De gemeten effecten van Wnt3a op de proliferatie van HEK293T-cellen zijn afhankelijk van de toegepaste assay
Abstract
De Wnt-signaleringsroute is in verband gebracht met vele essentiële celprocessen. Deze studie heeft tot doel de effecten van Wnt signalering op de proliferatie van gekweekte HEK293T cellen te onderzoeken. Cellen werden geïncubeerd met Wnt3a, en de activering van de Wnt signaalweg werd gevolgd door analyse van het niveau van het β-catenine eiwit en van de expressieniveaus van de doelgenen MYC en CCND1. Het niveau van β-catenine proteïne steeg tot vier maal. Terwijl de mRNA niveaus van c-Myc en cycline D1 licht stegen, stegen de eiwit niveaus tot een factor van 1.5. Opmerkelijk is dat MTT- en BrdU-tests verschillende resultaten lieten zien bij het meten van de proliferatiesnelheid van Wnt3a gestimuleerde HEK293T-cellen. In de BrdU assays kon een toename van de proliferatiesnelheid worden vastgesteld, die correleerde met de toegepaste Wnt3a concentratie. Daarentegen kon deze correlatie niet worden aangetoond in de MTT-tests. De MTT resultaten, die gebaseerd zijn op de mitochondriale activiteit, werden bevestigd door analyse van het succinaat dehydrogenase complex door immunofluorescentie en door western blotting. Al met al toont onze studie aan dat Wnt3a de proliferatie van HEK293 cellen activeert. Deze effecten kunnen worden gedetecteerd door het meten van DNA synthese in plaats van door het meten van veranderingen van mitochondriale activiteit.
1. Inleiding
Het is bekend dat de Wnt-signaalroute een sleutelrol speelt bij de regulering van celdifferentiatie, proliferatie, overleving en apoptose. Wnt eiwitten zijn een zeer geconserveerde familie van gesecreteerde lipide-gemodificeerde cysteïne-rijke glycoproteïnen die signaalcascades in de cel activeren door binding aan een lid van de Frizzled (Fz) familie van G-eiwit-gekoppelde receptoren op de extracellulaire matrix . Er zijn 19 leden van de vertebrate Wnts , die kunnen worden ingedeeld in twee hoofdklassen op basis van hun vermogen om cytosolisch β-catenine te stabiliseren: de canonieke en de niet-canonieke pathway . Recente werken hebben ook aangetoond dat bepaalde Wnt liganden, zoals Wnt5a, in staat zijn om meer dan slechts één Wnt signaalweg te activeren, zodat de strikt binaire classificatie meer en meer achterhaald is. Een slechte werking van de Wnt signaleringsroute is gerelateerd aan verschillende ziekten zoals osteoporose , ziekte van Crohn , ziekte van Alzheimer , schizofrenie , en vooral kanker .
Het ligand Wnt3a behoort tot de β-catenine afhankelijke (canonieke) Wnt signalering, die bindt aan frizzled transmembraanreceptoren. Vervolgens activeert het low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5) of LRP6 receptor complex cytoplasmatische disheveled proteïnen, die de inhibitie van glycogeensynthase kinase 3β (GSK-3β) teweegbrengen. Het protooncoproteïne β-catenine accumuleert in het cytoplasma als gevolg van de ontmanteling van het destructiecomplex dat wordt gevormd door adenomatosis polyposis coli (APC), AXIN, en GSK-3β. Aldus kan β-catenine naar de kern worden getranslokeerd waar het de transcriptie activeert van doelgenen die worden gemedieerd door de T-celspecifieke transcriptiefactor (TCF)/lymfoïd-enhancing factor (LEF) . Deze genen zijn verantwoordelijk voor de regulatie van essentiële fysiologische processen in embryonale en volwassen ontwikkeling zoals celproliferatie, differentiatie, morfogenese, en celadhesie .
Met de aanwijzing van proliferatie, is er een complexe wisselwerking tussen de canonieke Wnt signalering en de celcyclus. De Wnt/β-catenine signaleringsroute is belangrijk in het stimuleren van progressie van de G1-fase door het remmen van GSK-3β, die celcyclus-effectoren en groeiregulatoren reguleert.
