Verschillende schimmels, zoals Agrocybe semiorbicularis, Auricularia auricula, Coriolus versicolor, Dichomitus squalens, Flammulina velupites, Hypholoma fasciculare, Pleurotus ostreatus, Phanerochaete velutina, en Stereum hirsutum hebben het vermogen aangetoond om verschillende herbiciden zoals atrazine, diuron, en terbutylazine met verschillende doeltreffendheden af te breken. Coriolus versicolor, Hypholoma fasciculare en Stereum hirsutum braken meer dan 86% van diuron, atrazine en terbutylazine af in 6 weken. Zij waren ook het meest actief in de productie van ligninolytische enzymen. Het vermogen van WRF om aromatische herbiciden, diuron, atrazine en terbutylazine af te breken, correleerde echter niet met hun ligninolytische activiteit, bepaald in de Poly R-478 ontkleuringsproef (die wordt gebruikt als indicator van ligninolytische activiteit). De mogelijke verklaring voor deze resultaten was het verschil in LME-patroon dat door schimmels in vloeibare culturen wordt geproduceerd. Interessant is dat bij veldproeven de meest effectieve stam S. hirsutum inactief was bij de afbraak van herbiciden en dat de andere stammen C. versicolor en H. fasciculare 30% van de afbraak van chloropyriphos in 6 weken lieten zien .

Witrotschimmels Phanerochaete chrysosporium en Trametes versicolor zetten tot 35-40% van diketonitril (een bodemtransformatieproduct van het herbicide isoxaflutol) om in een inactief benzoëzuuranaloog na 15 dagen onder stationaire omstandigheden op vloeibare media . Het niveau van ligninolytische enzymen, zoals laccases, geproduceerd tijdens fermentatie leek gecorreleerd te zijn met de afbraak van herbiciden, wat de rol van deze enzymen in afbraakprocessen bevestigt. De auteurs benadrukten echter dat zesvoudige inductie van de laccaseproductie via toevoeging van 2,5-xylidine niet leidde tot een significante toename van de splitsing van diketonitril.

Er werd aangetoond dat Coriolus hirsutus, Cerrena maxima, Coriolopsis fulvocinerea, en de gecultiveerde Coriolus hirsutus/Cerrena maxima atrazine kunnen afbreken onder waterteelt; de verwijdering van het herbicide bedroeg 77-91% na 40 dagen teelt. Het is interessant te vermelden dat verwaarloosbare hoeveelheden atrazine door het mycelium werden geabsorbeerd. De activiteit van laccase was vrij hoog, wat het vermoeden rechtvaardigt dat laccase bijdraagt tot de afbraak van atrazine door deze schimmels. Deze hypothese werd ondersteund door de studie van de afbraak van atrazine in aanwezigheid van laccase-inductoren (guayacol en syringaldezine) onder submerse teelt. De efficiëntie van de herbicide-afbraak was hoger in geïnduceerde culturen met 78-98% en het hoogste niveau van atrazine-verwijdering werd bereikt voor Coriolopsis fulvocinerea met gebruikmaking van guaiacol als inducer.

