Algemene beschrijving

Gebruiksklare dCas9-VP64 lentivirale deeltjes maken onmiddellijke transductie van een breed scala van cellijnen mogelijk. dCas9-VP64 lentivirale deeltjes integreren efficiënt en stabiel dCas9-VP64 en blasticidin resistentie cassette gekoppeld door een 2A peptide en aangedreven door de EF1 alpha promoter (EF1a-dCas9-VP64-2A-Blasticidin) voor sterke expressie in zowel delende als niet-delende cellijnen. Zij zijn ideaal voor het vermijden van het vervelende lentivirusproductieproces en vormen één deel van een driedelig CRISPR-systeem met afzonderlijke dCas9-VP64. MS2-p65-HSF1 en gRNA expressie vectoren.
Om gRNA in elk formaat te bestellen, klik hier

Toepassing

Functionele genomica/doelwitvalidatie
– Onbevooroordeelde voorwaartse genetische screening
– Sterke transcriptionele activering in meerdere cellijnen
– Creatie van cellijnen die dCas9-VP64 stabiel tot expressie brengen.

Eigenschappen en voordelen

– Zeer specifiek en zeer actief
– Sequentiegecontroleerde, zeer zuivere lentivirale deeltjes met een hoge titer
– Activeert genen via transcriptionele activering in plaats van cDNA-gebaseerde overexpressie
Lees meer over SAM CRISPR Activators op SigmaAldrich.com/CRISPRa

Principe

CRISPR/Cas-systemen worden door bacteriën en archaea gebruikt als verdediging tegen binnendringende virussen en plasmiden. Onlangs is het type II CRISPR/Cas-systeem van de bacterie Streptococcus pyogenes gemanipuleerd om in eukaryote systemen te functioneren met behulp van twee moleculaire componenten: een enkel Cas9-eiwit en een niet-coderend gids-RNA (gRNA). Het Cas9-endonuclease kan inactief worden gemaakt (dCas9) door mutaties in de twee eiwitdomeinen, RuvC en HnH (respectievelijk D10A en H840A), die verantwoordelijk zijn voor de nuclease-activiteit. Het nuclease-gebrekkige eiwit kan vervolgens worden versmolten met de transcriptionele activator VP64 en worden gebruikt in combinatie met een gids-RNA dat is gemodificeerd met MS2 RNA-aptactameren die fungeren om de extra transcriptionele coactivatoren p65 en HSF1 aan te trekken. Het geassembleerde SAM-complex wordt dan gebruikt als een lading leveringssysteem naar doel gen promotors, waardoor plaats-specifieke transcriptionele activering van het gen van belang.

Eenheidsdefinitie

VP/mL is de meeteenheid voor virale titer geschat door p24 assay.