Een direct doelwitgen van de Wnt/β-catenine signaleringsroute is het protooncogen MYC, dat werd geïdentificeerd als een Wnt-doelwit in dikke darmkankercellen. De transcriptieregelaar c-Myc controleert vele celfuncties, met name de regulering van de voortgang van de celcyclus. Het cycline D1 coderende gen CCND1 is ook een target gen van de Wnt/β-catenine pathway, dat werd beschreven in dikke darm kankercellen . Cycline D1 als activator van cycline afhankelijk kinase (cdk) 4 of cdk 6 stuurt de G1/S fase overgang aan.
Er zijn verschillende manieren om Wnt3a geïnduceerde cel proliferatie te meten. Een niet-radioactieve methode is een immunoassay gebaseerd op de incorporatie van 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU) in DNA om de DNA-synthese te bepalen, die correleert met de S-fase-overgang en dus met celproliferatie . Een andere methode maakt gebruik van de meting van de mitochondriale activiteit van levensvatbare cellen. Bij de MTT-test wordt door reductie van MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) een onoplosbaar blauw formazanproduct geproduceerd door mitochondriale dehydrogenases.
In deze studie hebben we de proliferatie van HEK293T-cellen onder invloed van Wnt3a liganden onderzocht door zowel de MTT- als de BrdU-test te gebruiken. Verder vergelijken we de resultaten van deze assays met de mitochondriale activiteit van met Wnt3a behandelde cellen zoals gemeten door immunokleuring van het elektronentransportketen-eiwit SDHA (succinate dehydrogenase complex subunit A).
2. Materialen en Methoden
2.1. Cellen en celkweek
De menselijke embryonale niercellen, HEK293T, werden gekweekt in Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (PAN Biotech, Aidenbach, Duitsland), 1% niet-essentiële aminozuren, en 1% penicilline / streptomycine (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) bij 37 ° C in 5% CO2.
2.2. Proliferatie Assays
MTT en BrdU assays werden uitgevoerd op 96-well platen. Tienduizend cellen werden gezaaid per putje en cellen werden gestimuleerd met escalerende doses Wnt3a (R3534>D Systems, Minneapolis, USA), namelijk 0, 10, 50, 100, 150 en 200 ng / ml, gedurende 24, 48 en 72 uur. MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) werd opgelost in PBS bij 5 mg / ml en 20 ul MTT-oplossing werd toegevoegd aan elk putje, gevolgd door een incubatie van drie uur bij 37 ° C in 5% CO 2. Het medium met MTT werd vervolgens weggespoeld en 200 μL DMSO werd toegevoegd. Om de kristallen op te lossen, werden de cellen gedurende 15 min bij kamertemperatuur geschud. De platen werden afgelezen met een ELISA-lezer (Tecan Group Ltd., Männedorf, Zwitserland) bij 590 nm. Voor de BrdU-bepaling werd een commerciële kit “Cell Proliferation ELISA BrdU colorimetric” (Roche, Mannheim, Duitsland) gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Na toevoeging van de BrdU-labelingoplossing werden de cellen gedurende drie uur geïncubeerd bij 37°C in 5% CO2. Na de laatste wasstap werd 100 μL substraatoplossing per putje aan de cellen toegevoegd en de reactie werd na 15 min incubatie bij kamertemperatuur gestopt met zwavelzuur. De platen werden onmiddellijk afgelezen met een ELISA-lezer bij 450 nm. Alle bepalingen werden in drievoud uitgevoerd (). Voor kalibratie werden cellen in verschillende aantallen gezaaid (0,1 × 104 tot 3 × 104).
2.3. Immunocytochemie en fluorescentiemicroscopie
HEK293T-cellen werden uitgezaaid in 24-wellsplaten en behandeld met 0-200 ng/mL Wnt3a bij een confluentie van 30% en gefixeerd in 4% formaldehyde na 24, 48 en 72 uur. SDHA-antilichaam (Abcam, Cambridge, UK) in een verdunning van 1 : 200 werd toegevoegd en de cellen werden gedurende een uur geïncubeerd. Celkernen werden gedurende 5 min. tegengekleurd met DAPI. De cellen werden geanalyseerd via fluorescentiemicroscopie (Observer. Z1 van Zeiss, Jena, Duitsland) en de bijbehorende software AxioVision 4.7.