Hiratsuka et al. meldden dat Coriolus versicolor IFO 30340 30% van chloronitrofen (CNP) en 80% van nitrofen (NIP) afbrak na een kweek van 12 dagen onder stationaire omstandigheden op vloeibare media. De afbraaksnelheid van het herbicide was afhankelijk van de stikstofconcentratie in de media en was hoger onder stikstofarme omstandigheden, wat suggereert dat het lignine-afbraaksysteem verantwoordelijk was voor de afbraak van het herbicide. LiP, MnP, laccase en kweekfiltraat oxideerden echter geen herbiciden. Noch chloronitrofen, noch nitrofen werden geoxideerd door het laccase – redox-mediator systeem met behulp van HBT, dat een bekende laccase redox-mediator is. Uit deze resultaten kan worden geconcludeerd dat extracellulaire ligninolytische enzymen niet betrokken zijn bij de initiële stap van de afbraak van CNP of NIP door Coriolus versicolor IFO 30340. De sequentiële identificatie van producten die gevormd worden tijdens het metabolisme van CNP en zijn tussenproducten door C. versicolor stelde de auteurs in staat vier verschillende routes voor de afbraak van CNP voor te stellen: aromatische hydroxylering, oxidatieve dechlorering, reductieve dechlorering, en de reductie van de nitrogroep tot amine. Aangenomen werd dat de aromatische hydroxylering tot 2,4,6-trichloor-3-hydroxy-4′-nitrodifenylether en de oxidatieve dechlorering tot 2,4-dichloor-6-hydroxy-4′-nitrodifenylether werden gekatalyseerd door cytochroom P450-type enzym(en), omdat deze paden efficiënt werden uitgeschakeld door de exogene toevoeging van piperonylbutoxide, een P450-remmer. De omzetting van CNP in NIP door Coriolus versicolor IFO 30340 moet reductieve dechlorinatie zijn. Reductieve dechloreringsreacties waren betrokken bij de afbraak van pentachloorfenol door P. chrysosporium . CNP werd ook omgezet in 2,4,6-trichloor-4′-aminodifenylether door C. versicolor. De reductieve dechlorinatie- en nitroreductiereacties werden ook gevonden als initiële reacties bij de afbraak van CNP, die werden versterkt na toevoeging van de cytochroom P450-remmer. Aromatische hydroxylering en oxidatieve dechlorering werden ook waargenomen tijdens de schimmelomzetting van NIP; De gevormde producten werden echter niet geïdentificeerd – aangenomen werd dat het ging om 2,4-dichloor-3-hydroxy-4′-nitrodifenylether of 2,4-dichloor-6-hydroxy-4′-nitrodifenylether en 2-chloor-4-hydroxy-4′-nitrodifenylether of 2-hydroxy-4-chloor-4′-nitrodifenylether, respectievelijk. De schimmelconversie van NIP werd ook effectief geremd door piperonylbutoxide.

Op basis van het verkregen resultaat veronderstelden de auteurs dat cytochroom P450 een belangrijke rol speelde in het verlagen van het ionisatiepotentiaal van milieupersistente aromaten en in het leveren van geschikte substraten voor ligninolytische één-elektron oxiderende enzymen voor een effectieve afbraak. Wanneer difenylether, 4-chloordifenylether en 4-nitrodifenylether aan de schimmelcultuur werden toegevoegd, werden respectievelijk 4-hydroxydifenylether, 4-chloor-4′-hydroxydifenylether en 4-nitro-4′-hydroxydifenylether als de belangrijkste producten geïdentificeerd. 4-chloorfenol en 4-nitrofenol werden in spoorhoeveelheden gedetecteerd uit respectievelijk 4-chloordifenylether en 4-nitrodifenylether, maar de tegenhanger hydrochinon werd niet waargenomen. Deze gegevens suggereren dat de vorming van fenolproducten uit de A- of de B-ring van CNP via een andere weg zou kunnen verlopen, en dat de directe splitsing van de ether misschien niet heeft plaatsgevonden. Deze bevindingen leverden het bewijs dat schimmels herbiciden afbraken via verschillende routes, gebruikmakend van hun meervoudige metabolische systemen.

