid voor rifampicine en isoniazid te bevestigen.

Voor de Ultra werd 1,4 mL specimenreagens toegevoegd aan 0,7 mL aspiraat of vergruisd weefselmonster. De resultaten werden gerapporteerd als: ongeldig (geen interne testcontrole gedetecteerd); niet gedetecteerd; of gedetecteerd (met semi-kwantificatie: spoor, zeer laag, laag, gemiddeld of hoog) en rifampicineresistentie (gedetecteerd, niet gedetecteerd, of onbepaald). Het personeel dat de Ultra uitvoerde was geblindeerd voor de klinische en andere microbiologische resultaten.

Histologische beoordeling werd uitgevoerd door een gekwalificeerde anatomische patholoog die geblindeerd was voor de resultaten van de ULTRA en geen toegang had tot de kweek, maar wel de resultaten van AFB’s op microscopie zou hebben kunnen zien. Als granulomen werden geïdentificeerd, werd een aparte ZN-kleuring uitgevoerd door de patholoog en werd een Periodiek zuur-Schiff (PAS)-kleuring uitgevoerd voor schimmels.

Casusdefinities en statistische analyse

We wezen deelnemers toe aan een van de drie diagnostische categorieën op basis van klinisch, histologisch en microbiologisch onderzoek. Definitieve tuberculose (kweek-positief op FNA/weefsel voor M. tuberculosis OF AFB’s geïdentificeerd op FNA/weefsel) Waarschijnlijke tuberculose (geen andere diagnose die lymfadenopathie zou verklaren met een of meer van: macroscopische caseatie op FNA/weefsel OF tuberculose microbiologisch bevestigd op een andere plaats dan de lymfeklier (bv. pulmonaal) OF granulomen op FNA/weefsel). De derde categorie was geen tuberculose (voldeed niet aan de criteria voor de andere twee categorieën). De ultra-diagnostische nauwkeurigheid werd ook afzonderlijk gerapporteerd met alleen een positieve kweek als referentiestandaard.

Sample size estimation in diagnostic accuracy studies depends on the prevalence of disease . We verwachtten een hoge prevalentie van tuberculose op basis van een pilotstudie die we uitvoerden van core-naald biopsie bij HIV-positieve patiënten, van wie 92% tuberculose lymfadenitis had , maar het aandeel patiënten met tuberculose in onze studie was lager dan verwacht (40%) in een pilotfase van onze studie. Op basis van de Cochrane meta-analyse schatten wij dat de sensitiviteit en specificiteit van Ultra beide ongeveer 90% zouden bedragen. Bij een prevalentie van tuberculose van 40% is een steekproefgrootte van 87 nodig voor 95% CI-breedtes van 10% en met een sensitiviteit en specificiteit van 90% . We hebben de steekproefgrootte opgeblazen tot 100 vanwege onzekerheden over de diagnostische nauwkeurigheid van Ultra.

We berekenden sensitiviteit, specificiteit, negatief voorspellende waarde (NPV), positief voorspellende waarde (PPV) en waarschijnlijkheidsratio’s door ware of fout-positieven en ware of fout-negatieven te definiëren tegen de samengestelde referentiestandaard van waarschijnlijke of definitieve tuberculose voor onze primaire analyse. Als secundaire analyses bepaalden wij ook de nauwkeurigheid van Ultra met alleen een mycobacteriële cultuur als referentiestandaard. De gegevens werden ingevoerd in een REDCap® database en geanalyseerd met het softwarepakket STATAv14 (StataCorp, College Station, Texas, VS). Klinische basiskenmerken werden vergeleken met behulp van de chi-kwadraat of Fisher’s exact test voor categorische variabelen en de Kruskal-Wallis test voor continue variabelen. Ongeldige tests (d.w.z. Ultra-error) telden wij als negatieve resultaten. Deze studie wordt gerapporteerd in overeenstemming met de Richtlijnen voor de Rapportage van Diagnostische Nauwkeurigheidsstudies .