2.4. Eiwit Gel Elektroforese en Western Blot
Met behulp van de Bradford-Assay werden eiwitconcentraties in hele-cellelysaten bepaald. Gelijke eiwithoeveelheden werden geladen op SDS-polyacrylamide gels (NuPAGE, 4-12%, Life Technologies, Carlsbad, USA). De gels werden gedurende 1 uur bij 150 V uitgevoerd en via het iBlot System (Life Technologies) op nitrocellulosemembranen overgebracht. De membranen werden geanalyseerd met primaire antilichamen tegen SDHA, β-catenine, c-Myc, cycline D1 en β-actine (Cell Signaling, Cambridge, UK), verdunning 1 : 1000 in TBS-Tween met 3% melk, gevolgd door incubatie met een geschikt mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam (verdunning 1 : 2000). Eiwitbanden werden gevisualiseerd met ECL-detectie.
2.5. RNA Isolatie en RT-PCR
Totaal RNA werd geïsoleerd met NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland) en 1 ug RNA werd omgekeerd getranscribeerd met Verso cDNA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland) in een volume van 40 pi. De sequenties van de primers (MWG, München, Duitsland) die zijn gebruikt voor semikwantitatieve reverse transcriptase PCR zijn voor GAPDH 5′-catggtgctgagatttgccaac-3′ (forward) en 5′-tcaaccttgaccttctcatcac-3′ (reverse), voor MYC 5′-ccgagcaaggacgcgactctc-3′ (vooruit) en 5′-gcctttcagagaagcgggtcct-3′ (achteruit), en voor CCND1 5′-gcctgaacctgaggagcccca-3′ (vooruit) en 5′-gtcacacttgatcctgg-3′ (achteruit). De PCR amplificatie werd uitgevoerd met My Taq Red Mix (Bioline, Luckenwalde, Duitsland) volgens het protocol van de fabrikant. De reactie werd uitgevoerd met voorafgaande denaturatie gedurende 2 min bij 94°C, gevolgd door 30 cycli van denaturatie bij 94°C gedurende 1 min, annealing bij 55°C (CCND1), 57°C (GAPDH), of 60°C (MYC) gedurende 30 sec, en extensie bij 72°C gedurende 1 min. De laatste extensiestap duurde 10 min bij 72°C. De PCR-producten werden geanalyseerd door elektroforese op een 1,5% agarose gel. Gegevensanalyse
Microsoft Excel-software werd gebruikt voor gegevensbeheer, met inbegrip van de berekening van standaardafwijkingen. Western blots en agarose gels werden gescand met het geldocumentatiesysteem Quantum ST4 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Duitsland). De banden werden gekwantificeerd met behulp van ImageJ software (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, USA).
3. Resultaten
3.1. Effecten van Wnt3a op Inductie van β-Catenine en Typische Wnt Target Genen
Om activering van de Wnt pathway aan te tonen, detecteerden we de hoeveelheid β-catenine eiwitconcentratie in HEK293T cellen na behandeling met Wnt3a (figuur 1). Na 24 uur behandeling steeg de β-catenine eiwitconcentratie met toenemende concentraties van Wnt3a. De hoogste β-catenine eiwitconcentratie werd geïdentificeerd op 24 uur met een concentratie van 200 ng/mL Wnt3a. Hier toonde de kwantificering een viervoudige toename ten opzichte van de controle. Op de tijdstippen 48 en 72 uur na de behandeling is het effect van β-catenine-inductie niet meer duidelijk herkenbaar. Verder analyseerden we de regulatie van de Wnt doelgenen CCND1 en MYC na behandeling met Wnt3a zowel door semikwantitatieve RT-PCR als door Western blot (Figuren 2 en 3). Een basaal niveau van c-Myc en cycline D1 werd gedetecteerd in onbehandelde cellen. De resultaten van RT-PCR toonden marginale veranderingen in de hoeveelheid MYC cDNA en een inductie van CCND1 na 24 en 48 uur met 10 ng/mL Wnt3a, alsook na 72 uur met een concentratie van 100-200 ng/mL Wnt3a. Een licht verhoogd eiwitniveau van c-Myc werd waargenomen met een concentratie van 50 ng/mL na 24 uur. De western blot kwantificatie van cycline D1 toonde een toename met een factor 1,5 bij een Wnt3a concentratie van 50 tot 200 ng/mL na 24 uur. Het eiwitgehalte van c-Myc steeg op dezelfde manier met de concentratie van 50 ng/mL Wnt3a na 24 uur.