Ganoderma lucidum bleek resistent te zijn tegen de herbiciden diuron en bentazon : de bovengrenzen waren respectievelijk 80 µM en 20 mM. Deze bevinding kan worden verklaard door de hogere toxiciteit van de metabolieten gevormd tijdens de omzetting van diuron. Eerder werd gemeld dat sommige metabolieten die ontstaan bij de omzetting van diuron door schimmels zelfs toxischer kunnen zijn dan de oorspronkelijke stof. G. lucidum was in staat om 55% van diuron en 88% van bentazon efficiënt te verwijderen na een kweek van 10 dagen in vloeibare culturen. Zowel bentazon als diuron verbeterden sterk de productie van laccase door de schimmel door één van de twee laccase isovormen te induceren. Native PAGE analyse van de extracellulaire enzymen toonde aan dat de verbetering van de laccase activiteit als reactie op de herbiciden niet te wijten was aan de expressie van een nieuwe laccase, maar dat ze te wijten was aan de overproductie van een reeds bestaande isovorm in de niet-geïnduceerde culturen. Gelijkaardige resultaten werden bekomen met Trametes versicolor en Abortiporus biennis , waar hun constitutieve laccases overgeproduceerd werden in aanwezigheid van paraquat, een quaternaire stikstofherbicide. De elektroforetische analyse van de extracellulaire enzymen van G. lucidum toonde aan dat laccase1 het dominante enzym was onder niet-geïnduceerde omstandigheden. Interessant genoeg induceerden de herbiciden enkel de laccase2 isovorm terwijl laccase1 onderdrukt werd in deze culturen. Dergelijke resultaten suggereren dat laccase2 waarschijnlijk de isovorm is die intensiever betrokken is bij het afweersysteem van de schimmel, gezien het feit dat beide herbiciden de groei van de schimmel sterk remden. Deze waarnemingen tonen aan dat deze typen enzymen, althans gedeeltelijk, een belangrijke rol spelen bij de afbraak van verontreinigende stoffen onder in vivo omstandigheden.

De vergelijkende studie van de afbraak van het herbicide bentazon door Ganoderma lucidum in culturen in vloeibare en vaste toestand met maïskolf als substraat werd uitgevoerd. De schimmel was resistenter tegen het herbicide en efficiënter in de afbraak ervan in culturen in vaste toestand in vergelijking met culturen in vloeibare toestand: Respectievelijk 50 mM tegen 20 mM en 90% tegen 55%. De auteurs stelden twee, elkaar niet uitsluitende, mogelijke verklaringen voor: een lagere beschikbaarheid van herbicide door adsorptie aan het onoplosbare substraat maïskolf voor deze waarneming en de hogere activiteiten van zowel laccase als Mn-peroxidase in culturen in vaste toestand vergeleken met de vloeibare culturen, waar een hoge laccase-activiteit werd waargenomen. Er werden echter geen metabolietproducten gevonden in de gecombineerde waterige en methanolische extracten. De G. lucidum ruwe filtraten die laccase en Mn peroxidase bevatten, bleken bentazon in vitro af te breken. De experimenten met toevoeging van Mn2+, ABTS, Tween 80 en H2O2 aan ruwe filtraten toonden synergismen aan bij de afbraak van bentazon, wat suggereert dat zowel laccase als Mn-peroxidase betrokken waren bij de afbraak ervan. Het is bekend dat ABTS de oxidatie van niet-fenolische verbindingen van lignine bemiddelt en de aanwezigheid van onverzadigde vetzuren (Tween 80) verbetert het oxidatieproces gekatalyseerd door Mn-peroxidases en laccases als gevolg van de productie van lipide peroxyl- of alkoxylradicalen. Het hypothetische mechanisme van de afbraak van bentazon zou het volgende kunnen zijn Mn-peroxidase en laccase genereren lipide peroxyl- of alkoxylradicalen; in de aanwezigheid van deze radicalen oxideert Mn-peroxidase Mn2+ tot Mn3+, dat op zijn beurt bentazon oxideert, terwijl laccase ABTS gebruikt als redox-mediator voor de oxidatie van bentazon. Er werd echter geen afbraak van picloram door G. lucidum en Trametes sp. waargenomen in vloeibare culturen, misschien door de hoge substitutie van de aromatische ring. Dit herbicide verhoogde de productie van laccase door Trametes sp., terwijl de enzymproductie door G. lucidum werd onderdrukt. De auteurs veronderstelden dat de remming van de enzymproductie zou kunnen plaatsvinden op mRNA-niveau nadat picloram de cel is binnengedrongen of door wijziging van het enzym voor of na de secretie. De blootstelling van G. lucidum en Trametes sp. aan picloram onthulde een eigenaardig mechanisme van voorbijgaande bioaccumulatie van herbicide door beide schimmels.

De meest bestudeerde WRF is P. chrysosporium, waarvan werd aangetoond dat het een breed scala van herbiciden afbreekt onder verschillende omstandigheden. MCPA en bentazon werden door P. chrysosporium met respectievelijk 65% en 75% afgebroken in 20 dagen . P. chrysosporium breidde isoproturon af dat behoort tot de fenylurea groepen , atrazine , en ook diuron . Volgens de gegevens werd echter geen afbraak van atrazine waargenomen door deze schimmel in vloeibare culturen. De afbraakefficiëntie van P. chrysosporium was hoger in culturen in vaste toestand in vergelijking met die in vloeibare toestand. Er werden twee mechanismen voor de afbraak van herbiciden voorgesteld: de werking van ligninolytische enzymen en de werking van intracellulaire enzymen, in het bijzonder cytochroom P450. In , werd de afbraak van diuron door P. chrysosporium bestudeerd met inbegrip van de identificatie van de gevormde producten en de evaluatie van de rol van cytochroom P450. Twee bevindingen waren van groot belang: de aanzienlijke hoeveelheden diuron, DCPMU , en DCPU die in verse mycelia werden aangetroffen en de remming van de afbraak van diuron door ABT (1-aminobenzotriazol), een cytochroom P450 remmer. Deze resultaten bevestigden het intracellulaire mechanisme van de afbraak van dit herbicide dat resulteert in N-demethylering. Na 5 dagen waren de concentraties van DCPMU en DCPU echter hoger in de culturele filtraten dan in de mycelia-extracten, wat wijst op de mogelijke betrokkenheid van lignolytische enzymen bij de afbraak van deze metabolieten. Volgens da Silva Coelho-Moreira et al. , enzymatische ruwe extracten voorzien van combinaties van veratryl alcohol H2O2 en Mn2+ braken het herbicide niet af, het is mogelijk dat DCPMU en DCPU verder kunnen worden omgezet door MnP.

P. chrysosporium is ook in staat om atrazine, zijn omzettingsproduct en andere s-triazine herbiciden om te zetten. De eerste en belangrijkste stap in de afbraak van gechloreerde s-triazine door de schimmel was mono-N-dealkylering. Hydroxyatrazine was het belangrijkste afbraakproduct dat werd aangetroffen in met atrazine behandelde bodems en in vloeistofculturen. P. chrysosporium zette hydroxyatrazine actief om in een onbekende verbinding die zich ophoopte in het kweekmedium. Er werd vastgesteld dat de aanwezigheid van zowel alkylgroepen als chloor op de 2-positie noodzakelijk zijn voor de mono N-dealkylering van atrazine door P. chrysosporium. Bijgevolg zou de vorming van desethylhydroxyatrazine in vloeibare culturen het gevolg moeten zijn van hydrolyse van deethylatrazine. Experimenten met terbutylazine, atrazine en simazine laten ook zien dat de verwijdering van de ethylzijketen de voorkeursreactie is, en mogelijk afhangt van de massa van de tweede alkylgroep. Met andere woorden, verbindingen met een groep met een hoge massa, gekoppeld aan een aminosubstituent, zullen naar verwachting een hogere N-dealkylering ondergaan die de andere keten beïnvloedt. De symmetrische verbindingen propazine en simazine werden ook langzamer afgebroken dan atrazine. Noch LiP’s noch MnP’s zetten atrazine en de N-dealkyleringsmetabolieten om. Er werd aangetoond dat de N-alkylering van atrazine afnam in aanwezigheid van een cytochroom P450-remmer. Bovendien werd de afbraak van het herbicide ondersteund door mycelium. Daarom werd de betrokkenheid van cytochroom P450 bij de afbraak van atrazine verondersteld. Deze gegevens komen overeen met eerder gepubliceerd onderzoek naar de afbraak van atrazine door Pleurotus pulmonarius, waarbij enzymen als lipoxygenase, peroxidase en cytochroom P-450 betrokken waren. Mn2+, dat deze enzymen activeert, stimuleerde de omzetting van atrazine in N-gealkyleerde en propyl-gehydroxyleerde metabolieten, terwijl antioxidanten en remmers van lipoxygenase en peroxidase (nordihydroguaiaretic acid) evenals cytochroom P-450 (piperonylbutoxide) de afbraak onderdrukten.

Voor de analyse van de gegevens in tabel 2 werd de verdwijningssnelheid van het herbicide berekend als de verhouding tussen de verdwijning (%) en de duur van de afbraak (dagen), gevolgd door een berekening van de gemiddelde waarde voor elk herbicide (fig. 1). Rekening houdend met het effect van de kweekomstandigheden op de afbraak van herbiciden door schimmels, werden alleen gegevens over stationaire omstandigheden op vloeibare media op deze manier behandeld.

De verkregen resultaten komen goed overeen met de studie , waarin werd vastgesteld dat de aanwezigheid van alkylgroepen noodzakelijk is voor de afbraak van s-triazineherbiciden door P. chrysosporium via mono N-dealkylering. Bovendien lijkt het vermogen van WRF-schimmels om s-triazines af te breken toe te nemen naarmate de hoeveelheid precies vertakte alkylgroepen toeneemt. Gedetailleerde kwantitatieve structuur-degradatie studies moeten echter worden uitgevoerd om deze voorlopige observatie te bewijzen of te weerleggen. Een andere belangrijke conclusie is een duidelijk negatieve invloed van chloor in het herbicidemolecuul op de afbraaksnelheid, hetgeen blijkt uit de vergelijking van de afbraaksnelheid van nitrofeen (één chlooratoom) en clornitrofeen (drie chlooratomen) en de hoogste afbraaksnelheid van bentazon, het enige chloorloze herbicide in de gepresenteerde reeks (Fig. 1). De in Fig. 1 gepresenteerde gegevens tonen dan ook duidelijk de absolute noodzaak aan van verdere QSAR-studies. Samen met kennis over de belangrijkste enzymatische routes van herbicide afbraak, zal de laatste aanzienlijk verbeteren van de voorlopige beoordeling van de afbraak vermogen van WRF in relatie tot het herbicide van bekende structuur.

De tegenstrijdige gegevens over de deelname van ligninolytische enzymen in de herbicide afbraak en transformatie niet mogelijk hun precieze rol in deze processen vast te stellen. We hebben de gegevens over de efficiëntie van afzonderlijke ligninolytische enzymen, hun mengsels en enzymen – redox-bemiddelaarsystemen bij de afbraak van herbiciden in tabel 3 samengevat. Zoals te zien is, werd geen afbraak van diketonitril, diuron, atrazine, chloornitrofen, nitrofen, glyfosaat waargenomen voor ruwe extracten van MnP en LiP en gezuiverde enzymen uit P. chrysosporium, Trametes versicolor en Coriolus versicolor, zelfs niet in aanwezigheid van redox-mediatoren. MnP van P. chrysosporium degradeerde Irgarol 1081 echter tot 37% na 24 uur en LiP van P. chrysosporium degradeerde bentazon tot 100% na 4 uur. Bovendien werd bentazon effectief omgezet door laccase met catechol, laccase, en MnP ruwe extracten met redox-mediator ABTS, recombinant MnP . Analyse van de gegevens samengevat in tabel 3 leiden tot de conclusie dat MnP, laccase, en laccase – redox-mediator systemen zijn de meest efficiënte middelen voor de afbraak van een breed scala van herbiciden – diketonitril, glyfosaat, Pesticide Mix 34, chlooroxuron, atrazine, en dymron , echter met enkele uitzonderingen, namelijk, choronitrofen en nitrofen . Benadrukt moet worden dat de efficiëntie van laccase – redox-mediator systemen ten opzichte van verschillende herbiciden sterk afhangt van de gebruikte redox-mediator, die op zijn beurt afhangt van de mechanismen van oxidatie van de mediatoren door het enzym en de reactiviteit van de tussenproducten van de mediatoren.