3.2. Cell Proliferation Assays
Om de effecten van Wnt-eiwitten op de celgroei te bestuderen, werden HEK293T-cellen gedurende 24 uur gekweekt in 96-wells-platen voordat ze werden behandeld met Wnt3a-eiwitconcentraties van respectievelijk 0, 10, 50, 100, 150 of 200 ng/mL. Na 24, 48 en 72 uur incubatie werden MTT- en BrdU-tests uitgevoerd. De BrdU-assays vertonen een duidelijke trend; met toenemende concentraties van Wnt3a nam de bijbehorende uitlezing toe (figuur 4(a)), waarbij Wnt3a de hoogste groeisnelheid aangeeft na 48 uur en een concentratie van 200 ng/mL.
(a)
(b)
(a)
(b)
In tegenstelling tot de BrdU-assays vertoonden de MTT-assays geen correlatie tussen Wnt-concentraties en celaantallen. Celaantallen bleven allemaal ongeveer gelijk of namen af in vergelijking met hun relevante controles (zie figuur 4(b)).
3.3. Mitochondriale Activiteit
Om de rol van Wnt3a met betrekking tot de mitochondriale activiteit in HEK293T cellen verder te onderbouwen, werden de hoeveelheden SDHA-eiwit bepaald door middel van Western blot en door middel van immunocytochemische analyse. Succinaatdehydrogenase (SDH) met zijn subeenheid SDHA is een sleutelcomponent van de citroenzuurcyclus, die betrokken is bij complex II van de mitochondriale elektronentransportketen en die verantwoordelijk is voor de overdracht van elektronen van succinaat naar ubiquinon. Cellen werden op dezelfde wijze behandeld voor proliferatie-analyse-experimenten en geïncubeerd met SDHA-antilichaam zoals hierboven beschreven. De resultaten (figuur 5) toonden een toenemend fluorescentiesignaal en ook een intenser signaal op de Western blot ten opzichte van de controle na 24 uur behandeling met Wnt3a. Na 48 uur vertoonde het eiwitgehalte, geregistreerd door immunofluorescentiemicroscopie of door Western blot analyse, geen significante verandering. Na 72 uur Wnt3a behandeling werd zelfs een afnemend signaal waargenomen in beide experimenten. Het hoogste signaal werd gemeten na 24 uur met 50 ng/mL Wnt3a.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4. Discussie
Wnt-eiwitten zijn betrokken bij diverse cellulaire functies, waaronder de regulering van genexpressie voor celcyclus en proliferatie. Wnt3a is bekend als een promotor van proliferatie en migratie van menselijke lens epitheelcellen , ook voor de proliferatie van fibroblasten of als een regulator van de proliferatie van pancreatische NIT-1 beta-cellen . MYC en CCND1 zijn doelgenen van de Wnt signaleringsroute in zoogdiercellen. Zo hebben Yoon et al. aangetoond dat Wnt signalering mitochondriale biogenese activeert door een grootschalige RNAi screen uit te voeren; zij identificeerden genen die de mitochondriale functie beïnvloeden, waaronder MYC.