Enzym	Herbicide	Redox-mediator	Reactieomstandigheden	Duur h	Verwijdering, %	Fungus	Ref.
Laag	Atrazine	Nee	25°C, pH 4.5	240	0	Coriolopsis fulvocinerea	Koroleva & Gorbatova (ongepubliceerde gegevens)
					0
		PF6,			0
		HBT			70
		Syringaldezine			0
	Bentazon	Catechol	25°C, pH 4.0	0.5	100	Polyporus pinsitus
	Chloronitrofen	Nee		0	Coriolus versicolor
		HBT		0
	Diketonitril (derivaat van isoxaflutool)	ABTS	pH 3.0		0.3-0.4 nmol /(h eenheid)	Trametes versicolor
	Dymron	Nee	37°C	24	0	Trametes versicolor
		ABTS	60°C	24	>90
		HBA			90
		MeHBA			90
		NNDS			>90
	Glyfosaat	Nee	pH 6.0, Mn2+ + H2O2 + Tween 80	24	90	Trametes versicolor
		Nee	pH 6.0, Mn2+ + Tween 80		90
	Nitrofen	Nee		0	Coriolus versicolor
		HBT		0
Laap, geïmmobiliseerd	Chloroxuron	Nee	30°C, pH 4.5	0.5	80	Trametes versicolor
		3-HAA		0.5	80
		HBT		0.3	100
		Syrinaldehyde		0.5	80
LiP	Atrazine	Nee	30°C, pH 5, veratrylalcohol + Mn2+ + H2O2	1	0	Phanerochaete chrysosporium
	Bentazon	Nee	pH 3.5, veratryl alcohol + H2O2	4	∼100	Phanerochaete chrysosporium
	Chloronitrofen	Nee		0	Coriolus versicolor
		No		0	Phanerochaete chrysosporium
	Glyfosaat	No	pH 3.0, veratryl alcohol + Mn2+ + H2O2 + Tween 80	24	0	Trametes versicolor
	Nitrofen	Nee		0	Coriolus versicolor
		Nee		0	Phanerochaete chrysosporium
MnP	Atrazine	Nee	30°C, pH 5, veratrylalcohol + Mn2+ + H2O2	1	0	Phanerochaete chrysosporium
	Bentazon	Nee	pH 4.5, Mn2+ + Tween 80	168	∼700	Aspergillus oryzae
	Chloronitrofen	Nee			0	Coriolus versicolor
	Glyfosaat	Nee	pH 4.5, Mn2+ + H2O2 + Tween 80	24	100	Nematoloma frowardii
		No	pH 4.5, Mn2+ + Tween 80		100
	Irgarol 1051	No	30°C, Mn2+ + glucose + glucose oxidase	24	37	Phanerochaete chrysosporium
	Nitrofen	No			0	Coriolus versicolor
	Pesticide Mix 34	No	35°C, pH 4.5, Mn2+ + H2O2 + Tween 80	144	20-100	Nematoloma frowardii
Lac+MnP	Bentazon	ABTS	Mn2+ + H2O2 + Tween 80	24	98	Ganoderma lucidum
LiP+MnP	Atrazine	No	39°C, veratrylalcohol + Mn2+ + H2O2	24	0	Phanerochaete chrysosporium
		Nee	30°C, pH 5, veratrylalcohol + Mn2+ + H2O2	1	0
	Diketonitril (derivaat van isoxaflutool)	Nee	30°C, pH 3 of 5, H2O2	12	0	Phanerochaete chrysosporium
		1-HBT			0
		3-HAA			0
		ABTS			0
	Diuron	Nee	pH 3.0, veratryl alcohol + Mn2+ + H2O2	24	0	Phanerochaete chrysosporium

Tabel 3.

Afbraak van herbiciden door ligninolytische enzymen geproduceerd door witrotschimmels

Irgarol 1051 – derivaat van s-triazine herbicide

3-HAA – 3-hydroxy-antranilzuur

1-HBT – 3-hydroxybenzotriazool

HBA – 4-hydroxybenzoëzuur

MeHBA – methyl-4-hydroxybenzoëzuur

NNDS – 1-nitroso-2-naphtol-3,6-disulfonzuur

Laccase iimmobilized – Laccase iimmobilized on an electrospun zein polyurethane nanofiber via cross-linking met glutaraldehyde

In de studie van atrazine degradatie met gezuiverde laccase uit Coriolopsis fulvocinerea, werd geen afbraak van het herbicide waargenomen (Koroleva & Gorbatova, ongepubliceerde gegevens). De screening van redox-mediatoren (syringaldezine, PF6, , HBT) toonde aan dat alleen HBT de daling van de atrazineconcentratie veroorzaakte in het systeem laccase-atrazine-redox-mediator. Een meer gedetailleerde studie van de componenten van het modelsysteem “atrazine/laccase/HBT” toonde aan dat HBT zelf direct reageerde met atrazine en andere chloorhoudende atrazinederivaten, zonder tussenkomst van laccase, en geen interactie had met de hydroxyderivaten van atrazine. Het is bekend dat HBT in waterige oplossing in ionische vorm kan overgaan. Daarom is gesuggereerd dat twee producten kunnen worden gevormd, beide bestaande uit HBT en atrazine, met de vorming van (-N-O-C-) bindingen op positie (2) van atrazine. Toevoeging van laccase aan een oplossing van HBT/Atr resulteerde in de vorming van verscheidene producten, waarvan er één een retentietijd had die overeenkwam met die van de HBT-Atr-verbinding. In enzymatische reacties werden twee andere producten gevormd met retentietijden van 15,3 min en 19,4 min, die werden geïdentificeerd als deethylatrazine (DEA) en de verbinding gevormd door de interactie van DEA en HBT. De toevoeging van een enzym leidde dus tot de vorming van nieuwe producten die verschilden van de producten die gevormd werden bij de reactie van HBT met atrazine. Het modelsysteem “atrazine/laccase/HBT” werd bestudeerd bij verschillende molaire verhoudingen van atrazine/mediator (9:1 tot 1:9) en bij twee verschillende concentraties enzym (0,02 μm en 1,0 μm). De hoogste omzetting van atrazine – tot 70% in 10 dagen – werd waargenomen bij een HBT/Atr-verhouding van 9/1 en een enzymconcentratie van 0,02 μm. Proton kernspinresonantie (1H-NMR) en HPLC-MS/MS maakten het mogelijk de productidentificatie in de modelsystemen “Atr/HBT” en “Atr/HBT/laccase” te bevestigen: de vorming van Atr-HBT in het “Atr/HBT”-systeem, en DEA en DEA-HBT in het “Atr/HBT/laccase”-systeem. Atr-HBT bestond in twee vormen: geprotoneerd (M.W. 315 g/mol) en gediprotoneerd (M.W. 316 g/mol). Bij de reactie “Atr/HBT/laccase” wordt DEA gevormd, alsmede geprotoneerde (M.W. 287 g/mol) en gediprotoneerde (M.W. 288 g/mol) vormen van het product DEA-HBT. Op basis van de gegevens die werden verkregen voor de vijf vastgestelde structuren van de producten, hebben wij het oxidatieschema van atrazine door het “laccase/HBT”-systeem voorgesteld (fig. 2), dat niet-enzymatische en enzymatische stadia omvat (fig. 3).

Tijdens de niet-enzymatische fase wordt een product gevormd dat bestaat uit atrazine en HBT. Aangezien de substraten en de producten in het “Atr/HBT”-systeem in evenwicht zijn, leidt de toevoeging van laccase aan de reactie tot de oxidatie van HBT en de vorming van HBT-radicaal. Het HBT-radicaal reageert met de Atr-HBT-verbinding en veroorzaakt de dissociatie van de (-NH-CH-)bindingen, wat leidt tot de vorming van DEA-HBT en ethylalcohol. DEA-HBT ontleedt op zijn beurt en vormt twee producten: DEA en HBT. Het vermogen van HBT om tautomere vormen te vormen en direct te reageren met atrazine suggereerde dat HBT in het reactiemengsel zou worden afgebroken. Volgens het voorgestelde schema werden bij de hydrolyse van DEA-HBT echter DEA en HBT gevormd. Dit kan een van de redenen zijn voor de effectiviteit van HBT als redox-mediator in het laccase – redox-mediator systeem.

Het grote potentieel van WRF en hun ligninolytische enzymen bij de omzetting van herbiciden is goed gedocumenteerd. Niettemin zijn de mechanismen van afbraak en de afbraakroutes voor veel herbiciden nog steeds niet onderzocht. Verdere studies zijn nodig om het mechanisme van herbicide afbraak door WRF en ligninolytische enzymen op te helderen en de gevormde metabolieten te identificeren.