In dit werk bepaalden wij de effecten van Wnt3a op de proliferatie van HEK293T cellen. Hiervoor hebben wij twee belangrijke assays toegepast, die algemeen worden gebruikt voor de analyse van de proliferatiesnelheid van gekweekte cellen, namelijk de MTT- en de BrdU-assay. Daarbij werden de specifieke effecten van Wnt liganden op DNA synthese en mitochondriale activiteit direct gedetecteerd en vergeleken.
Om ons systeem op te zetten en het effect van Wnt3a op de Wnt pathway in HEK293T cellen aan te tonen, toonden we de inductie van β-catenine aan na 24 uur Wnt3a behandeling en analyseerden we de expressieniveaus van MYC en CCND1. Het niveau van beide doelgenen steeg ook na 24 uur Wnt3a blootstelling. C-Myc speelt een sleutelrol in de G1-fase progressie; het upreguleert cycline D1 en onderdrukt p21 en p27 . Cycline D1 bevordert op zijn beurt de fosforylering en inhibitie van het retinoblastoma (Rb) complex, dat op zijn beurt het cycline E niveau upreguleert. De verrijking van cycline E leidt tot de overgang van het G1/S-fase checkpoint.
Tijdens de G1-fase moeten mitochondriën een grote hoeveelheid energie leveren. Deze oxidatieve fase wordt gevolgd door een reductieve periode tijdens de S-/G2-/M-fase van de celcyclus, waarin replicatie van DNA en proliferatie van mitochondriën plaatsvindt.
De proliferatiesnelheden van met Wnt3a behandelde HEK293T waren verschillend, gemeten met de twee in deze studie gebruikte assays. Wij verklaren het verschil door de verschillende detectiemechanismen van deze methoden. De MTT-test meet de activiteit van mitochondriën; de BrdU-test daarentegen detecteert de relatieve hoeveelheid nieuw gesynthetiseerd DNA. Wagner et al. verwijzen naar een zeer significant verband tussen BrdU en MTT in hun resultaten met de proliferatie van canine lymfocyten, hoewel de BrdU-test gevoeliger blijkt te zijn dan de MTT-test . Het schijnbaar negatieve effect van Wnt3a op het aantal cellen zou verklaard kunnen worden door een afname van de mitochondriale activiteit. De BrdU-test toonde echter een bevorderend effect op de DNA-synthese in deze cellen. De experimenten van de mitochondriale activiteit toonden aan dat pas na 24 uur Wnt3a behandeling het SDHA niveau verhoogd was. De activering met recombinant Wnt3a heeft waarschijnlijk geen effect meer op de mitochondriale activiteit na 48 uur of later. Dit in de tijd beperkte effect blijkt uit het afnemende signaal tijdens de MTT-test na 48 en 72 uur. Dit wordt ook bevestigd door de afnemende accumulatie van β-catenine door Wnt3a na 24 uur. Andere publicaties ondersteunen deze veronderstelling dat met Wnt3a behandelde cellen alleen gedurende een periode van 24 uur een verhoogd β-catenine niveau aangeven. Wij verklaren onze resultaten, die in strijd zijn met het gepubliceerde prolifererende effect van Wnt3a door het feit dat de meeste studies gebruik maakten van Wnt3a overgeëxpresseerde cellen, Wnt3a geconditioneerd medium, of serum-gesterfde cellen met recombinant Wnt eiwit voor activering Wnt/β-actine signaalweg.
In conclusie, de resultaten van BrdU en de MTT assays zijn nauwelijks vergelijkbaar bij het meten van de effecten van Wnt3a op de proliferatie snelheid van HEK293T cellen. Verschillen kunnen verklaard worden door hun verschillende aangrijpingspunten, namelijk de mitochondriale activiteit en de synthese van DNA. Om definitief uitsluitsel te geven over de celproliferatiesnelheid kan de interpretatie van de resultaten van één enkele methode misleidend zijn. Voor de evaluatie van de celproliferatie zou de directe telling van cellen met optische methoden het best de reële situatie weerspiegelen. Het zou interessant zijn om de overeenkomstige resultaten te vergelijken met de resultaten van biochemische testen zoals BrdU en MTT.
Conflict of Interests
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.
Acknowledgment
Dit werk werd financieel ondersteund door het Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF).